CN111068118B - 一种人工神经移植物及制备方法 - Google Patents

一种人工神经移植物及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明一种人工神经移植物的制备方法，包括：(1)取一定质量的可降解聚酯，溶于有机溶剂中，制得聚酯溶液；(2)将聚酯溶液转移至注射器中，并安置于注射泵上，进行静电纺丝加工得到神经套管；(3)制备去细胞基质消化液；(5)制备去细胞基质溶胶；(6)使用灌注设备在4℃环境下将去细胞基质溶胶灌注到神经套管中；(7)将灌注有去细胞基质溶胶的神经套管置于37℃环境下10～30分钟，使去细胞基质自组装发生溶胶‑凝胶转变，制得去细胞基质凝胶；(8)去细胞基质凝胶的定向冷冻结晶；(9)将定向冷冻结晶的去细胞基质凝胶的冻干，制得人工神经移植物。

Description

一种人工神经移植物及制备方法
技术领域
本发明涉及神经移植物技术领域，具体涉及一种人工神经移植物及制备方法。
背景技术
当发生缺损性周围神经损伤后，通常需要采用神经移植物对缺损的两端进行桥接对其进行修复。自体神经移植的效果最好，但是其面临供体不足和供体部位二次损伤的缺点，因此人工神经移植物的应用受到了重点关注。
目前临床上所使用的人工神经移植物主要分为两类：神经导管(包括套管、鞘管、膜等)和去细胞神经。其中前者主要是人工合成材料或胶原加工而成的中空的管状结构，其结构、组份与神经组织相距甚远，临床应用很有限(＜20mm以下缺损)。而后者则来自于人体残肢，经一系列脱细胞工艺去除免疫源性的所制备的同种异体移植物，其对于长段缺损的修复效果优于神经导管，但是其原料来源也限制了其在尺寸与功能上(感觉/运动)与移植目标的精确匹配。因此，开发一款功能优秀，产量较高且尺寸可精准匹配的人工神经移植物具有重要意义。
发明内容
本发明提供了一种人工神经移植物的制备方法，在成分和结构上对成分和结构上对天然神经进行模拟。去细胞基质及其所制备的水凝胶材料除了成分与天然神经极为接近，其纳米纤维的微结构也与天然神经相似。此外，采用特定的加工方法，引入与神经束相同的定向微通道结构将大大有利于该人工神经移植物的修复功能。
本发明一种人工神经移植物的制备方法，包括：
(1)取一定质量的可降解聚酯，溶于有机溶剂中，搅拌1～2天使其充分溶解，制得聚酯溶液；
(2)将聚酯溶液转移至注射器中，并安置于注射泵上，进行静电纺丝加工得到神经套管；
(3)静电纺丝加工结束之后，将神经套管裁剪为长度5～60mm；
(4)取一定质量去细胞基质粉末，加入pH为2的盐酸溶液中，其浓度为0.5％～2％w/v，加入胃蛋白酶，其与去细胞基质的质量比为1:10，25℃下搅拌8～48h，放入超高速离心机以温度4℃，转速10000～40000rpm超速离心30～60分钟，吸取上层溶液，制得去细胞基质消化液；
(5)使用0.1mol/L的NaOH溶液将去细胞基质消化液的pH调至8.0，加0.1mol/L的HCl溶液调pH至7.4，放置在4℃环境下备用，在4℃环境下加入10×PBS溶液，其体积为上述调节pH后的去细胞基质消化液体积的1/9，制得去细胞基质溶胶，在4℃环境下加入PBS溶液，将去细胞基质溶胶稀释至去细胞基质最终浓度0.2～1％w/v；
(6)使用灌注设备在4℃环境下将去细胞基质溶胶灌注到神经套管中；
(7)将灌注有去细胞基质溶胶的神经套管置于37℃环境下10～30分钟，使去细胞基质自组装发生溶胶-凝胶转变，制得去细胞基质凝胶；
(8)去细胞基质凝胶的定向冷冻结晶；
(9)将定向冷冻结晶的去细胞基质凝胶的冻干，制得人工神经移植物。
优选的，在上述人工神经移植物的制备方法的技术方案中，在步骤一中，可降解聚酯包括聚乳酸，聚乳酸-三亚甲基碳酸酯(P(LA-TMC))，聚乙醇酸，聚(D,L-乳酸-co-乙醇酸)，聚(D,L-乳酸-co-己内酯)，聚(D,L-乳酸-co-三亚甲基碳酸酯)，有机溶剂包括2,2,2-三氟乙醇，六氟异丙醇，氯仿，二氯甲烷。
优选的，在上述人工神经移植物的制备方法的技术方案中，在步骤二中，聚酯溶液的注射速率为0.5～4ml/h；注射器的注射针头内径为0.20～1.60mm，注射针头所接电压为5～20kv，其以2～5cm/s的速率进行左右往复扫描；接收器位于注射针头下方，为一个旋转的金属圆棒，其直径为0.5～10mm，旋转速率为60～500rpm，且其连接一个高压电源，电压为0～-3kv。
优选的，在上述人工神经移植物的制备方法的技术方案中，在步骤四中，去细胞基质的来源包括人、猪、牛等哺乳动物的脑、脊髓、神经、皮肤、小肠粘膜小层、脂肪不同组织。
优选的，在上述人工神经移植物的制备方法的技术方案中，在步骤八中，将灌注有去细胞基质凝胶的神经套管置入特氟龙管腔中，其中神经套管方向与特氟龙管腔方向一致，其下端与一个铜制导热装置接触，铜制导热装置的下端插入一个冷源装置中，冷源装置提供-196℃至-20℃的温度。去细胞基质中的液态水分子在冷源的定向传导作用下发生定向结晶，整个定向冷冻过程持续30～60分钟。
优选的，在上述人工神经移植物的制备方法的技术方案中，在步骤九中，将经定向冷冻结晶的去细胞基质及神经套管置于冻干机中冻干，其中冻干温度-60℃到0℃，冻干时间24～48h。最终制得人工神经移植物。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图
图1为静电纺丝加工神经导管示意图；
图2为定向冷冻结晶示意图；
图3为人工神经移植物扫描电镜图片(标尺100μm)；
图4为神经移植物去细胞基质填充物的横截面(A)与纵截面(B)图；
图5为神经移植物外套管截面图(标尺10μm)。
具体实施方式
本发明一种人工神经移植物的制备方法包括：
(1)聚酯溶液的制备
取一定质量的可降解聚酯，溶于有机溶剂中，搅拌1～2天使其充分溶解。
可降解聚酯包括聚乳酸，聚乳酸-三亚甲基碳酸酯(P(LA-TMC))，聚乙醇酸，聚(D,L-乳酸-co-乙醇酸)，聚(D,L-乳酸-co-己内酯)，聚(D,L-乳酸-co-三亚甲基碳酸酯)等。
有机溶剂包括2,2,2-三氟乙醇，六氟异丙醇，氯仿，二氯甲烷等。
(2)静电纺丝加工神经套管
按照图1方式，将上述聚酯溶液转移至注射器中，并安置于注射泵上，进行静电纺丝加工。
其中，溶液的注射速率为0.5～4ml/h；注射器的注射针头内径为0.20～1.60mm，注射针头所接电压为5～20kv，其以2～5cm/s的速率进行左右往复扫描；接收器位于注射针头下方，为一个旋转的金属圆棒，其直径为0.5～10mm，旋转速率为60～500rpm，且其连接一个高压电源，电压为0～-3kv。
(3)神经套管的处理
静电纺丝加工结束之后，将金属圆棒和所接收的材料置于真空干燥箱中，真空干燥24h后脱模，并裁剪为长度5～60mm的神经套管。
(4)去细胞基质消化液的制备
取一定质量去细胞基质粉末，加入pH为2的盐酸溶液中，其浓度为0.5％～2％w/v。加入胃蛋白酶，其与去细胞基质的质量比为1:10，25℃下搅拌8～48h，放入超高速离心机以温度4℃，转速10000～40000rpm超速离心30～60分钟，吸取上层溶液即去细胞基质消化液备用。
去细胞基质的来源包裹人、猪、牛等哺乳动物的脑、脊髓、神经、皮肤、小肠粘膜小层、脂肪等不同组织。
(5)去细胞基质溶胶的制备
使用0.1mol/L的NaOH溶液将去细胞基质消化液的pH调至8.0，加0.1mol/L的HCl溶液调pH至7.4，放置在4℃环境下备用。
在4℃环境下加入10×PBS溶液，其体积为上述调节pH后的去细胞基质消化液体积的1/9，制得去细胞基质溶胶。
在4℃环境下加入PBS溶液，将去细胞基质溶胶稀释至去细胞基质最终浓度0.2～1％w/v。
(6)去细胞基质溶胶的灌注
使用灌注设备在4℃环境下将上述去细胞基质溶胶灌注到静电纺丝加工出的神经套管中。
(7)去细胞基质凝胶的制备
将上述灌注有去细胞基质溶胶的神经套管置于37℃环境下10～30分钟使去细胞基质自组装发生溶胶-凝胶转变。
(8)去细胞基质凝胶的定向冷冻结晶
参照图2，将上述灌注有去细胞基质凝胶的神经套管1置入特氟龙管腔2中，其中神经套管方向与特氟龙管腔方向一致，其下端与一个铜制导热装置3接触，该铜制导热装置3的下端插入一个冷源装置4中，冷源装置4提供-196℃至-20℃的温度。去细胞基质中的液态水分子在冷源的定向传导作用下发生定向结晶，整个定向冷冻过程持续30～60分钟。
(9)去细胞基质凝胶的冻干
将上述经定向冷冻结晶的去细胞基质及神经套管置于冻干机中冻干，其中冻干温度-60℃到0℃，冻干时间24～48h。最终即可制得具有定向微通道结构的去细胞基质神经移植物。
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施案例一定向微通道去细胞基质(猪神经来源，pDNM)神经移植物的制备
按上述方法将P(LA-TMC)70/30溶于2,2,2-三氟乙醇中，浓度15％w/v；按上述步骤1～3对其进行静电纺丝加工，得到了制备了内径2mm，厚度0.25mm左右的神经套管。
将猪源性周围神经去细胞基质(pDNM)按上述步骤4～5将pDNM经消化、调pH，溶胶化制得pDNM溶胶；按上述步骤6～9将pDNM溶胶灌注入P(LA-TMC)70/30神经套管中，并利用液氮为冷源对其进行定向冷冻结晶，最终在-20℃下冻干得到人工神经移植物。
其扫描电镜图片见图3，该神经移植物由两部分组成，其中内层如图4所示，为具有直径在20-100μm范围的定向微通道的去细胞基质，外层如图5所示，则是较致密纳米纤维堆积而成的聚酯套管。
本发明引入了去细胞基质这一来源于天然动物组织的活性成分构建神经移植物，具有高生物功能性，去细胞基质的生物功能性极为优秀，其成分与天然组织接近，且具有促进神经轴突再生，髓鞘形成，血管化等功能。
该神经移植物由外套管和填充物两部分组成，双层结构的设计达到了神经导管力学性能需求与生物功能需求的同一，分别赋予优良的物理(力学)性能与生物功能，内填充物为去细胞基质水凝胶，由去细胞组织经粉碎、消化、重组形成，实现了去细胞组织(如去细胞神经)原料的高利用率；相对于去细胞神经修复材料，该神经移植物产量极大提高，且可以根据实际病例实现尺寸与功能的定制和精确匹配；其定向微通道结构与天然神经的神经束结构相似，可以定向引导神经轴突的快速再生；结构与成分高度仿生的填充物对于神经再生的促进能力相较于中空结构的神经导管大大提高，可以实现长段神经缺损的修复。外层的较致密多孔结构既允许物质的充分交换，又足以起到屏障作用，防止瘢痕的形成；其较强的力学性能使其具有可缝合性，又为神经的再生空间提供必要的支撑。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (5)

1.一种人工神经移植物的制备方法，其特征在于，包括：
(1)取一定质量的可降解聚酯，溶于有机溶剂中，搅拌1～2天使其充分溶解，制得聚酯溶液；
(2)将聚酯溶液转移至注射器中，并安置于注射泵上，进行静电纺丝加工得到神经套管；
(3)静电纺丝加工结束之后，将神经套管裁剪为长度5～60mm；
(4)取一定质量去细胞基质粉末，加入pH为2的盐酸溶液中，其浓度为0.5％～2％w/v，加入胃蛋白酶，其与去细胞基质的质量比为1:10，25℃下搅拌8～48h，放入超高速离心机以温度4℃，转速10000～40000rpm超速离心30～60分钟，吸取上层溶液，制得去细胞基质消化液；
(5)使用0.1mol/L的NaOH溶液将去细胞基质消化液的pH调至8.0，加0.1mol/L的HCl溶液调pH至7.4，放置在4℃环境下备用，在4℃环境下加入10×PBS溶液，其体积为上述调节pH后的去细胞基质消化液体积的1/9，制得去细胞基质溶胶，在4℃环境下加入PBS溶液，将去细胞基质溶胶稀释至去细胞基质最终浓度0.2～1％w/v；
(6)使用灌注设备在4℃环境下将去细胞基质溶胶灌注到神经套管中；
(7)将灌注有去细胞基质溶胶的神经套管置于37℃环境下10～30分钟，使去细胞基质自组装发生溶胶-凝胶转变，制得去细胞基质凝胶；
(8)去细胞基质凝胶的定向冷冻结晶，将灌注有去细胞基质凝胶的神经套管置入特氟龙管腔中，其中神经套管方向与特氟龙管腔方向一致，其下端与一个铜制导热装置接触，铜制导热装置的下端插入一个冷源装置中，冷源装置提供-196℃至-20℃的温度，去细胞基质中的液态水分子在冷源的定向传导作用下发生定向结晶，整个定向冷冻过程持续30～60分钟；
(9)将经定向冷冻结晶的去细胞基质及神经套管置于冻干机中冻干，其中冻干温度-60℃到0℃，冻干时间24～48h，最终制得人工神经移植物。
2.根据权利要求1所述的人工神经移植物的制备方法，其特征在于，在步骤一中，可降解聚酯包括聚乳酸，聚乳酸-三亚甲基碳酸酯(P(LA-TMC))，聚乙醇酸，聚(D,L-乳酸-co-乙醇酸)，聚(D,L-乳酸-co-己内酯)，聚(D,L-乳酸-co-三亚甲基碳酸酯)，有机溶剂包括2,2,2-三氟乙醇，六氟异丙醇，氯仿，二氯甲烷。
3.根据权利要求1所述的人工神经移植物的制备方法，其特征在于，在步骤二中，聚酯溶液的注射速率为0.5～4mL /h；注射器的注射针头内径为0.20～1.60mm，注射针头所接电压为5～20kV ，其以2～5cm/s的速率进行左右往复扫描；接收器位于注射针头下方，为一个旋转的金属圆棒，其直径为0.5～10mm，旋转速率为60～500rpm，且其连接一个高压电源，电压为0～-3kV 。
4.根据权利要求1所述的人工神经移植物的制备方法，其特征在于，在步骤四中，去细胞基质的来源包括人、猪、牛的脑、脊髓、皮肤、小肠粘膜下层、脂肪。
5.一种人工神经移植物，其特征在于，通过权利要求1-4任意一项所述的人工神经移植物的制备方法制备而成。
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