CN102091353A - 缓释型取向纳米纤维神经导管的制备方法 - Google Patents

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张葵花
莫秀梅
汪春阳
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Abstract

一种缓释型取向纳米纤维神经导管的制备方法，依次包括如下步骤：芯层溶液的制备、皮层溶液的制备、同轴静电纺丝及采用高速旋转滚筒接收装置制得缓释型取向纳米纤维膜和纳米纤维神经导管制备。本发明制备方法简单易行，原材料资源丰富，且具有良好的生物相容性和生物可降解性，易实现工业化生产。在周围神经缺损的的临床治疗中有广阔的应用前景。

Description

缓释型取向纳米纤维神经导管的制备方法
技术领域
本发明涉及医用生物材料技术领域，具体涉及一种缓释型取向纳米纤维神经导管的制备方法。
背景技术
周围神经损伤是临床常见疾患，其预后差，致残率非常高，给病人、家庭和社会带来巨大的经济损失和精神负担。对于周围神经缺损，自体神经移植仍是目前修复的“金标准”。但存在再生速度慢、自体神经取材来源有限、供体与受体神经直径不匹配等缺点。因此寻找自体神经的替代物以及制备理想的神经导管促进神经再生成为神经修复的关键。理想的神经导管支架应满足：①仿生天然细胞外基质的结构和生物学功能；②有良好的生物相容性使得细胞可以黏附和增殖；③降解速率与组织再生的速率相匹配；④适当的机械性能，支撑细胞生长；⑤具有较好的显微结构；⑥特定的三维外形；⑦高比表面积和合适的表面理化性质(Adv.Drug Deliv.Rev.2007，59，1413-1433)。具有高孔隙率、高比表面积的静电纺丝纳米纤维支架与天然细胞外基质结构非常相似。且纳米纤维的直径、纤维取向、支架的形状很容易通过纺丝参数、溶液的性能、化学组成、接收装置来裁剪。大量研究表明纳米纤维组织修复材料能显著地促进了细胞的粘附、增长和分化(Science，2005，310，135-1138)。此外，取向排列纳米纤维的拓扑结构通过“接触引导”机制能控制神经细胞的生长，使细胞沿着纤维的方向拉伸和生长，并能引导神经轴突沿着纤维方向生长(Biomaterials，2008，29，4532-4539；Biomaterials，2008，29，653-661)。
然而神经再生是细胞，细胞外基质和神经营养因子相互作用的结果，单一神经导管的修复效果是较有限。因为周围神经再生不仅要恢复其结构，更重要的是恢复其感觉和运动功能。为了达到或超过自体神经移植的修复效果，近年来研究者们不断致力于可控制的活性复合神经导管的制备，使之可局部释放有活性的营养因子，模拟自体神经的结构及成分。同轴静电纺为活性因子的缓慢释放提供了理想的平台，在芯层的活性因子通过纳米纤维持续向外渗透和随着纤维的逐步降解缓慢释放出来，从而使活性因子发挥最大效用。丝素蛋白和聚乳酸-聚己内酯共聚物(P(LLA-CL))(50∶50)都是具有良好的生物相容性和生物可降解性的生物材料，并且两种材料的复合既提高纤维的表面的亲水性及提供细胞识别位点，又使其具有良好的力学性能。
发明内容
本发明的目的是提供一种缓释型取向纳米纤维神经导管的制备方法，使制备简单易行，便于产业化，并满足周围神经缺损的临床治疗中的应用。
本发明所述的一种缓释型取向纳米纤维神经导管的制备方法，包括：
a)芯层溶液的制备：将丝素蛋白、神经营养因子溶解于无菌去离子水中，得到5-15w/v％的丝素蛋白溶液；
b)皮层溶液的制备：将丝素蛋白和P(LLA-CL)混合，丝素蛋白的含量为25wt％-75wt％，溶解于六氟异丙醇溶剂中，搅拌至完全溶解，得到6-10w/v％的溶液
c)同轴静电纺丝：喷丝头与高速旋转滚筒接收装置的距离为10-15cm，分别调节皮层和芯层的给液速率，纺丝电压为10-15kv，旋转滚筒的旋转速率为3500-4000rpm，制得取向纳米纤维膜；
d)纳米纤维膜沿垂直于纤维取向的方向卷曲，并用8-0显微缝线缝合，制备出具有取向性的纳米纤维神经导管。神经导管的长度、内径、管壁的的厚度可以根据临床应用需要进行裁剪。
皮层给液速率为1.0-1.5mL/h，芯层给液速率为0.2-0.4mL/h。
本发明技术方案实现的有益效果：
本发明公开了一种缓释型取向纳米纤维神经导管的制备方法，主要由丝素蛋白和P(LLA-CL)为材质，对同轴静电纺丝过程中的各个参数进行综合应用制得。本发明制备方法简单易行，原材料资源丰富，且具有良好的生物相容性和生物可降解性，易实现工业化生产。在周围神经缺损的的临床治疗中有广阔的应用前景。
具体实施方式
以下详细描述本发明的技术方案。
实施例1
先将100克去蛹蚕茧加入到1升0.5w/v％Na2CO3水溶液中，煮沸30min，重复处理三次，用蒸馏水充分洗净，洗净后放入45℃的干燥箱中烘干，得到脱胶后的蚕丝纤维。以CaCl2∶C2H5OH∶H2O＝1∶2∶8的摩尔比配制三元溶剂，将蚕丝纤维以1∶10的浴比，置于70℃的水浴锅内恒温水解1h，得到完全溶解的棕黄色的蚕丝纤维水解溶液。水解液装入透析袋中，用蒸馏水透析72h，将透析好的蚕丝纤维水解溶液放入-80℃预冻12h，然后在-58℃冷冻干燥至干，得到白色，无味，疏松的多孔状固体丝素蛋白。
用电子天平分别称取0.5g丝素蛋白、0.01mg神经生长因子(NGF)和0.01mg胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)，并将其溶解于10mL无菌去离子水中，搅拌至完全溶解得到5w/v％丝素蛋白芯层溶液；分别称取0.25g丝素蛋白和0.75g P(LLA-CL)(50∶50)，溶解于10mL的六氟异丙醇中，搅拌至完全溶解，得到溶质的质量比25∶75，总浓度为10w/v％的混合溶液作为皮层溶液。同轴静电纺丝条件：设定芯层溶液的给液速率为0.2mL/h，喷丝头直径为0.9mm，皮层溶液的给液速率为1.0-1.2mL/h，喷丝头直径为1.2mm；电压为10-15kv，接收距离为12cm；高速旋转滚筒的接收速率为4000rpm，得到取向纳米纤维膜。
将制备的取向纳米纤维膜沿垂直于纤维取向的方向卷曲，并用8-0显微缝线缝合，制备出具有取向性的纳米纤维神经导管。神经导管的长度为1.5cm，内径为2mm，管壁厚度为0.3mm。
实施例2
用电子天平分别称取1.0g按照实施例一中制备的丝素蛋白、0.01mgNGF和0.01mg FGF，并将其溶解于10mL无菌去离子水中，搅拌至完全溶解得到10w/v％丝素蛋白芯层溶液；分别称取0.2g丝素蛋白和0.6gP(LLA-CL)(50∶50)，溶解于10mL的六氟异丙醇中，搅拌至完全溶解，得到溶质的质量比25∶75，总浓度为8w/v％的混合溶液作为皮层溶液。同轴静电纺丝条件：设定芯层溶液的给液速率为0.2mL/h，喷丝头直径为0.9mm，皮层溶液的给液速率为1.0-1.2mL/h，喷丝头直径为1.2mm；电压为10-15kv，接收距离为12cm；高速旋转滚筒的接收速率为4000rpm，得到取向纳米纤维膜。
将制备的取向纳米纤维膜沿垂直于纤维取向的方向卷曲，并用8-0显微缝线缝合，制备出具有取向性的纳米纤维神经导管。神经导管的长度为1.2cm，内径为1.4mm，管壁厚度为0.3mm。
实施例3
用电子天平分别称取1.5g按照实施例一中制备的丝素蛋白、0.01mg神经生长因子(NGF)和0.01mg成纤维细胞生长因子(FGF)，并将其溶解于10mL无菌去离子水中，搅拌至完全溶解得到15w/v％丝素蛋白芯层溶液；分别称取0.15g丝素蛋白和0.45g P(LLA-CL)(50∶50)，溶解于10mL的六氟异丙醇中，搅拌至完全溶解，得到溶质的质量比25∶75，总浓度为6w/v％的混合溶液作为皮层溶液。同轴静电纺丝条件：设定芯层溶液的给液速率为0.2mL/h，喷丝头直径为0.9mm，皮层溶液的给液速率为1.0-1.2mL/h，喷丝头直径为1.2mm；电压为10kv，接收距离为12cm；高速旋转滚筒的接收速率为4000rpm，得到取向纳米纤维膜。
将制备的取向纳米纤维膜沿垂直于纤维取向的方向卷曲，并用8-0显微缝线缝合，制备出具有取向性的纳米纤维神经导管。神经导管的长度为1.2cm，内径为1.4mm，管壁厚度为0.3mm。
实施例4
选取清洁级SD雄性大鼠24只，体重200-250g。按完全随机的原则分成二组。A组：按实施例二制备的缓释型取向纳米纤维神经导管组(实验组)；B组：自体神经组(阳性对照组)。每组各12只，均采用右侧坐骨神经作为修复模型。神经导管植入体内8周后，神经导管两端的神经都有纤维组织包绕，在神经导管周围形成一层血管网，与周围组织无粘连，周围组织没有明显地炎症反应。说明该方法制备的经导管具有很好的生物相容性。纵行剖开神经导管后，发现再生的神经直径大小与自体神经基本一致，与神经导管无粘连，无神经瘤形成。经电生理检测、组织学和免疫组织学分析表明该方法制备的神经导管组与自体神经组相比没有显著性差异，能促进神经的再生。

Claims (4)

1.一种缓释型取向纳米纤维神经导管的制备方法，依次包括如下步骤：
a)芯层溶液的制备：将丝素蛋白、神经营养因子溶解于无菌去离子水中，得到5-15w/v％的丝素蛋白溶液；
b)皮层溶液的制备：将丝素蛋白和P(LLA-CL)混合，并溶解于六氟异丙醇溶剂中，搅拌至完全溶解，得到6-10w/v％的溶液；
c)同轴静电纺丝：喷丝头与高速旋转滚筒接收装置的距离为10-15cm，分别调节皮层和芯层的给液速率，纺丝电压为10-15kv，旋转滚筒的旋转速率为3500-4000rpm，制得取向纳米纤维膜；
d)纳米纤维膜沿垂直于纤维取向的方向卷曲，并用8-0显微缝线缝合，制备出具有取向性的纳米纤维神经导管。神经导管的长度、内径、管壁的的厚度可以根据临床应用需要进行裁剪。
2.根据权利要求1所述的缓释型取向纳米纤维神经导管的制备方法，其特征是所述的丝素蛋白和所述的P(LLA-CL)混合中，所述的丝素蛋白的含量为25wt％-75wt％。
3.根据权利要求1所述的缓释型取向纳米纤维神经导管的制备方法，其特征是所述的皮层给液速率为1.0-1.5mL/h。
4.根据权利要求1所述的缓释型取向纳米纤维神经导管的制备方法，其特征是所述的芯层给液速率为0.2-0.4mL/h。
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