CN106075578A - 一种plga三维神经导管及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种PLGA三维神经导管及其制备方法，所述PLGA三维神经导管为具有层粘连蛋白涂层并含有取向纱线芯层的PLGA三维神经导管；制备：将聚乳酸羟基乙酸共聚物PLGA溶于溶剂中，混匀，得到纺丝液；然后进行单喷头静电纺丝，得到含取向纱线芯层的PLGA三维神经导管，然后通过共价键结合层粘连蛋白，即得。本发明的具有蛋白涂层和取向纱线填充的三维神经导管具有优良的力学性能，生物活性和降解性能；涂层的蛋白能够促进神经细胞的粘附和神经轴突再生，同时芯层的纱线能够诱导神经细胞沿着纱线取向方向爬行生长，有利于三维神经组织的再生与重建，在外周神经组织修复与再生中将会有重要的应用。

Description

一种PLGA三维神经导管及其制备方法
技术领域
本发明属于神经导管及其制备领域，特别涉及一种PLGA三维神经导管及其制备方法。
背景技术
静电纺丝技术在管状组织工程支架的制备领域有非常重要的应用，多种合成高分子材料和天然高分子材料及其共混材料可以用于静电纺丝技术，制备纳米级到微米级的纤维支架。通过静电纺丝技术制备的纤维支架可以从原材料选择上来模拟天然细胞外基质组分，同时纤维结构支架也能仿生天然细胞外基质的结构，具有较高的比表面积，有利于细胞的粘附和增殖。然而，传统的静电纺丝技术制备的纳米级纤维孔隙率较低，孔径较小，不利于细胞的渗透和三维生长。目前，通过对传统静电纺丝技术的改进与研发，有多种制备大孔径三维支架的静电纺丝技术得以研发，如空气阻抗型静电纺、动态水流静电纺、双向共轭静电纺、无针静电纺等，这些纺丝方法制备的支架为膜状或管状，对于细胞的渗透生长有不同程度的促进作用。本发明采用的双喷头纺纱设备制备的是单根的微米级纱线，单根纱线直径可达到几百微米。选取的生物可降解材料PLGA制备的纱线，能够控制纱线的直径以及组成纱线中纤维的卷绕度，在再生医学中可以有广泛的应用。
对于外周神经组织修复与再生，三维神经导管的仿生结构设计以及生物功能化有着非常重要的意义，其中雪旺细胞的粘附、增殖以及神经细胞的轴突再生是神经组织再生的关键。目前的研究中多有通过静电纺技术、冷冻干燥技术、水凝胶制备技术或者三维打印技术等制备多通道三维神经导管的研发，用于诱导神经细胞沿着轴向爬行生长。本发明将轴向取向纱线芯层的诱导与蛋白功能化修饰相结合，制备出一种具有层粘连蛋白涂层并含有取向纱线芯层的PLGA三维神经导管。该三维神经导管具有优良的力学性能，生物相容性和降解性能；涂层的层粘连蛋白能够促进神经细胞的粘附和轴突再生，同时芯层的纱线结构也能够诱导神经细胞沿着轴向取向方向爬行生长，有利于三维神经组织的再生与重建，在外周神经组织修复与再生中将会有重要的应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种PLGA三维神经导管及其制备方法，本发明的三维神经导管具有优良的力学性能，生物相容性和降解性能；涂层的蛋白能够促进神经细胞的粘附，同时芯层的纱线能够诱导神经细胞沿着纱线取向方向爬行生长，有利于三维神经组织的再生与重建，在外周神经组织修复与再生中将会有重要的应用。
本发明的一种PLGA三维神经导管，所述PLGA三维神经导管为具有层粘连蛋白涂层并
含有取向纱线芯层的PLGA三维神经导管；
其中PLGA三维神经导管的芯层为轴向取向排列的PLGA纱线，外层为PLGA纤维结构；PLGA三维神经导管表面修饰有层粘连蛋白。
本发明的一种PLGA三维神经导管的制备方法，包括：
(1)将聚乳酸羟基乙酸共聚物PLGA溶于溶剂中，混匀，得到纺丝液；
(2)步骤(1)的纺丝液进行单喷头静电纺丝，得到含取向纱线芯层的PLGA三维神经导管，其中单喷头静电纺丝所用旋转接收装置为：将直径均匀的PLGA纱线剪成同样长度，沿着轴向平行排列固定在接收棒上，作为旋转接收装置；
(3)步骤(2)的含取向纱线芯层的PLGA三维神经导管通过共价键结合层粘连蛋白，即得具有层粘连蛋白涂层并含有取向纱线芯层的PLGA三维神经导管。
所述步骤(1)中PLGA共聚物LA/GA＝82/18(摩尔比)，特性粘数IV为1.9dl/g。
所述步骤(1)中溶剂为六氟异丙醇。
所述步骤(1)中纺丝液中PLGA的质量体积百分浓度为12％-15％。
所述步骤(2)中单喷头静电纺的参数为：PLGA纺丝液流速1.0mL/h，静电高压10-14kV，纺丝喷头到接收装置距离为12-15cm，接收装置旋转速度为300-1500rpm。
所述步骤(2)中PLGA纱线为双喷头纺纱制备，具体为：双喷头的PLGA纺丝液流速为0.02mL/min和0.032mL/min，两端分别为正高压(+7-10kV)和负高压(-7-10kV)，
两个喷头之间的距离为10-15cm，旋转喇叭(用于将两个喷头纺出的纤维卷绕成纱线)的转速为350-500rpm，旋转喇叭底端到纱线接收装置的距离为60cm，纱线接收装置的转速为5-10rpm。
步骤(2)中轴向平行排列固定在接收棒上的纱线长度为2-20cm；接收棒的直径为1-10mm；固定在接收棒上的纱线数量为10根到上百根(指步骤(2)中固定在接收棒上的纱线数量)。
步骤(3)中共价键结合层粘连蛋白具体为：先用0.01M NaOH浸泡10-20min，再用0.1M的MES溶液4℃浸泡30min，然后将MES溶液浸泡的神经导管取出，放入NHS/EDC/MES溶液室温反应1h；用4℃的MES冲洗1-3遍，加入层粘连蛋白溶液4℃浸泡10-24h；其中导管与层粘连蛋白溶液的质量体积比为10mg：1mL。
所述NHS/EDC/MES溶液为：用4℃的MES配制NHS/EDC溶液，其中NHS和EDC的浓度分别为6mg/mL和4mg/mL；层粘连蛋白溶液的浓度为20-100μg/mL。
PLGA具有良好的力学性能和生物降解性能；层粘连蛋白是基底膜的主要成分，作为生物活性蛋白它能够促进细胞粘附以及轴突生长，在神经组织工程中有重要的应用。本发明的具有层粘连蛋白涂层和取向纱线填充的三维神经导管从结构和功能仿生设计，并且具有优良的力学性能，生物相容性和降解性能；涂层的蛋白能够促进神经细胞的粘附和轴突再生，同时芯层的纱线结构也能够诱导神经细胞沿着轴向取向方向爬行生长，有利于三维神经组织的再生与重建，在外周神经组织修复与再生中将会有重要的应用。
有益效果
(1)本发明制备具有生物活性蛋白涂层，并且有取向纱线芯层的PLGA三维神经导管，将生物化学修饰与支架三维结构设计相结合，得到具有仿生结构和生物学功能的组织工程三维神经导管，兼具优良的生物力学性能、生物相容性和降解性能；
(2)本发明制备的PLGA三维神经导管芯层为轴向取向排列的PLGA纱线，能够诱导神经细胞沿着轴向取向方向爬行生长，并且容易降解；外层为PLGA纤维结构，能够促进神经细胞的粘附和增殖；
(3)本发明制备的PLGA三维神经导管具有生物活性蛋白-层粘连蛋白的表面修饰，能够促进细胞粘附以及轴突生长；
(4)本发明制备的具有层粘连蛋白涂层并含有取向纱线芯层的PLGA三维神经导管，从结构和功能仿生设计，并且具有优良的力学性能，生物活性和降解性能；原材料为生物可降解材料，神经导管能随着神经组织的修复与再生而逐渐降解，在外周神经修复领域有重要的应用。
附图说明
图1本发明制备的具有层粘连蛋白涂层并含有取向纱线芯层的PLGA三维神经导管；其中a为三维神经导管长度方向的数码照片；b为三维神经导管截面的数码照片，b中插图为截面特写，可以看到包裹的纱线；
图2实施例1中外层PLGA纤维(a)以及涂层后PLGA纤维(b)的SEM图片；
图3实施例1中芯层PLGA纱线的SEM图片；其中(a)为100倍；(b)为200倍；
图4实施例1中PLGA纤维和纱线蛋白涂层前后的XRD图谱；
图5实施例1中PLGA纤维(a)和纱线(b)的拉伸力学性能；
图6实施例1中雪旺细胞在蛋白涂层PLGA纤维上生长4天的显微镜图片；
图7实施例1中雪旺细胞在蛋白涂层PLGA纱线上生长7天的显微镜图片。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
用电子天平称取质量为1.5g的PLGA溶于10mL六氟异丙醇中，搅拌过夜至完全溶解，得到PLGA纺丝液；采用定制的双喷头纺纱设备制备直径均匀的PLGA纱线，纺丝参数为：双喷头的PLGA纺丝液流速为0.02mL/min和0.032mL/min，两端分别为正高压和负高压+10kV和-10kV，两个喷头之间的距离为15cm，旋转喇叭的转速500rpm，旋转喇叭底端到纱线接收装置的距离为60cm，纱线接收装置的转速为5rpm，得到PLGA纱线；将PLGA纱线剪成统一长度为8cm，选取直径2mm的接收棒，将40根纱线轴向排列在接收棒上固定好；以此作为接收PLGA纤维的旋转装置进行单喷头静电纺，纺丝参数为：PLGA纺丝液流速1mL/h，静电高压12kV，纺丝喷头到接收装置距离为12cm，接收装置旋转速度为500rpm，纺丝进行2小时，得到含有纱线芯层的PLGA三维神经导管；将三维神经导管剪成1cm/根，先用0.01M NaOH浸泡10-20min，再用0.1M的MES溶液4℃浸泡30min；用4℃的MES配制NHS/EDC溶液，其中NHS和EDC的浓度分别为6mg/mL和4mg/mL；将MES溶液浸泡的管子取出，放入NHS/EDC/MES溶液，室温反应1h；用4℃的MES冲洗3遍，加入20μg/mL的层粘连蛋白溶液4℃浸泡24h，导管与蛋白溶液的质量体积比为10mg/mL。
实施例2
用电子天平称取质量为1.2g的PLGA溶于10mL六氟异丙醇中，搅拌过夜至完全溶解，得到PLGA纺丝液；采用定制的双喷头纺纱设备制备直径均匀的PLGA纱线，纺丝参数为：双喷头的PLGA纺丝液流速为0.02mL/min和0.032mL/min，两端分别为正高压和负高压+10kV和-10kV，两个喷头之间的距离为15cm，旋转喇叭的转速350rpm，旋转喇叭底端到纱线接收装置的距离为60cm，纱线接收装置的转速为7rpm，得到PLGA纱线；将PLGA纱线剪成统一长度为10cm，选取直径1mm的接收棒，将20根纱线轴向排列在接收棒上固定好；以此作为接收PLGA纤维的旋转装置进行单喷头静电纺，纺丝参数为：PLGA纺丝液流速1mL/h，静电高压12kV，纺丝喷头到接收装置距离为12cm，接收装置旋转速度为800rpm，纺丝进行1.5小时，得到含有纱线芯层的PLGA三维神经导管；将三维神经导管剪成1cm/根，先用0.01M NaOH浸泡10-20min，再用0.1M的MES溶液4℃浸泡30min；用4℃的MES配制NHS/EDC溶液，其中NHS和EDC的浓度分别为6mg/mL和4mg/mL；将MES溶液浸泡的管子取出，放入NHS/EDC/MES溶液，室温反应1h；用4℃的MES冲洗3遍，加入100μg/mL的层粘连蛋白溶液4℃浸泡24h，导管与蛋白溶液的质量体积比为10mg/mL。

Claims (10)

1.一种PLGA三维神经导管，其特征在于：所述PLGA三维神经导管为具有层粘连蛋白涂层并含有取向纱线芯层的PLGA三维神经导管；
其中PLGA三维神经导管的芯层为轴向取向排列的PLGA纱线，外层为PLGA纤维结构；PLGA三维神经导管表面修饰有层粘连蛋白。
2.一种如权利要求1所述的PLGA三维神经导管的制备方法，包括：
(1)将聚乳酸羟基乙酸共聚物PLGA溶于溶剂中，混匀，得到纺丝液；
(2)步骤(1)的纺丝液进行单喷头静电纺丝，得到含取向纱线芯层的PLGA三维神经导管，其中单喷头静电纺丝所用旋转接收装置为：将PLGA纱线沿着轴向平行排列固定在接收棒上，作为旋转接收装置；
(3)步骤(2)的含取向纱线芯层的PLGA三维神经导管通过共价键结合层粘连蛋白，即得具有层粘连蛋白涂层并含有取向纱线芯层的PLGA三维神经导管。
3.根据权利要求2所述的一种PLGA三维神经导管的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中PLGA共聚物中，按摩尔比LA：GA＝82：18，特性粘数IV为1.9dl/g。
4.根据权利要求2所述的一种PLGA三维神经导管的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中溶剂为六氟异丙醇。
5.根据权利要求2所述的一种PLGA三维神经导管的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中纺丝液中PLGA的质量体积百分浓度为12％-15％。
6.根据权利要求2所述的一种PLGA三维神经导管的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中单喷头静电纺的参数为：PLGA纺丝液流速1.0mL/h，静电高压10-14kV，纺丝喷头到接收装置距离为12-15cm，接收装置旋转速度为300-1500rpm。
7.根据权利要求2所述的一种PLGA三维神经导管的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中PLGA纱线为双喷头纺纱制备，具体为：双喷头的PLGA纺丝液流速为0.02mL/min和0.032mL/min，两端分别为正高压：+7～10kV和负高压：-7～10kV，两个喷头之间的距离为10-15cm，旋转喇叭的转速为350-500rpm，旋转喇叭底端到纱线接收装置的距离为60cm，纱线接收装置的转速为5-10rpm。
8.根据权利要求2所述的一种PLGA三维神经导管的制备方法，其特征在于：步骤(2)中轴向平行排列固定在接收棒上的纱线长度为2-20cm；接收棒的直径为1-10mm。
9.根据权利要求2所述的一种PLGA三维神经导管的制备方法，其特征在于：步骤(3)中共价键结合层粘连蛋白具体为：先用0.01M NaOH浸泡10-20min，再用0.1M的MES溶液4℃浸泡30min，然后将MES溶液浸泡的神经导管取出，放入NHS/EDC/MES溶液室温反应1h；用4℃的MES冲洗1-3遍，加入层粘连蛋白溶液4℃浸泡10-24h；其中导管与层粘连蛋白溶液的质量体积比为10mg：1mL。
10.根据权利要求9所述的一种PLGA三维神经导管的制备方法，其特征在于：NHS/EDC/MES溶液为：用4℃的MES配制NHS/EDC溶液，其中NHS和EDC的浓度分别为6mg/mL和4mg/mL；层粘连蛋白溶液的浓度为20-100μg/mL。
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