CN104027848B - 一种用于牙周组织的生物支架材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于牙周组织的生物支架材料及其制备方法，属于生物组织工程支架技术领域。该生物支架材料由壳层溶液和芯层溶液通过同轴静电纺丝制成，壳层溶液和芯层溶液是将各含有一种基因质粒的载体复合物纳米微球分别溶解于可降解的有机高分子溶剂中混匀后制得。本发明方法利用同轴静电纺丝法制备具有芯壳结构的生物支架材料，工艺简单，易于操作、成本低，可用于组织工程介导的非病毒基因治疗。
Description
技术领域
本发明属于生物组织工程支架技术领域，具体涉及一种用于牙周组织的生物支架材料及其制备方法。
背景技术
牙周病是指发生在牙支持组织(牙周组织)的疾病，包括仅累及牙龈组织的牙龈病和波及深层牙周组织(牙周膜、牙槽骨、牙骨质)的牙周炎两大类。牙周疾病是常见的口腔疾病，是引起成年人牙齿丧失的主要原因之一，也是危害人类牙齿和全身健康的主要口腔疾病。现有治疗方式只是维持在基础治疗。随着组织工程技术的快速发展，牙周组织工程技术为牙周病治疗和牙周缺损修复带来了新的希望，目前已成为牙周组织重建研究的热点。
组织工程技术的关键在于组织工程支架。如何提高孔隙率，给细胞提供三维生长空间、诱导细胞分化生长和血管的长入是困扰组织工程支架的难题。同轴静电纺丝是一种利用高压静电场制备芯-壳型超细纤维支架的新兴技术，其产品具有纳米级的纤维细度、超高的比表面积和相互连通的多孔隙三维结构，能够最大程度的仿生细胞外基质的纤维网络。芯-壳型内外双层的复合结构不仅有助于分层承载不同的质粒DNA载体，实现目的基因的缓慢可调释放，避免突释效应，更有利于将质粒DNA载体与支架材料处理过程中的毒性有机溶剂隔离开来，从而更好的发挥其生物活性。
已有研究报道，人骨保护素基因(hOPG)有阻断/延缓骨质吸收的作用，人骨形态发生蛋白-2基因(hBMP-2)有促进骨质重建的功能。现已有技术报道将其中的一种基因包裹在组织工程支架中，稳定释放，促进成骨细胞分化。然而，骨组织再生重建是多基因多因素共同作用的结果，单独一种基因表达的生长因子尚不能很好的完成骨再生这一过程。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于牙周组织的生物支架材料及其制备方法，该生物支架材料能够促进骨再生，有效治疗牙周病，该方法工艺简单，易于操作。
本发明是通过以下技术方案来实现：
一种用于牙周组织的生物支架材料，该生物支架材料由壳层溶液和芯层溶液通过同轴静电纺丝制成，壳层溶液和芯层溶液是将各含有一种基因质粒的载体复合物纳米微球分别溶解于可降解的有机高分子溶剂中混匀后制得；其中，壳层溶液与芯层溶液的质量比为(1～10)：1，可降解的有机高分子溶剂的质量浓度为10％～15％；
所述基因质粒载体复合纳米微球是将基因质粒PBS溶液加入基因载体溶液中混匀、静置制得，基因质粒PBS溶液与基因载体溶液的体积比为1：(2～10)；基因质粒PBS溶液中，基因质粒的浓度为0.1～5mg/mL。
壳层溶液中含有人骨保护素基因质粒，芯层溶液中含有人骨形态发生蛋白-2基因质粒；基因载体溶液为质量浓度为20％～50％的G5-PAMAM-D水溶液。
所述壳层溶液采用的可降解的有机高分子溶剂为聚乳酸、聚己内酯或聚乳酸-羟基乙酸溶于有机溶剂中制成，其中，有机溶剂为二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺按体积比8：2配成的混合溶液；
所述芯层溶液采用的可降解的有机高分子溶剂为聚乳酸、聚己内酯、聚乙二醇或聚乳酸-羟基乙酸溶于水中制成。
所述同轴静电纺丝是将壳层纤维溶液和芯层纤维溶液通过以同心方式排列的不同内径的针头进行静电纺丝，其中，芯层针头内径为0.06～1mm，壳层针头内径为0.2～2mm。
一种用于牙周组织的生物支架材料的制备方法，包括以下步骤：
1)制备基因质粒载体复合纳米微球
将含有人骨保护素基因质粒的PBS溶液和人骨形态发生蛋白-2基因的PBS溶液分别加入基因载体溶液中，充分混匀后静置，得到人骨保护素基因质粒载体复合纳米微球和人骨形态发生蛋白-2基因质粒载体复合纳米微球；
其中，含有人骨保护素基因质粒的PBS溶液和人骨形态发生蛋白-2基因的PBS溶液与基因载体溶液的体积比均为1：(2～10)；
人骨保护素基因质粒的PBS溶液和人骨形态发生蛋白-2基因的PBS溶液中，基因质粒的用量为0.1～5mg/mL；
2)配制壳层纤维溶液和芯层纤维溶液
将人骨保护素基因质粒载体复合纳米微球和人骨形态发生蛋白-2基因质粒载体复合纳米微球分别溶于质量浓度为10％～15％的可降解的有机高分子溶剂中，制得壳层溶液和芯层溶液；
3)同轴静电纺丝
将壳层溶液和芯层溶液以同心排列的不同内径的针头进行静电纺丝，得到用于牙周组织的生物支架材料。
6、根据权利要求5所述的一种用于牙周组织的生物支架材料的制备方法，其特征在于，所述人骨保护素基因质粒为pDsRed2-N1-hOPG，所述人骨形态发生蛋白-2基因为pIRES2-EGFP-hBMP2；所述基因载体溶液为质量浓度为20％～50％的G5-PAMAM-D水溶液。
所述壳层溶液采用的可降解的有机高分子溶剂为聚乳酸、聚己内酯或聚乳酸-羟基乙酸溶于有机溶剂中制成，其中，有机溶剂为二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺按体积比8：2配成的混合溶液；
所述芯层溶液采用的可降解的有机高分子溶剂为聚乳酸、聚己内酯、聚乙二醇或聚乳酸-羟基乙酸溶于水中制成。
步骤3)所述的以不同内径的针头进行静电纺丝时采用的芯层针头内径为0.06～1mm，壳层针头内径为0.2～2mm。
所述静电纺丝的条件为：芯层纤维溶液流速为0.1～1mL/h，壳层纤维溶液流速为0.5～15mL/h，针头与接收板距离为10～30cm，电压为6～30kv。
还包括对得到的牙周组织的生物支架材料进行干燥的步骤，具体为：在温度为15～25℃下，真空干燥20～30h。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明的用于牙周组织的生物支架材料中携带两种用于哺乳动物转染的基因质粒，该两种基因质粒能够随着材料的降解而释放出来，并转染到细胞中去，表达相关生长因子，从而能够有效促进细胞分化、生长。本发明的双基因生物支架材料具有纤维结构，表面光滑，直径均一，无缺陷结构，机械性能优良，且降解可持续50天以上，释放的质粒能够高效率转染入细胞，其中壳层降解速度快，芯层缓慢，两层携带的质粒能够有序转染表达相应生长因子。
本发明方法利用同轴静电纺丝法制备具有芯壳纤维结构的生物支架材料，提高了电纺纤维的包封率，可以长时间保持基因质粒的生物活性，能够长期稳定的释放基因质粒。各基因质粒能够进入细胞并顺利复制、表达，分泌生长因子，促进骨再生，从而达到治疗牙周病的目的。本发明工艺简单，易于操作、成本低，可用于组织工程介导的非病毒基因治疗。与细胞外基质(ECM)相适应，可满足伤口敷料、药物缓释载体、GTR膜以及组织工程支架的要求。
附图说明
图1为本发明的静电纺丝装置的结构示意图；
图2为本发明实施例1制得的生物支架材料的扫描电镜照片；
图3为本发明实施例1制得的生物支架材料的降解曲线。
其中，A为芯层溶液注射泵；B为壳层溶液注射泵；C同轴喷头；D为芯层溶液入口；E为壳层溶液入口；F为正高压级；G为接收板；H为负高压级。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
一种用于牙周组织的生物支架材料(应用于组织工程的双基因活化基质)的制备方法，包括以下步骤：
1、将两种基因质粒分别溶于基因载体G5-PAMAM-D溶液中，得到的混合物静置30min形成两种G5-PAMAM-D基因质粒载体复合物纳米微球；
2、将两种基因质粒载体复合物纳米微球分别溶于质量浓度为10％～15％的可降解的有机高分子溶剂中，制成壳层溶液和芯层溶液；
3、将壳层溶液和芯层溶液用同心方式排列的不同内径的针头进行同轴静电纺丝，芯层内径0.06-1mm，壳层内径0.2-2mm。芯层溶液流速0.1-1ml/h，壳层溶液流速0.5-15ml/h；针头与接收板距离为10-30cm，电压为6-30kv。
其中，静电纺丝所用装置参见图1所示的结构，A为芯层溶液注射泵；B为壳层溶液注射泵；C同轴喷头；D为芯层溶液入口；E为壳层溶液入口；F为正高压级；G为接收板；H为负高压级。
实施例1
一种用于牙周组织的生物支架材料的制备方法，包括以下步骤：
1)制备质粒载体复合纳米微球：
在温和涡旋搅拌条件下，向pIRES2-EGFP-hBMP2、pDsRed2-N1-hOPG质粒的100μL PBS溶液中快速加入1mL质量浓度为30％的G5-PAMAM-D水溶液，混匀后，静置30min，得到pIRES2-EGFP-hBMP2-G5-PAMAM-D复合纳米微球和pDsRed2-N1-hOPG-G5-PAMAM-D复合纳米微球；
2)配制壳层溶液和芯层溶液：
配制壳层溶液：将聚己内酯(PCL，分子量8万，粘度系数0.8dl/g)溶于二氯甲烷/N,N-二甲基甲酰胺混合溶剂中(v/v＝8：2)，配制成质量浓度为10％溶液；将步骤1)中制备好的pIRES2-EGFP-hBMP2-G5-PAMAM-D复合纳米微球加入质量浓度为10％的PCL溶液中，混匀，制成壳层溶液；
配制芯层溶液：将聚乙二醇(PEG，分子量4000)溶于去离子水，配制成质量浓度为10％(w/w)的溶液，将步骤1)中制备好的pDsRed2-N1-hOPG-G5-PAMAM-D复合纳米微球加入到质量浓度为10％的PEG水溶液中，充分混匀，制成芯层溶液；
3)同轴静电纺丝：
选用17/25G同轴针头，芯层针头内径为0.06mm，壳层针头内径为0.2mm以壳层流速2mL/h，芯层流速0.5mL/h，电压15KV，距离15cm为条件进行静电纺丝，制得用于牙周组织的生物支架材料样品，将制备好的样品室温下在真空干燥机中干燥24h。
实施例2
一种用于牙周组织的生物支架材料的制备方法，包括以下步骤：
1)制备质粒载体复合纳米微球：
在温和涡旋搅拌条件下，向pIRES2-EGFP-hBMP2、pDsRed2-N1-hOPG质粒的100μL PBS溶液中分别快速加入500μL浓度为20％的G5-PAMAM-D水溶液，混匀后，静置30min，得到pIRES2-EGFP-hBMP2-G5-PAMAM-D复合纳米微球和pDsRed2-N1-hOPG-G5-PAMAM-D复合纳米微球；
2)配制壳层溶液和芯层溶液：
配制壳层溶液：将聚己内酯溶于二氯甲烷/N,N-二甲基甲酰胺混合溶剂中(v/v＝8：2)配制成质量浓度为15％(w/w)溶液；将步骤1)中制备好的pIRES2-EGFP-hBMP2-G5-PAMAM-D复合纳米微球加入到质量浓度为15％的聚己内酯溶液中，混匀，制成壳层溶液；
配制芯层溶液：将聚乙二醇(PEG，分子量4000)溶于去离子水，配制成质量浓度为12％的水溶液，将步骤1)中制备好的pDsRed2-N1-hOPG-G5-PAMAM-D复合纳米微球加入到浓度为12％的PEG水溶液中，充分混匀，制成芯层溶液；
3)静电纺丝：
选用17/25G同轴针头，芯层针头内径为0.4mm，壳层针头内径为1.5mm以壳层流速0.5mL/h，芯层流速0.1mL/h，电压6KV，针头与接收板距离10cm为条件进行静电纺丝，制得用于牙周组织的生物支架材料样品，将制备好的样品在20℃下，在真空干燥机中干燥20h。
实施例3
一种用于牙周组织的生物支架材料的制备方法，包括以下步骤：
1)制备质粒载体复合纳米微球：
在温和涡旋搅拌条件下，将pIRES2-EGFP-hBMP2、pDsRed2-N1-hOPG质粒的100μL PBS溶液中快速加入200μL10％G5-PAMAM-D溶液，混匀后，静置30min，得到pIRES2-EGFP-hBMP2-G5-PAMAM-D复合纳米微球和pDsRed2-N1-hOPG-G5-PAMAM-D复合纳米微球；
2)配制壳层溶液和芯层溶液：
配制壳层溶液：将聚乳酸溶于二氯甲烷/N,N-二甲基甲酰胺混合溶剂中(v/v＝8：2)配制成质量浓度为15％的溶液；将步骤1)中制备好的pIRES2-EGFP-hBMP2-G5-PAMAM-D复合纳米微球加入到浓度为15％的聚乳酸溶液中，混匀，制成壳层溶液；
配制芯层溶液：将聚乳酸-羟基乙酸溶于去离子水，配制成浓度为15％(w/w)溶液，将步骤1)中制备好的pDsRed2-N1-hOPG-G5-PAMAM-D复合纳米微球加入到浓度为15％的聚乳酸-羟基乙酸水溶液中，充分混匀，制成芯层溶液；
3)静电纺丝：
选用17/25G同轴针头，芯层针头内径为1mm，壳层针头内径为2mm以壳层流速15mL/h，芯层流速1mL/h，电压30KV，针头与接收板距离30cm为条件进行静电纺丝，制得用于牙周组织的生物支架材料样品，将制备好的样品在15℃下，在真空干燥机中干燥30h。
下面对本发明制得的生物支架材料进行效果验证试验：
将实施例1制得的生物支架材料进行扫描电镜，照片参见图2，从图中可以看出，该生物支架材料纤维表面光滑，直径均一，无缺陷结构。
对该生物材料的机械性能进行测试，结果如下表1所示：
表1 本发明制得的生物支架材料机械性能测试结果
可以看出，该生物支架材料机械性能优良，因此能够与细胞外基质(ECM)相适应，可满足伤口敷料、药物缓释载体、GTR膜以及组织工程支架的要求。转染效率：壳层质粒7.42±1.23％；芯层质粒6.59±1.09％。
此外，该生物支架材料的降解曲线如图3所示，该生物支架材料降解可持续50天以上，释放的质粒高效率转染入细胞。其中壳层降解速度快，芯层缓慢，两层携带的质粒有序转染表达相应生长因子。
本发明将两种基因整合在一起，构成了铅笔样芯-壳结构，使两种基因有序释放，更好的调节转染过程，达到良好效果。更有可能将此产品应用于牙周病的治疗，产生新骨。
Claims (6)
1.一种用于牙周组织的生物支架材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)制备基因质粒载体复合纳米微球
将含有人骨保护素基因质粒的PBS溶液和人骨形态发生蛋白-2基因的PBS溶液分别加入基因载体溶液中，充分混匀后静置，得到人骨保护素基因质粒载体复合纳米微球和人骨形态发生蛋白-2基因质粒载体复合纳米微球；
其中，含有人骨保护素基因质粒的PBS溶液和人骨形态发生蛋白-2基因的PBS溶液与基因载体溶液的体积比均为1：(2～10)；
人骨保护素基因质粒的PBS溶液和人骨形态发生蛋白-2基因的PBS溶液中，基因质粒的用量为0.1～5mg/mL；
2)配制壳层纤维溶液和芯层纤维溶液
将人骨保护素基因质粒载体复合纳米微球和人骨形态发生蛋白-2基因质粒载体复合纳米微球分别溶于质量浓度为10％～15％的可降解的有机高分子溶剂中，制得壳层溶液和芯层溶液；
3)同轴静电纺丝
将壳层溶液和芯层溶液以同心排列的不同内径的针头进行静电纺丝，得到用于牙周组织的生物支架材料。
2.根据权利要求1所述的一种用于牙周组织的生物支架材料的制备方法，其特征在于，所述人骨保护素基因质粒为pDsRed2-N1-hOPG，所述人骨形态发生蛋白-2基因为pIRES2-EGFP-hBMP2；所述基因载体溶液为质量浓度为20％～50％的G5-PAMAM-D水溶液。
3.根据权利要求1所述的一种用于牙周组织的生物支架材料的制备方法，其特征在于，所述壳层溶液采用的可降解的有机高分子溶剂为聚乳酸、聚己内酯或聚乳酸-羟基乙酸溶于有机溶剂中制成，其中，有机溶剂为二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺按体积比8：2配成的混合溶液；
所述芯层溶液采用的可降解的有机高分子溶剂为聚乳酸、聚己内酯、聚乙二醇或聚乳酸-羟基乙酸溶于水中制成。
4.根据权利要求1所述的一种用于牙周组织的生物支架材料的制备方法，其特征在于，步骤3)所述的以不同内径的针头进行静电纺丝时采用的芯层针头内径为0.06～1mm，壳层针头内径为0.2～2mm。
5.根据权利要求1所述的一种用于牙周组织的生物支架材料的制备方法，其特征在于，所述静电纺丝的条件为：芯层纤维溶液流速为0.1～1mL/h，壳层纤维溶液流速为0.5～15mL/h，针头与接收板距离为10～30cm，电压为6～30kv。
6.根据权利要求1所述的一种用于牙周组织的生物支架材料的制备方法，其特征在于，还包括对得到的牙周组织的生物支架材料进行干燥的步骤，具体为：在温度为15～25℃下，真空干燥20～30h。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
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Granted publication date: 20151014 Termination date: 20170624 |