CN106729980A - 一种用于外周神经修复的仿生神经移植物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于外周神经修复的仿生神经移植物及其制备方法和应用，所述仿生神经移植物包括：壳聚糖薄膜导管和位于所述壳聚糖薄膜导管内的纤维蛋白水凝胶束，所述纤维蛋白水凝胶束由纤维蛋白通过静电纺丝技术制备而成。本发明制备的仿生神经移植物由壳聚糖薄膜导管和多级取向结构的纤维蛋白水凝胶束填充构成，其中壳聚糖膜有效支撑神经再生长入的空间，多级取向的纤维蛋白水凝胶束能够有效引导神经轴突的定向再生，整体材料的细胞亲和性和力学性能较佳，并且降解速度与外周神经组织的修复速度相匹配。

Description

一种用于外周神经修复的仿生神经移植物及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域，尤其涉及一种用于外周神经修复的仿生神经移植物及其制备方法。
背景技术
神经损伤后的修复是一系列复杂的病理过程，神经再生过程缓慢，疤痕组织的形成、抑制微环境的产生，运动终端组织、功能退化等因素均制约损伤神经的修复。小段神经的缺损可通过神经的自身修复能力自行恢复，长段缺损神经的修复和功能的重建依然是神经外科的临床难题，严重影响患者的健康状况和生活质量。
外科手术多采用神经断端吻合法和神经导管桥接法治疗受损神经的再生。对于小段神经损伤前者适用，常见疑难的神经损伤治疗均需要借助神经导管等材料促进神经的再生修复。这种神经导管的设计基于受损神经近端在再生过程中表现出的趋化性。
再生的神经纤维在延伸过程中能够识别并延伸至远端的空隙，新生的运动及感觉神经纤维可以经此长入远端对应的功能束最终到达靶器官，实现神经的修复甚至功能的恢复。目前相关的神经桥接材料多为神经导管，起到在神经的近远两端形成神经再生室的作用，提供神经纤维生长空隙。然而，这种神经导管因为结构和材料的限制导致修复效果不佳。这是因为，一方面，神经纤维的这种趋化作用在近远端距离超过10mm时会出现明显的减弱，相应的神经桥连材料也都在这个有效距离内起明显作用。另一方面，现有研究报道的神经导管多集中在以下材料中：天然的脱细胞基质导管如动脉、神经外膜管、小肠衣、羊膜等；合成的材料包括硅胶管、聚乳酸膜、聚羟基乙酸管等。其中天然的脱细胞基质导管的免疫原性风险高，临床感染的风险高。而合成材料虽然避免了上述问题，但是多为不溶于水的相对惰性材料，细胞亲和性差，降解速度慢，难以与神经组织的修复速度相匹配。
因此，有必要在神经导管的基础上，提供一种改进型的神经桥接材料，能够在提供神经再生长入空间的同时，有效引导神经轴突的定向再生，尤其是在近远端距离超过10mm时能够达到修复作用。同时，又能保障材料的细胞亲和性、力学性能及降解速度满足外周神经组织的修复需求。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，针对现有神经导管的修复效果不佳的缺陷，提供一种用于外周神经修复的仿生神经移植物及其制备方法，通过在壳聚糖薄膜导管内填充多级取向纤维蛋白水凝胶束来促进神经纤维定向生长。
本发明第一方面，提供了一种用于外周神经修复的仿生神经移植物，包括：
(1)壳聚糖薄膜导管；和
(2)位于所述壳聚糖薄膜导管内的纤维蛋白水凝胶束，所述纤维蛋白水凝胶束由纤维蛋白通过静电纺丝技术制备而成。
在根据本发明所述的用于外周神经修复的仿生神经移植物中，所述壳聚糖薄膜导管的壁厚为0.3-0.5mm。
在根据本发明所述的用于外周神经修复的仿生神经移植物中，所述纤维蛋白水凝胶束具有多级取向性结构，由纳米纤维丝束构成，所述纳米纤维丝束构成微米纤维丝束，再由微米纤维丝束构成宏观水凝胶束。
在根据本发明所述的用于外周神经修复的仿生神经移植物中，所述纳米纤维丝束的直径为100nm～500nm，所述微米纤维丝束的直径为10μm～100μm。
在根据本发明所述的用于外周神经修复的仿生神经移植物中，所述纤维蛋白水凝胶束中复合有一种或多种多糖，所述多糖选自由壳聚糖、透明质酸和海藻酸钠构成的组，且加入的多糖与所述纤维蛋白原的质量比为1:2～2:1。
在根据本发明所述的用于外周神经修复的仿生神经移植物中，所述纤维蛋白水凝胶束的直径为0.7-1.0mm。
本发明第二方面，提供了一种如前所述的用于外周神经修复的仿生神经移植物的制备方法，包括如下步骤：
步骤S1、壳聚糖薄膜导管的制备，具体包括：
步骤S1-1、将壳聚糖溶解于稀冰醋酸、盐酸中的任何一种，配制成壳聚糖的酸溶液，其中壳聚糖浓度为0.01-0.02g/ml；
步骤S1-2、将S1-1所得壳聚糖酸溶液盛取于平整面的玻璃培养皿中，常温常压通风干燥，待溶剂挥发，得到半干壳聚糖溶液；
步骤S1-3、将S1-2所得的半干壳聚糖溶液置于烘箱中干燥得到壳聚糖薄膜；
步骤S1-4、将得到的壳聚糖薄膜浸泡在纯水中洗涤待用；
步骤S2、纤维蛋白水凝胶束的制备，具体包括：
步骤S2-1、将纤维蛋白原溶解于纯水或者生理盐水中，与聚氧化乙烯水溶液或者聚氧化乙烯生理盐水溶液混合均匀，得到电纺原液，所述电纺原液中纤维蛋白原的质量分数为3％～6％，聚氧化乙烯的质量分数为1％～1.5％，将所述电纺原液注入注射器中待用；
步骤S2-2、将CaCl2水溶液与凝血酶溶液混合得到交联溶液并在37℃保温，所述交联溶液中CaCl2的质量分数为1％-5％，凝血酶的含量为10-50Units/ml，将所述交联溶液取于金属旋转接收盘中待用；
步骤S2-3、注入注射器的电纺原液在推进泵的作用下进行静电纺丝，调整纤维蛋白原的推注速度为1-3ml/h，加载电压3-5kV，使用金属旋转接收盘接收静电纺丝得到的纤维蛋白原纺丝，调整旋转接收速度为150-300r/h，所述纤维蛋白原纺丝在交联溶液的作用下得到纤维蛋白水凝胶束；
步骤S2-4、收集得到所需直径的纤维蛋白水凝胶束；
步骤S3、仿生神经移植物的制备，具体包括：将步骤1中所得壳聚糖薄膜包裹步骤2所得的纤维蛋白水凝胶束得到所述用于外周神经修复的仿生神经移植物。
在根据本发明所述的用于外周神经修复的仿生神经移植物的制备方法中，所述步骤S1-3中50℃～70℃烘箱中干燥36～48小时。
在根据本发明所述的用于外周神经修复的仿生神经移植物的制备方法中，所述步骤S2-1中所述电纺原液中纤维蛋白原的质量分数为4％～5％；聚氧化乙烯的质量分数为1.2％～1.5％。
在根据本发明所述的用于外周神经修复的仿生神经移植物的制备方法中，所述步骤S2-2中所述CaCl2的质量分数为2％-3％，凝血酶的含量为20-40Units/ml。
在根据本发明所述的用于外周神经修复的仿生神经移植物的制备方法中，所述步骤S2-1的电纺原液中加入一种或多种多糖，所述多糖与所述纤维蛋白原的质量比为1:2～2:1，所述多糖选自由壳聚糖、透明质酸和海藻酸钠构成的组，所述壳聚糖、透明质酸和海藻酸钠接枝甲基丙烯酰胺基团；所述步骤S2-2的交联溶液中加入质量分数为0.05～1％的光引发剂，并在步骤S2-3中旋转接收时，采用紫外光照10-30分钟。
本发明第三方面，提供了如前所述的用于外周神经修复的仿生神经移植物在外周神经修复中的应用。
本发明的上述技术方案具有如下有益效果：本发明制备的仿生神经移植物由壳聚糖薄膜导管和多级取向结构的纤维蛋白水凝胶束填充构成，其中壳聚糖膜有效支撑神经再生长入的空间，多级取向的纤维蛋白水凝胶束能够有效引导神经轴突的定向再生，该仿生神经移植物的细胞亲和性和力学性能好，并且降解速度与外周神经组织的修复速度相匹配。
附图说明
图1为根据本发明优选实施例的用于外周神经修复的仿生神经移植物的制备方法流程图；
图2为根据本发明实施例1制得的仿生神经移植物的实物照片图；
图3为对比例1中单纯壳聚糖导管的实物照片图；
图4为对比例2中纯纤维蛋白水凝胶实物照片图；
图5a-5d分别为根据本发明实施例1制得的仿生神经移植物中纤维蛋白水凝胶束的外形图及电镜图；
图6为实施例1制得的仿生神经移植物接种雪旺细胞后4小时的细胞染色结果图；
图7a-7d分别为实施例1和对比例1的材料在植入大鼠坐骨神经4周后的组织染色结果图；
图8a-8d分别为实施例1和对比例1的材料在植入大鼠坐骨神经6周后的细胞生长情况图；
图9a-9d分别为实施例1和对比例1的材料在植入大鼠坐骨神经12周后的细胞生长情况图。
图10为对比例1材料在植入大鼠坐骨神经12周后电生理肌电图信号；
图11为实施例1材料在植入大鼠坐骨神经12周后电生理肌电图信号。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例对技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种用于外周神经修复的仿生神经移植物，包括：
(1)壳聚糖薄膜导管；和
(2)位于壳聚糖薄膜导管内的纤维蛋白水凝胶束，所述纤维蛋白水凝胶束由纤维蛋白通过静电纺丝技术制备而成。
在本发明一些优选的实施方式中，纤维蛋白水凝胶束具有多级取向性结构，纤维尺寸从纳米级到微米级。该填充物纤维蛋白水凝胶束的结构由纳米纤维丝束构成，该纳米微米纤维丝束先构成微米纤维丝束，再由微米纤维丝束构成宏观水凝胶束。优选地，纳米纤维丝束的直径为100nm～500nm，微米纤维丝束的直径为10μm～100μm。最后制得的纤维蛋白水凝胶束的直径为0.7-1.0mm。
本发明的仿生神经移植物由壳聚糖薄膜导管和多级取向的纤维蛋白水凝胶束构成，该材料结合现有神经导管技术和填充与天然神经力学性能、结构相似的取向纤维蛋白水凝胶束材料，具有类似天然神经组织基质、力学性能及结构特点，有效促进受损神经定向再生。因此，本发明的仿生神经移植物弥补了现有神经导管材料的不足，能够有效促进神经损伤的再生修复，是一种具有神经修复应用前景的仿生神经移植物。
在本发明一些更优选的实施方式中，壳聚糖薄膜导管的壁厚为0.3-0.5mm。该仿生神经移植物的具体直径和长度可以根据手术需要的缺损神经的直径和长度来确定。优选地，仿生神经移植物的长度为1-2cm。
在本发明的另一些优选实施方式中，可选地，在纤维蛋白水凝胶束中复合一种或多种多糖，所述多糖选自由壳聚糖、透明质酸和海藻酸钠构成的组，且加入的多糖与所述纤维蛋白原的质量比为1:2～2:1。
请参阅图1，为根据本发明优选实施例的用于外周神经修复的仿生神经移植物的制备方法流程图。如图1所示，该实施例提供了上述用于外周神经修复的仿生神经移植物的制备方法，包括如下步骤：
步骤S1、壳聚糖薄膜导管的制备。优选地，壳聚糖薄膜导管通过溶剂蒸发法制备得到，具体包括：
步骤S1-1、将壳聚糖溶解于稀冰醋酸、盐酸中的任何一种，配制成壳聚糖的酸溶液，其中壳聚糖浓度为0.01-0.02g/ml(例如0.01、0.012、0.015、0.018或0.02g/ml)。优选地，该步骤中选用的冰醋酸的浓度为0.015g/ml，盐酸的浓度为0.01g/ml。所述壳聚糖优选为羧甲基壳聚糖。
步骤S1-2、将S1-1所得壳聚糖酸溶液盛取于平整面的玻璃培养皿中，常温常压通风干燥，待溶剂挥发，得到半干壳聚糖溶液。
步骤S1-3、将S1-2所得的半干壳聚糖溶液于烘箱中干燥得到壳聚糖薄膜。优选地，该步骤中将半干壳聚糖溶液置于50℃～70℃(例如50℃、55℃、60℃、65℃或70℃)烘箱中干燥36～48小时。
步骤S1-4、将得到的壳聚糖薄膜浸泡在纯水中充分洗涤，待用。
步骤S2、纤维蛋白水凝胶束的制备，具体包括：
步骤S2-1、将纤维蛋白原溶解于纯水或者生理盐水中，与聚氧化乙烯(PEO)水溶液或者聚氧化乙烯(PEO)生理盐水溶液混合均匀，得到电纺原液。该电纺原液中纤维蛋白原的质量分数为3％～6％(例如3％、4％、5％或6％)，聚氧化乙烯(PEO)的质量分数为1％～1.5％(例如1％、1.2％或1.5％)。随后将该电纺原液注入注射器中待用。优选地，该步骤中所述电纺原液中纤维蛋白原的质量分数为4％～5％(例如4％、4.3％、4.5％、4.8％、5％)，聚氧化乙烯(PEO)的质量分数为1.2％～1.5％(例如1.2％、1.3％、1.4％或1.5％)。
步骤S2-2、将CaCl2水溶液与凝血酶溶液混合得到交联溶液并在37℃保温待用。该交联溶液中CaCl2的质量分数为1％-5％(例如1％、2％、3％、4％或5％)，凝血酶的含量为10-50Units/ml(例如10、20、30、40或50Units/ml)。随后将该交联溶液取于金属旋转接收盘中待用。优选地，该步骤中CaCl2的质量分数为2％-3％(例如2％、2.3％、2.5％、2.8％或3％)，凝血酶的含量为20-40Units/ml(例如20、25、30、35或40Units/ml)。
步骤S2-3、注入注射器的电纺原液在推进泵的作用下进行静电纺丝，调整纤维蛋白原的推注速度为1-3ml/h(例如1、1.5、2、2.5或3ml/h)，加载电压3-5kV(例如3、3.5、4、4.5或5kV)，使其得到连续的稳定的纤维蛋白原纺丝。使用金属旋转接收盘接收静电纺丝得到的纤维蛋白原纺丝，调整旋转接收速度为150-300r/h(例如150、200、250、280或300r/h)，该纤维蛋白原纺丝在交联溶液的作用下得到多级取向的纤维蛋白水凝胶束。金属旋转接收盘的直径为20-50cm，接收距离为5-10cm。
步骤S2-4、收集得到所需直径的纤维蛋白水凝胶束。由于静电纺丝过程中产生的纳米级别的纤维蛋白原纺丝(例如直径为100nm～500nm)在落入金属旋转接受盘之后，在发生交联反应的同时，纳米微米纤维丝束会自动组装构成微米纤维丝束，再由微米纤维丝束自动组装构成宏观水凝胶束。因此，该步骤中可以通过手动缠绕使宏观的纤维蛋白水凝胶束自然贴合在一起，达到所需直径，并修剪至预定长度，得到最终的纤维蛋白水凝胶束；
步骤S3、仿生神经移植物的制备，具体包括：将步骤1中所得壳聚糖薄膜包裹步骤2所得的纤维蛋白水凝胶束得到所述用于外周神经修复的仿生神经移植物。该步骤中可以手动将壳聚糖薄膜围绕纤维蛋白水凝胶缠绕一周，形成外部的壳聚糖薄膜导管。优选地，还可以使用8-0显微缝线缝合外部的壳聚糖薄膜导管，防止在手术过程中或者术后愈合过程中与内部的纤维蛋白水凝胶束分离。壳聚糖薄膜导管的壁厚、外径和长度可以根据临床应用需要进行调整或者裁剪。
在本发明一些更优选的实施方式中，可选地，在步骤S2-1的电纺原液中加入一种或多种多糖，在电纺原液中多糖与纤维蛋白原的质量比为1:2～2:1。所述多糖选自由壳聚糖、透明质酸和海藻酸钠构成的组，且该壳聚糖、透明质酸或海藻酸钠通过接枝甲基丙烯酰胺基团使其具有365nm紫外光照原位交联作用。所述壳聚糖优选为羧甲基壳聚糖。相应地，在步骤S2-2的交联溶液中加入质量分数为0.05～1％的光引发剂，并在步骤S2-3中旋转接收时，采用紫外光照10-30分钟。通过该方式，可以构成具有蛋白多糖复合结构的纳米纤维复合水凝胶，一方面加入的多糖可提高溶胀性能为负载药物增添可能，另一方面多糖可以保护未受损神经细胞，降低继发性损伤。
本发明还提供了上述用于外周神经修复的仿生神经移植物在外周神经修复中的应用。外周神经系统是由遍布全身的神经组成的，主要分为三部分：①与脊髓相连的脊神经；②与脑相连的脑神经；③连于脑和脊髓，分布于平滑肌、心肌和腺体的内脏神经。本发明提供的仿生神经移植物可用于对这些外周神经进行修复，尤其是超过10mm的外周神经缺损，可以得到比神经导管更好地修复效果。
本发明的外周神经修复的仿生神经移植物至少在如下方面进行了改进并取得了相应的技术效果：
(1)本发明的仿生神经移植物不仅包含壳聚糖薄膜导管构成的“神经再生室”，同时包含“室内建筑结构”即多级取向结构的纤维蛋白水凝胶束。该多级取向结构模仿了天然神经组织的神经纤维、神经内膜内神经、神经束膜内神经组织等多级神经纤维结构，进而构建出具有仿生结构的神经移植物。该类似神经组织基质的多级取向结构，能够有效引导神经轴突的定向再生，尤其适用于长度超过10mm的缺损修复，例如10mm～20mm。
(2)本发明以纤维蛋白作为壳聚糖薄膜导管的内部填充物，与电纺生成的合成高分子类纤维相比，纤维蛋白水凝胶束具有较高含水量，是类似于细胞外基质的材料，且纤维蛋白作为水凝胶的主要成分，具有高分子类材料所不能比拟的细胞亲和性。并且该纤维蛋白水凝胶束通过单纯纤维蛋白电纺制备得到，得到的纤维蛋白纺丝结构是连续的，具有多级取向性结构，纤维尺寸从纳米级到微米级。
(3)由于单纯的纤维蛋白水凝胶束材质较软，力学强度不足以用作外周神经修复，因此本发明选取壳聚糖作为外膜材料，一方面具有较好的组织相容性，另一方面壳聚糖外膜可以支撑神经再生生长空间，提高整个仿生神经移植物的力学强度，使其具有与天然神经相似的力学性能。
(4)本发明选用的壳聚糖和纤维蛋白均为天然高分子物质，且壳聚糖薄膜导管能够随着神经组织的修复而逐渐降解，内部的纤维蛋白也会随着神经组织的长入迅速降解，两者的降解速度均与神经组织的修复速度相匹配。
(5)本发明中采用的壳聚糖薄膜导管的壁厚为0.3-0.5mm，能够对内部的纤维蛋白水凝胶束起到良好的支撑作用，且降解时间适中。如果壁厚较大则导致整体移植物过硬，也会延长壳聚糖薄膜的降解时间；如果壁厚较小则使得移植物的整体力学性能降低，并且材料降解速度过快，例如在神经组织未完全长入时便已降解，严重影响修复效果。
(6)本发明的制备方法中使用电纺原液中采用的纤维蛋白原的质量分数为3％～6％，并且其中聚氧化乙烯(PEO)的质量分数为1％～1.5％，上述两种物质的浓度是经过大量实验及经验总结得到的，只有在上述浓度范围内才能够成功地纺出直径为100nm～500nm的纳米纤维丝束，由此构成直径为10μm～100μm的微米纤维丝束，从而得到多级取向结构的纤维蛋白水凝胶束。如果纤维蛋白原的浓度过高，将导致纤维蛋白原不溶解，并且在混合后会产生沉淀，如果纤维蛋白原的浓度过低，将导致静电纺丝时间速率慢，得到所需直径的纤维蛋白水凝胶束的时间过长，结构不连续。如果PEO浓度太高，将导致溶液过于粘稠，无法纺出纤维蛋白原丝，如果PEO浓度过低，将导致溶液粘度不够，纺出的纤维蛋白原丝无法成形。
(7)本发明的制备方法中将CaCl2水溶液与凝血酶溶液混合配置交联溶液，其中CaCl2的质量分数为1％-5％，凝血酶的含量为10-50Units/ml，并且将交联溶液置于金属旋转接收盘中，可以在接收纤维蛋白原纺丝的同时进行交联，提高纤维蛋白的交联度。纤维蛋白原是一种由肝脏合成的具有凝血功能的蛋白质，是纤维蛋白的前体。纤维蛋白原由α、β、γ三对不同多肽链所组成，多肽链间以二硫键相连。在凝血酶作用下，α链与β链分别释放出A肽与B肽，生成纤维蛋白单体。在此过程中，由于释放了酸性多肽，负电性降低，单体易于聚合成纤维蛋白多聚体。但此时单体之间借氢键与疏水键相连，尚可溶于稀酸和尿素溶液中，进一步在Ca2+作用下，单体之间以共价键相连，则变成稳定的纤维蛋白水凝胶束。
(8)本发明的制备方法中使用的加载电压为3-5kV，推注速度为1-3ml/h，旋转接收速度为150-300r/h，上述参数相互作用，能够达到最好的纺丝效果。例如加载电压如果太高，不能形成稳定的泰勒锥，太低则不形成泰勒锥。并且旋转接收速度与推注速度相匹配，能够保障纺出的纤维蛋白原纺丝不发生团聚或者断裂。
(9)本发明可选地在纤维蛋白水凝胶中复合壳聚糖、透明质酸和海藻酸钠中的一种或多种，构成具有蛋白多糖复合结构的纳米纤维复合水凝胶，一方面加入的多糖可提高溶胀性能为负载药物增添可能，另一方面多糖可以保护未受损神经细胞，降低继发性损伤。
需要特别指出的是，本说明书的数值范围表示该数值范围的上限值、下限值以及处在该数值范围之内的任何数值或者子范围。因此，如果没有特别说明，在本说明书中涉及数值范围时就不再详细列举包含在该数值范围内的具体数值。
实施例1
1、将壳聚糖溶解于质量分数为2％的冰醋酸水溶液中，配制成壳聚糖的酸溶液，其中壳聚糖浓度为0.015g/ml。
2、将壳聚糖酸溶液盛取于平整面的玻璃培养皿中，常温常压通风干燥，待溶剂挥发，得到半干壳聚糖溶液。
3、将半干壳聚糖溶液置于60℃烘箱中干燥48小时。
4、将得到的壳聚糖薄膜浸泡在纯水中充分洗涤，待用。该壳聚糖薄膜的厚度为0.4mm。
5、将纤维蛋白原溶解于纯水中，与PEO水溶液混合均匀，得到电纺原液。该电纺原液中纤维蛋白原的质量分数为4％，PEO的质量分数为1.2％。随后将该电纺原液注入注射器中待用。
6、将CaCl2水溶液与凝血酶溶液混合得到交联溶液并在37℃保温待用。该交联溶液中CaCl2的质量分数为2％，凝血酶的含量为30Units/ml。随后将该交联溶液取于金属旋转接收盘中待用。
7、注入注射器的电纺原液在推进泵的作用下进行静电纺丝，调整纤维蛋白原的推注速度为2ml/h，加载电压4kV，使其得到连续的稳定的纤维蛋白原纺丝。使用金属旋转接收盘接收静电纺丝得到的纤维蛋白原纺丝，调整旋转接收速度为200r/h，该纤维蛋白原纺丝在交联溶液的作用下得到多级取向的纤维蛋白水凝胶束。
8、手动缠绕收集得到直径为0.8mm的纤维蛋白水凝胶束。
9、手动将步骤4制得的壳聚糖薄膜缠绕在步骤8所得的纤维蛋白水凝胶束上，得到用于外周神经修复的仿生神经移植物。
实施例2至23
除了下表1的内容之外，实施例2至23以与实施例1基本相同的方式进行。
实施例24
以与实施例1基本相同的方式实施，区别仅在于，在步骤5的电纺原液中加入接枝了甲基丙烯酰胺基团的壳聚糖，使得电纺原液中包含有质量分数为4％的纤维蛋白原，质量分数为4％的壳聚糖，以及质量分数为1.2％的PEO，其余为水。在步骤6的交联溶液中加入质量分数为0.05％的光引发剂I2959溶液，即2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮，并在步骤7中旋转接收时，采用紫外光照30分钟。
实施例25
以与实施例24基本相同的方式实施，区别仅在于，在步骤5的电纺原液中加入接枝了甲基丙烯酰胺基团的透明质酸，使得电纺原液中包含有质量分数为4％的纤维蛋白原，质量分数为8％的壳聚糖，以及质量分数为1.2％的PEO，其余为水。在步骤6的交联溶液中加入质量分数为1％的光引发剂I2959溶液，即2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮，并在步骤7中旋转接收时，采用紫外光照10分钟。
实施例26
以与实施例24基本相同的方式实施，区别仅在于，在步骤5的电纺原液中加入接枝了甲基丙烯酰胺基团的海藻酸钠，使得电纺原液中包含有质量分数为4％的纤维蛋白原，质量分数为2％的壳聚糖，以及质量分数为1.2％的PEO，其余为水。在步骤6的交联溶液中加入质量分数为0.1％的光引发剂I2959溶液，即2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮，并在步骤7中旋转接收时，采用紫外光照20分钟。
对比例1
以与实施例1基本相同的方式实施例，区别仅在于，仅制备壳聚糖薄膜导管作为对比例1的仿生神经移植物，未填充纤维蛋白水凝胶束。
对比例2
以与实施例1基本相同的方式实施例，区别仅在于，未包裹壳聚糖薄膜导管，将静电纺丝得到的纤维蛋白水凝胶束作为对比例2的仿生神经移植物。
对比例3
用电子天平秤取0.8g左旋聚乳酸一己内醋(PLLA-CL)[50:50]，溶解于10ml的六氟异丙醇中，利用磁力搅拌混合均一，得到浓度为8％(克/毫升)的纺丝溶液。对该溶液进行静电纺丝，静电纺丝工艺参数为：施加电压10kv，推进泵推进速度为1ml/h，接收距离为8cm，选用9号针头，聚四氟乙烯模具直径为4mm，磁性接收轴的转速为50rpm可得到直径为4mm轴向取向的P(LLA-CL)神经导管。
对比例4
(1)将PHBV与PLGA(50:50)以2:1的质量比溶于三氯甲烷中，配制质量分数为6％的聚合物溶液；搅拌至澄清无混浊，加入颗粒大小为300μm的NaCl为致孔剂，使NaCl的质量分数为10％；混合均匀后将聚合物溶液浇铸到内径为3mm，具有4通道的圆柱形模具中制取外层管状基材，浇铸过程重复多次；抽真空后取下模具，待溶剂挥发完全后用去离子水反复冲洗管状基材以去除致孔剂，最后真空干燥至恒温，得到高空隙率外层管状基材。该外层管状基材直径为3mm，具有4通道。
(2)将PHBV与壳聚糖以50:50的质量比溶于三氟乙酸中，配制5％的聚合物溶液，磁力搅拌至澄清无混浊；将共混溶液导入注射器中，在推进泵的推动下进行静电纺丝，电压为15kv，射流速度为1mL/h，接收距离为20cm，接收滚筒的转速为2500rpm将静电纺丝薄膜在直径为1mm的心轴模具上进行卷绕，卷成三维管状结构，制成神经导管的内部小管。
(3)将4根内部小管中植入到外层管状基材预留置的腔体内，并用丙烯酸醋为胶黏剂使其结构稳固。对所制得的神经导管用钻60照射消毒，最后包装。
实验结果
本发明通过电镜、细胞实验和动物实验等手段对各实施例和对比例制得的仿生神经移植物进行了评价。
(一)结构表征结果
请参阅图2，为根据本发明实施例1制得的仿生神经移植物的实物照片图。图3和图4分别为上述对比例1和2的实物照片图。如图所示，可以看到实施例1制得的用于外周神经修复的仿生神经移植物由壳聚糖薄膜导管1和内部填充的纤维蛋白水凝胶束2组成，形态与外周神经相似，并且由于外部包裹了壳聚糖薄膜导管1，整体较对比例2的纤维蛋白水凝胶束力学性能更好，能够更好的支撑坐骨神经损伤处肌肉挤压。并且，壳聚糖作为天然高分子具有较对比例3使用的比合成高分子更好的生物相容性，且制备工艺简单，避免引入有机溶剂等成分，较好的规避了溶剂残留等问题，且本发明中提供导管内填充物，更利于细胞亲和和形成再生组织轴索。同样，对比例4的导管虽然添加壳聚糖成分提高整体生物相容性，但是有机溶剂的添加无法避免溶剂残留问题。
请参阅图5a-5d，分别为根据本发明实施例1制得的仿生神经移植物中纤维蛋白水凝胶束的外形图及电镜图。可以看到图5d中的纳米纤维丝束的直径为100nm～500nm。该纳米微米纤维丝束构成的直径为10μm～20μm的微米纤维丝束如图5c所示，且进一步聚合成直径为80μm～100μm的微米纤维丝束，如图5b所示。该直径为80μm～100μm的微米纤维丝束会进一步聚合成直径为0.5mm～1mm的宏观水凝胶束，再经过手动缠绕收集后得到更粗的纤维蛋白水凝胶束，如图5a所示。从图中可以看到，该纤维蛋白水凝胶束分为多级，即从纳米到微米再至宏观，并且纳米的纤维取向为同一方向，微米的纤维取向为同一方向，宏观的纤维取向也为同一方向，因此实现了多级取向性结构。相较对比例4中本发明的管内填充物具有更精细的分级结构，及具有更好的生物相容性及诱导神经再生的纤维蛋白成分，纤维蛋白较PHBV与壳聚糖的混合物具有更好的神经细胞亲和性与粘附性，且纤维蛋白水凝胶的力学性能、结构及降解速度能够更好的匹配天然神经组织与神经的长入。
(二)细胞实验结果
将雪旺细胞接种于各实施例和对比例的材料上培养，免疫荧光S100(绿色)染色雪旺细胞，DAPI(蓝色)染色细胞核。请参阅图6，为实施例1制得的仿生神经移植物接种雪旺细胞后4小时的细胞染色结果图。如图6所示，雪旺细胞(SCs)在取向纤维蛋白水凝胶上定向性生长。
(三)动物实验结果
将麻醉的SD大鼠的坐骨神经暴露，切除7mm制造由于神经回缩后形成的10mm的神经缺损，移植入材料，缝合近远两段。于术后4周、6周、12周灌注取材，石蜡包埋并切片。轴突NF200进行染色观察再生神经及轴突的生长情况。请参阅图7a-7d分别为实施例1和对比例1的材料在植入大鼠坐骨神经4周后的组织染色结果图；图8a-8d分别为实施例1和对比例1的材料在植入大鼠坐骨神经6周后的细胞生长情况图；图9a-9d分别为实施例1和对比例1的材料在植入大鼠坐骨神经12周后的细胞生长情况图。其中图7a、8a和9a所采用的为实施例1制得的仿生神经移植物，图7b、8b和9b分别为图7a、8a和9a中虚线框处的放大图；图7c、8c和9c所采用的为对比例1制得的材料，图7d、8d和9d分别为图7c、8c和9c中虚线框处的放大图。如图所示，再生神经组织在实施例1制得的仿生神经移植物中的生长明显优于空壳聚糖导管中的生长。由此可见，本发明制得的仿生神经移植物能够促进神经细胞的定向性生长，尤其适用于长度超过10mm的神经缺损修复。
将动物实验术后12周大鼠关注取材前检测其损伤神经处肌电图信号，验证其功能神经信号传递情况。请参阅图10与图11，分别为对比例1材料在植入大鼠坐骨神经12周后电生理肌电图信号和实施例1材料在植入大鼠坐骨神经12周后电生理肌电图信号。如图所示，肌肉神经信号在实施例1制得的仿生神经移植物中的传递信号延迟时间短(横坐标)，振幅高(纵坐标)，均明显优于对比例1的空壳聚糖导管。由此可见，本发明制得的仿生神经移植物能够促进神经功能的恢复，尤其适用于长度超过10mm的神经缺损修复。

Claims (10)

1.一种用于外周神经修复的仿生神经移植物，其特征在于，包括：
(1)壳聚糖薄膜导管；和
(2)位于所述壳聚糖薄膜导管内的纤维蛋白水凝胶束，所述纤维蛋白水凝胶束由纤维蛋白通过静电纺丝技术制备而成。
2.根据权利要求1所述的用于外周神经修复的仿生神经移植物，其特征在于，所述壳聚糖薄膜导管的壁厚为0.3-0.5mm。
3.根据权利要求1或2所述的用于外周神经修复的仿生神经移植物，其特征在于，所述纤维蛋白水凝胶束具有多级取向性结构，由纳米纤维丝束构成，所述纳米纤维丝束构成微米纤维丝束，再由微米纤维丝束构成宏观水凝胶束。
4.根据权利要求3所述的用于外周神经修复的仿生神经移植物，其特征在于，所述纳米纤维丝束的直径为100nm～500nm，所述微米纤维丝束的直径为10μm～100μm。
5.根据权利要求4所述的用于外周神经修复的仿生神经移植物，其特征在于，所述纤维蛋白水凝胶束中复合有一种或多种多糖，所述多糖选自由壳聚糖、透明质酸和海藻酸钠构成的组，且加入的多糖与所述纤维蛋白原的质量比为1:2～2:1。
6.一种根据权利要求1-5中任一项所述的用于外周神经修复的仿生神经移植物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤S1、壳聚糖薄膜导管的制备，具体包括：
步骤S1-1、将壳聚糖溶解于稀冰醋酸、盐酸中的任何一种，配制成壳聚糖的酸溶液，其中壳聚糖浓度为0.01-0.02g/ml；
步骤S1-2、将S1-1所得壳聚糖酸溶液盛取于平整面的玻璃培养皿中，常温常压通风干燥，待溶剂挥发，得到半干壳聚糖溶液；
步骤S1-3、将S1-2所得的半干壳聚糖溶液置于烘箱中干燥得到壳聚糖薄膜；
步骤S1-4、将得到的壳聚糖薄膜浸泡在纯水中洗涤待用；
步骤S2、纤维蛋白水凝胶束的制备，具体包括：
步骤S2-1、将纤维蛋白原溶解于纯水或者生理盐水中，与聚氧化乙烯水溶液或者聚氧化乙烯生理盐水溶液混合均匀，得到电纺原液，所述电纺原液中纤维蛋白原的质量分数为3％～6％，聚氧化乙烯的质量分数为1％～1.5％，将所述电纺原液注入注射器中待用；
步骤S2-2、将CaCl2水溶液与凝血酶溶液混合得到交联溶液并在37℃保温，所述交联溶液中CaCl2的质量分数为1％-5％，凝血酶的含量为10-50Units/ml，将所述交联溶液取于金属旋转接收盘中待用；
步骤S2-3、注入注射器的电纺原液在推进泵的作用下进行静电纺丝，调整纤维蛋白原的推注速度为1-3ml/h，加载电压3-5kV，使用金属旋转接收盘接收静电纺丝得到的纤维蛋白原纺丝，调整旋转接收速度为150-300r/h，所述纤维蛋白原纺丝在交联溶液的作用下得到纤维蛋白水凝胶束；
步骤S2-4、收集得到所需直径的纤维蛋白水凝胶束；
步骤S3、仿生神经移植物的制备，具体包括：将步骤1中所得壳聚糖薄膜包裹步骤2所得的纤维蛋白水凝胶束得到所述用于外周神经修复的仿生神经移植物。
7.根据权利要求6所述的用于外周神经修复的仿生神经移植物的制备方法，其特征在于，所述步骤S2-1的电纺原液中加入一种或多种多糖，所述多糖与所述纤维蛋白原的质量比为1:2～2:1，所述多糖选自由壳聚糖、透明质酸和海藻酸钠构成的组，所述壳聚糖、透明质酸和海藻酸钠接枝甲基丙烯酰胺基团；所述步骤S2-2的交联溶液中加入质量分数为0.05～1％的光引发剂，并在步骤S2-3中旋转接收时，采用紫外光照10-30分钟。
8.根据权利要求6所述的用于外周神经修复的仿生神经移植物的制备方法，其特征在于，所述步骤S2-1中所述电纺原液中纤维蛋白原的质量分数为4％～5％；聚氧化乙烯的质量分数为1.2％～1.5％。
9.根据权利要求6所述的用于外周神经修复的仿生神经移植物的制备方法，其特征在于，所述步骤S2-2中所述CaCl2的质量分数为2％-3％，凝血酶的含量为20-40Units/ml。
10.根据权利要求1-5中任一项所述的用于外周神经修复的仿生神经移植物在外周神经修复中的应用。
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