CN102836440A - 一种多肽修饰的脑靶向纳米基因递释系统及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属生物技术领域，涉及一种狂犬病毒糖蛋白衍生多肽修饰的脑靶向纳米基因递释系统及其制备方法。本发明采用狂犬病毒糖蛋白衍生肽RVG29作为脑靶向头基，阳离子树枝状大分子为载体材料，通过亲水性聚合物连接RVG29多肽构建脑靶向载体；脑靶向载体再通过静电复合作用与编码特定基因的质粒DNA复合，制成所述的脑靶向纳米基因递释系统。本发明能增加纳米基因递释系统在体外血脑屏障模型的摄取和穿过效率，提高纳米基因递释系统在动物脑内的蓄积，提高报告基因在脑内的表达量，实现基因跨过血脑屏障向脑内的递释，为诊断和治疗基因的脑部应用提供了一种高效和安全的策略。

Description

一种多肽修饰的脑靶向纳米基因递释系统及其制备方法
技术领域
本发明属生物技术领域，涉及一种多肽修饰的脑靶向纳米基因递释系统，具体涉及一种狂犬病毒糖蛋白衍生多肽修饰的脑靶向纳米基因递释系统及其制备方法。
背景技术
研究显示，血脑屏障的存在对于维持中枢神经系统的稳态有着至关重要的作用，但同时，其也阻碍了诊断或治疗药物向脑内的有效递送。现代医学研究证实，血脑屏障的主要成分是脑毛细血管内皮细胞，其特点是细胞间有致密的紧密连接，绝大多数物质难以通过；而另外一方面，一些内源性的蛋白等营养物质可通过结合特定受体，利用受体介导的穿细胞作用，跨过血脑屏障，到达脑内；此外，一些病原体如狂犬病毒也可通过特定的受体，跨过血脑屏障，引起脑内感染。
有研究发现，一种由狂犬病毒糖蛋白衍生的29个氨基酸的多肽RVG29保留了与血脑屏障上特异受体结合的特性，因此采用RVG29多肽修饰药物递释系统，可实现高效的脑靶向递释；并且由于神经元细胞也表达有特异性的受体，RVG29修饰的药物递释系统跨过血脑屏障后，将有利于进一步靶向神经元，对于治疗神经系统疾病如神经退行性疾病等有重要意义。
聚酰胺胺树枝状分子(PAMAM)是近年来发展应用的一类新型阳离子树枝状聚合物大分子，其特征为纳米级的尺寸，表面有丰富氨基，一方面有利于进行进一步的修饰，另一方面由于其在生理条件下带有正点荷，可与负电性的质粒DNA复合，通过静电相互作用自组装成载基因纳米粒，起到保护质粒DNA在循环过程中不被酶类降解。有研究表明，通过亲水性聚合物可将阳离子树枝状大分子与脑靶向多肽进行连接，同时亲水性聚合物也可延长载基因纳米粒在体内的循环时间，减少网状内皮系统的非特异性摄取，减少非靶组织的摄取，进而降低给药系统的副作用。但目前脑部基因递释存在的种种局限，现急需一种新型的脑靶向纳米基因递释系统，该递释系统可增加纳米基因递释系统在体外血脑屏障模型的摄取和穿过效率，提高纳米基因递释系统在动物脑内的蓄积，进而提高报告基因在脑内的表达量，实现基因跨过血脑屏障向脑内的递释。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷和不足，提供一种多肽修饰的脑靶向纳米基因递释系统，尤其是一种狂犬病毒糖蛋白衍生多肽修饰的脑靶向纳米基因递释系统及其制备方法。本发明的递释系统为一种新型的狂犬病毒糖蛋白衍生肽RVG29修饰的阳离子树枝状大分子包载基因的脑靶向纳米基因递释系统。
本发明利用阳离子树枝状大分子材料的高度分枝特性，在其表面进行聚乙二醇PEG化修饰，既作为连接剂，利于后续靶向多肽的修饰，也可中和阳离子树枝状大分子表面的正电性，以降低其毒性，延长基因递释系统在体内的循环时间，同时使用极具临床应用潜力的脑靶向头基——RVG29多肽修饰阳离子树状大分子材料，增加纳米基因递释系统在体外血脑屏障模型的摄取和穿过效率，提高纳米基因递释系统在动物脑内的蓄积，进而提高报告基因在脑内的表达量，实现基因跨过血脑屏障向脑内的递释。
具体而言，本发明的一种多肽修饰的脑靶向纳米基因递释系统，其特征在于，由脑靶向载体和编码特定基因的质粒DNA构成，所述的脑靶向载体由阳离子树状大分子材料、亲水性聚合物和RVG29组成。
本发明中，采用狂犬病毒糖蛋白衍生肽RVG29作为脑靶向头基，阳离子树枝状大分子为载体材料，通过亲水性聚合物连接RVG29多肽构建新型脑靶向载体；所述的脑靶向载体再进一步通过静电复合作用与编码特定基因的质粒DNA复合，制成脑靶向纳米基因递释系统。
其中，
所述的脑靶向载体为RVG29修饰的树枝状大分子脑靶向载体，是以阳离子树枝状大分子材料、亲水性聚合物和RVG29多肽为组分，三者以共价方式连接制成；
所述的亲水性聚合物与阳离子树状大分子材料的分子比是1～20∶1；
所述的RVG29多肽与阳离子树状大分子材料的分子比为1～10∶1；
所述的脑靶向载体与质粒DNA复合的质量之比是3～10∶1；
所述的狂犬病毒糖蛋白衍生肽RVG29多肽(YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG)，具有SEQ ID NO.1的序列。
本发明中，所述的脑靶向载体通过下述方法制备：
阳离子树枝状大分子材料和亲水性聚合物以1∶1～20的分子比溶于pH值7.8～8.2磷酸盐缓冲液中，室温搅拌反应60～180分钟，两种分子中含有的基团发生特异性反应，生成阳离子树枝状大分子材料-亲水性聚合物，超滤法除去未反应的亲水性聚合物并更换为pH值6.8～7.2磷酸盐缓冲液；同时，RVG29多肽以1～10∶1的分子比与阳离子树状大分子材料-亲水性聚合物上的特异基团室温搅拌反应12～36小时后生成阳离子树状大分子材料-亲水性聚合物-RVG29，分子排阻色谱法除去未反应的RVG29多肽，制得脑靶向载体。
本发明中，所述的阳离子树枝状大分子材料选自树枝状聚赖氨酸(dendrigraftpoly-L-lysines DGLs，简称DGLs)和聚酰胺-胺(polyamidoamine，简称PAMAM)；
所述的亲水性聚合物为聚乙二醇(polyethyleneglycol，简称PEG)。
本发明中，将质粒DNA溶于50mM硫酸钠溶液中，所述脑载体溶液与DNA溶液以摩尔比3～10∶1混合后，涡旋30s，制得脑靶向纳米基因递释系统。
本法明的脑靶向纳米基因递释系统适用于将特定基因质粒经静脉给药形成，通过血脑屏障，递释入脑内。
本发明采用氢核磁共振技术对脑靶向载体进行结构鉴定，结果显示，所述的树状大分子与含有双功能基团的PEG(琥珀酰亚胺-PEG3500-马来酰亚胺)反应后在3.6ppm处出现PEG的特征吸收峰，表明树状大分子-PEG合成成功；树状大分子-PEG进一步与RVG29多肽反应后在2.2ppm至3.3ppm出现RVG29与PAMAM的质子峰，证明脑靶向载体三个成分均已连接成功。
本发明通过琼脂糖凝胶电泳对脑靶向载体包载质粒DNA的能力进行验证，结果显示，在载体与质粒DNA的质量比在10∶1时，未见明显DNA迁移，表明脑靶向载体可对质粒DNA进行完全包封，起到保护DNA的目的。
本发明的脑靶向基因递释系统与未修饰脑靶向头基的系统包载荧光标记的质粒DNA后，分别孵育脑毛细血管内皮细胞，荧光显微镜观察结果显示，脑靶向组的摄取明显高于非靶向组，且所述的摄取依赖于RVG29多肽修饰。
本发明的脑靶向基因递释系统孵育脑毛细血管内皮细胞后，对于内涵体进行染色，显示脑靶向基因递释系统主要通过内吞途径进入细胞。
本发明通过体外血脑屏障模型验证了放射标记的脑靶向基因递释系统的穿越脑毛细血管内皮细胞单层膜的效率显著过于非靶向组，而与此同时在实验整个过程中由脑毛细血管内皮细胞组成的单层血脑屏障模型保持完整。
本发明利用活体成像仪考察脑靶向基因递释系统在裸鼠体内分布特性，经尾静脉给药后，结果显示脑靶向组在脑部的蓄积明显高于非靶向组，结果表明，RVG29多肽可高效的介导脑靶向基因递释系统的入脑。
本发明所制备的载有报告基因绿荧光蛋白的脑靶向纳米基因递释系统经尾静脉给药后，表达48小时进行灌流和冰冻脑切片，荧光显微镜下观察绿荧光蛋白在脑内各区域的表达，结果显示，RVG29多肽修饰的脑靶向纳米基因递释系统可有效的介导报告基因在脑部各主要区域包括皮层、海马、纹状体和黑质的表达，表达量高于未修饰RVG29多肽的非靶向组。
本发明所制备的载有报告基因荧光素酶的脑靶向纳米基因递释系统经尾静脉给药后，表达48小时进行处死，取出脑组织，通过超声等步骤提取出荧光素酶后，加入过量的底物，通过化学发光系统，定量的与非靶向组比较报告基因的表达效率，结果显示，脑靶向基因递释系统可有效的介导报告基因在脑部的高表达。
本发明与现有技术相比，具有以下的优点及特征：
利用阳离子树枝状大分子材料的高度分枝特性，在其表面进行聚乙二醇PEG化修饰，既作为连接剂，利于后续靶向多肽的修饰，也可中和阳离子树枝状大分子表面的正电性，以降低其毒性，延长基因递释系统在体内的循环时间，同时使用极具临床应用潜力的脑靶向头基——RVG29多肽修饰阳离子树状大分子材料，增加纳米基因递释系统在体外血脑屏障模型的摄取和穿过效率，提高纳米基因递释系统在动物脑内的蓄积，进而提高报告基因在脑内的表达量，实现了基因跨过血脑屏障向脑内的递释，为诊断和治疗基因的脑部应用提供了一种高效和安全的策略。
附图说明
图1为本发明的核磁共振图谱，其中，A：PAMAM-PEG；B：PAMAM-PEG-RVG29。
图2显示了本发明凝胶电泳考察不同载体包载基因的纳米粒的迁移情况，其中，
M：核酸分子量标准；
A：质粒DNA；
B：PAMAM/DNA；
C：PAMAM-PEG/DNA；
D：PAMAM-PEG-RVG29/DNA。
图3显示了脑毛细血管内皮细胞(BCECs)对RVG29修饰前后的纳米粒的摄取情况比较，其中，
A：PAMAM-PEG/DNA在37℃的摄取图；
B：PAMAM-PEG-RVG29/DNA在37℃的摄取图；
C：PAMAM-PEG-RVG29/DNA在4℃的摄取图；
D：PAMAM-PEG/DNA在预孵育过量游离RVG29肽后的摄取图；
E：PAMAM-PEG-RVG29/DNA在预孵育过量游离RVG29肽后的摄取图。
图4为不同抑制剂对PAMAM-PEG-RVG29/DNA的脑毛细血管内皮细胞摄取影响的考察情况，其中，
A：PAMAM-PEG-RVG29/DNA的摄取图；
B：PAMAM-PEG-RVG29/DNA在预孵育过量游离GABA后的摄取图；
C：PAMAM-PEG-RVG29/DNA在预孵育过量游离GABA后的摄取图；
D：PAMAM-PEG-RVG29/DNA在预孵育过量乙酰胆碱后的摄取图；
E：PAMAM-PEG-RVG29/DNA在预孵育过量美加明后的摄取图；
F：PAMAM-PEG-RVG29/DNA在预孵育过量尼古丁后的摄取图；
G：PAMAM-PEG-RVG29/DNA在预孵育过量氧化苯砷后的摄取图；
H：PAMAM-PEG-RVG29/DNA在预孵育过量秋水仙碱后的摄取图；
I：PAMAM-PEG-RVG29/DNA在预孵育过量菲力平后的摄取图。
图5显示了激光共聚焦显微镜观察PAMAM-PEG-RVG29/DNA摄取15min和60min后在脑毛细血管内皮细胞中的分布情况，其中，
A：孵育15min后，酸性内体的荧光信号；
B：孵育15min后，PAMAM-PEG-RVG29/DNA的荧光信号；
C：孵育15min后，酸性内体与PAMAM-PEG-RVG29/DNA的荧光信号叠加图；
D：孵育60min后，酸性内体的荧光信号；
E：孵育60min后，PAMAM-PEG-RVG29/DNA的荧光信号；
F：孵育60min后，酸性内体与PAMAM-PEG-RVG29/DNA的荧光信号叠加图。
图6显示了在脑毛细血管细胞单层构成的体外血脑屏障模型上考察纳米粒的跨膜效率，其中，
A：125I标记的纳米的跨膜速率随时间变化曲线；
B：14C标记蔗糖清除体积随时间变化曲线。
图7显示了纳米基因递释系统在裸鼠体内的分布情况，其中，
A：经尾静脉给药80min后，PAMAM/DNA纳米粒的分布情况；
B：经尾静脉给药80min后，PAMAM-PEG-RVG29/DNA纳米粒的分布情况。
图8显示了定性考察不同纳米粒经尾静脉给药后绿荧光蛋白基因在Balb/c小鼠脑内的表达情况，其中，
A：PAMAM/DNA给药组，纹状体区域绿荧光蛋白表达情况；
B：PAMAM/DNA给药组，海马区域绿荧光蛋白表达情况；
C：PAMAM/DNA给药组，黑质区域绿荧光蛋白表达情况；
D：PAMAM-PEG/DNA给药组，皮层区域绿荧光蛋白表达情况；
E：PAMAM-PEG/DNA给药组，海马区域绿荧光蛋白表达情况；
F：PAMAM-PEG/DNA给药组，黑质区域绿荧光蛋白表达情况；
G：PAMAM-PEG/DNA给药组，皮层区域绿荧光蛋白表达情况；
H：PAMAM-PEG-RVG29/DNA给药组，皮层区域绿荧光蛋白表达情况；
I：PAMAM-PEG-RVG29/DNA给药组，海马区域绿荧光蛋白表达情况；
J：PAMAM-PEG-RVG29/DNA给药组，黑质区域绿荧光蛋白表达情况；
K：PAMAM-PEG-RVG29/DNA给药组，皮层区域绿荧光蛋白表达情况。
图9显示了定性考察不同纳米粒经尾静脉给药后虫荧光素酶基因在Balb/c小鼠体内表达情况，其中，
A：PAMAM/DNA，PAMAM-PEG/DNA和PAMAM-PEG-RVG29/DNA分别给药后，脑内的虫荧光素酶活性的比较，以光子数/毫克蛋白表示；
B：PAMAM/DNA，PAMAM-PEG/DNA和PAMAM-PEG-RVG29/DNA分别给药后，其他主要脏器包括心、肝、脾、肺和肾中虫荧光素酶活性的比较，以光子数/毫克蛋白表示。
具体实施方式
实施例1
取2mg聚酰胺-胺(PAMAM，77.35mg/ml甲醇溶液)于西林瓶中吹干，加入0.48mg聚乙二醇(MAL-PEG3500-NHS，1mg/ml 0.035M pH 8.0磷酸盐溶液)，二者摩尔比例为1∶2，于室温搅拌反应2h，NHS基团与PAMAM表面的氨基特异性的反应，制成聚酰胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEG)复合物溶液，MWCO 10000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未反应的聚乙二醇(PEG3500)，制成核磁共振氢谱表征载体的合成。
实施例2
取2mg聚酰胺-胺(PAMAM，77.35mg/ml甲醇溶液)于西林瓶中吹干，加入0.48mg聚乙二醇(MAL-PEG3500-NHS，1mg/ml 0.035M pH 8.0磷酸盐溶液)，二者摩尔比例为1∶2，于室温搅拌反应2h，NHS基团与PAMAM表面的氨基特异性的反应，制成聚酰胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEG)复合物溶液，MWCO 10000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未反应的聚乙二醇(PEG3500)，pH 7.0磷酸盐缓冲液复溶，加入0.23mg RVG29多肽(2mg/ml pH 7.0磷酸盐溶液)，与PAMAM摩尔比例为1∶1，室温搅拌反应24h，MAL基团与RVG29多肽半胱氨酸残基上巯基发生特异性的反应，制成聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽(PAMAM-PEG-RVG29)复合物，MWCO 10000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未反应的RVG29多肽，核磁共振氢谱表征靶向载体的合成，结果如图1所示。
实施例3
取2mg聚酰胺-胺(PAMAM，77.35mg/ml甲醇溶液)于西林瓶中吹干，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液复溶，制成载体溶液。将质粒DNA溶解在50mM硫酸钠溶液中，稀释成0.1mg/ml，使与聚酰胺-胺的摩尔比为1∶10，室温条件下涡旋30s，制成载基因的非靶向PAMAM/DNA纳米粒。
实施例4
取2.48mg聚酰胺-胺-聚乙二醇复合物溶液。将质粒DNA溶解在50mM硫酸钠溶液中，稀释成0.1mg/ml，使与聚酰胺-胺的摩尔比为1∶10，室温条件下涡旋30s，制成载基因的非靶向PAMAM-PEG/DNA纳米粒。
实施例5
取2.71mg聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽(PAMAM-PEG-RVG29)载体溶液。将质粒DNA溶解在50mM硫酸钠溶液中，稀释成0.1mg/ml，使与聚酰胺-胺的摩尔比为1∶10，室温条件下涡旋30s，制成载基因的靶向PAMAM-PEG-RVG29/DNA纳米粒。
实施例6
按照实施例4和实施例5法分别新鲜制备载基因的非靶向PAMAM/DNA和PAMAM-PEG/DNA纳米粒，以及靶向PAMAM-PEG-RVG29/DNA纳米粒；称取0.14g琼脂糖于三角烧瓶中，加入电泳液1×TAE，微波加热至沸，使琼脂糖完全溶解，室温放置约50度，加入10μl 500ug/ml溴乙啶，倒入电泳槽中，置入梳子，冷凝成凝胶。将各组样品加入至凝胶中，开启电源，电压为100V，约25min停止，紫外灯下观察载体对质粒DNA的包封效率，如图2所示，结果表明三种载体均可以有效包封质粒DNA，未见DNA迁移。
实施例7
小鼠脑毛细血管内皮细胞培养在含有20％胎牛血清，100单位/ml青霉素，100μg/ml链霉素，1％谷氨酰胺，0.01％神经营养因子和40单位/ml肝素钠注射液的DMEM培养基，在37度5％二氧化碳湿度条件下培养。
实施例8
将质粒溶液以氨基丁三醇-盐酸缓冲液(Tris*HCI，pH8.5)稀释至1mg/ml，核酸标记探针EMA以纯水稀释至0.1mg/ml，将质粒溶液与探针EMA稀释液按体积比1∶9混合，室温避光孵育30min，不时混匀。将混合液以小液滴的形式平铺于保鲜膜表面，置于紫外灯下(波长365nm)照射1h。收集混合液滴于离心管中，以移液器确定准确体积，加入适量无水乙醇，使混合液与乙醇的体积比为3∶7，适当涡旋，使其混合均匀，室温避光放置15min，以21，000g的离心力离心20min，使荧光标记的质粒EMA-DNA复合物沉淀，弃上清，沉淀以50mM硫酸钠溶液中复溶，稀释成0.1mg/ml，制成EMA-DNA溶液。
实施例9
取2mg聚酰胺-胺(PAMAM，77.35mg/ml甲醇溶液)于西林瓶中吹干，加入0.48mg聚乙二醇(MAL-PEG3500-NHS，1mg/ml 0.035M pH 8.0磷酸盐溶液)，二者摩尔比例为1∶2，于室温搅拌反应2h，NHS基团与PAMAM表面的氨基特异性的反应，制成聚酰胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEG)复合物溶液，MWCO 10000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未反应的聚乙二醇(PEG3500)；取2mg聚酰胺-胺(PAMAM，77.35mg/ml甲醇溶液)于西林瓶中吹干，加入0.48mg聚乙二醇(MAL-PEG3500-NHS，1mg/ml 0.035M pH 8.0磷酸盐溶液)，二者摩尔比例为1∶2，于室温搅拌反应2h，NHS基团与PAMAM表面的氨基特异性的反应，制成聚酰胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEG)复合物溶液，MWCO 10000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未反应的聚乙二醇(PEG3500)，pH 7.0磷酸盐缓冲液复溶，加入0.23mgRVG29多肽(2mg/ml pH 7.0磷酸盐溶液)，与PAMAM摩尔比例为1∶1，室温搅拌反应24h，MAL基团与RVG29多肽半胱氨酸残基上巯基发生特异性的反应，制成聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽(PAMAM-PEG-RVG29)复合物，MWCO 10000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未反应的RVG29多肽。
取2.48mg聚酰胺-胺-聚乙二醇复合物(PAMAM-PEG)溶液与EMA-DNA溶液复合，使与聚酰胺-胺的摩尔比为1∶10，室温条件下涡旋30s，制成载基因的非靶向的荧光标记的PAMAM-PEG/DNA纳米粒。
取2.71mg聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽(PAMAM-PEG-RVG29)载体溶液与EMA-DNA溶液混合，使与聚酰胺-胺的摩尔比为1∶10，室温条件下涡旋30s，制成载基因靶向荧光标记的PAMAM-PEG-RVG29/DNA纳米粒。
实施例10
将5万个脑毛细血管内皮细胞培养在24孔板上，48h后显微镜下观察汇合度，给予上述荧光标记的纳米粒孵育60min，用Hank’s液替换掉药液，荧光显微镜下观察各组中荧光标记纳米粒的摄取情况。
结果如图3中A和B所示，脑毛细血管内皮细胞对靶向纳米粒PAMAM-PEG-RVG29/DNA的摄取高于非靶向纳米粒PAMAM-PEG/DNA的摄取。
实施例11
将5万个脑毛细血管内皮细胞培养在24孔板上，48h后显微镜下观察汇合度，吸去培养基，加入290ul的RVG29多肽溶液(2mg/ml，Hank’s液)预孵育10min，吸去RVG29多肽溶液，分别加入非靶向的荧光标记的PAMAM-PEG/DNA纳米粒和靶向荧光标记的PAMAM-PEG-RVG29/DNA纳米粒溶液，继续孵育60min，用Hank’s液替换掉药液，荧光显微镜下观察荧光标记纳米粒的摄取情况。
结果如图3中D和E所示显示，脑毛细血管内皮细胞对靶向纳米粒PAMAM-PEG-RVG29/DNA的摄取明显减少，而对非靶向纳米粒PAMAM-PEG/DNA的摄取没有变化，结果表明，靶向纳米粒的入胞增加是由于RVG29多肽介导的。
实施例12
将5万个脑毛细血管内皮细胞培养在培养皿上，48h后显微镜下观察汇合度，将培养皿置于4℃冰箱中平衡20min，靶向荧光标记的PAMAM-PEG-RVG29/DNA纳米粒溶液同样置于4℃冰箱中平衡20min，加入靶向荧光标记的PAMAM-PEG-RVG29/DNA纳米粒溶液，继续在4℃孵育60min，用Hank’s液替换掉药液，荧光显微镜下观察荧光标记纳米粒的摄取情况。
结果如图3中C所示，脑毛细血管内皮细胞对靶向纳米粒PAMAM-PEG-RVG29/DNA的摄取在4℃时受到显著抑制。
实施例13
将5万个脑毛细血管内皮细胞培养在24孔板上，48h后显微镜下观察汇合度，吸去培养基，加入200ul的γ-氨基丁酸(GABA)溶液，乙酰胆碱(acetylcholine)溶液，美加明(mecamylamine)溶液，尼古丁(nicotine)溶液，氧化苯砷(phenylarsine)溶液，秋水仙碱(colchicine)溶液和菲力平(filipin)溶液预孵育10min。加入靶向荧光标记的PAMAM-PEG-RVG29/DNA纳米粒溶液，继续孵育60min，用Hank’s液替换掉药液，荧光显微镜下观察荧光标记纳米粒的摄取情况。
结果如图4所示，表明PAMAM-PEG-RVG29/DNA纳米粒的摄取显著受到GABA的影响，而基本不受乙酰胆碱受体激动剂或阻断剂乙酰胆碱，美加明和尼古丁的影响；此外，纳米粒的摄取受到氧化苯砷，秋水仙碱和菲力平的影响，表明PAMAM-PEG-RVG29/DNA纳米粒的入胞机制与网格蛋白、巨胞饮途径和小窝蛋白介导的内吞途径相关。
实施例14
将2万个脑毛细血管内皮细胞培养在培养皿中，48h后显微镜下观察汇合度，吸去培养基，加入靶向荧光标记的PAMAM-PEG-RVG29/DNA纳米粒溶液，分别孵育15min和60min，在孵育结束前10min，加入Lysotracker Green溶液，共孵育10min，用Hank’s液替换掉药液，激光共聚焦显微镜下观察荧光标记纳米粒和酸性内体的共定位情况。
结果显示，PAMAM-PEG-RVG29/DNA纳米粒入胞后主要存在于酸性内体中，分布于细胞浆内。
实施例15
在BH试剂(3ug)中加入125I约1mCi和适量氯胺T溶液，振荡反应10s-20s，迅速加入偏重亚硫酸钠溶液，NaI溶液，DMF溶液和苯适量，振摇，苯层合并，氮气吹干，测定放射性强度，适量PAMAM溶于硼酸盐缓冲液(01.M，pH8.5)，与125I标记的BH试剂周期性涡旋混合，冰上孵育15min，PBS(pH8.0)透析除去未反应的125I，得到放射性标记的PAMAM。
实施例16
取适量放射性标记的PAMAM，加入PEG3500，使二者的摩尔比为1∶2，室温反应两小时，MWCO 10000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未反应的PEG3500，pH 7.0磷酸盐缓冲液复溶，加入RVG29多肽，使多肽与PAMAM的摩尔比为1∶1，室温搅拌反应24h，MWCO 10000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未反应的RVG29多肽，得到放射性标记的PAMAM-PEG-RVG29溶液。
分别将同等放射性强度的125I标记的PAMAM与PAMAM-PEG-RVG29溶液与质粒DNA硫酸钠溶液复合，分别制备成放射标记的非靶向的PAMAM/DNA和靶向的PAMAM-PEG-RVG29/DNA纳米粒溶液。
实施例17
将5，000个脑毛细血管内皮细胞培养在Transwell小室中，72h后显微镜下观察汇合度，将适量培养基加入到Tanswell小室中，形成内外液面差，过夜培养，确定液面差维持。分别测定Transwell小室中四个位点的跨膜电阻，选取电阻平均，且大于200Ω的Transwell进行下述实验。吸去培养基，分别加入含有3ul(0.6uCi)14C标记的蔗糖的放射标记的PAMAM/DNA纳米粒溶液和含有3ul(0.6uCi)14C标记的蔗糖的放射标记的PAMAM-PEG-RVG29/DNA纳米粒溶液，分别在5min，10min，15min，30min，45min和60min吸取Transwell外培养液20ul，及时补足20ul，并在第60min时吸取Tranwell内药液20ul，测定各时间点样品的γ计数。取10ul测定液，加入1ml闪烁液，涡旋均匀，室温避光放置过夜，测定β计数。
结果如图6中B所示，证明在实验整个过程中由脑毛细血管内皮细胞组成的单层血脑屏障模型保持完整；同时，如图6A所示，PAMAM-PEG-RVG29/DNA纳米粒的跨血脑屏障模型效率显著高于非靶向的PAMAM/DNA纳米粒。
实施例18
将实施例9制备的荧光标记的非靶向纳米粒PAMAM/DNA与靶向纳米粒PAMAM-PEG-RVG29/DNA，经裸鼠尾静脉给药，剂量为50ug DNA/裸鼠，分别于给药后80min将裸鼠麻醉，使用小动物成像仪观察荧光标记的纳米粒在裸鼠体内的分布情况，成像结果如图7所示，经过RVG29多肽修饰的纳米粒可有效的蓄积于脑部。
实施例19
分别采用PAMAM，实施例1和实施例2制备的载体溶液与编码绿荧光蛋白(GFP)基因的质粒DNA(pEGFP-N2)复合，涡旋30s，制备成非靶向的PAMAM/DNA和PAMAM-PEG/DNA纳米粒以及靶向的PAMAM-PEG-RVG29/DNA纳米粒，经Balb/c小鼠尾静脉给药，剂量为50ug DNA/裸鼠，于给药后48h麻醉，心脏灌流，以200ml生理盐水灌注，再以4％多聚甲醛灌注，解剖取脑，继续在4℃的多聚甲醛溶液中固定24h，换以30％蔗糖溶液进行脱水，待脑组织沉于溶液底部，进行冰冻冠状切片，厚度为20um，切片后用DAPI进行细胞核染色，置于荧光显微镜下观察绿荧光蛋白表达情况，切片结果如图8所示，PAMAM-PEG-RVG29/DNA纳米粒给药组，脑部各区域包括海马，纹状体，黑质和皮层的报告基因表达量均高于非靶向纳米粒给药组。
实施例20
分别采用PAMAM，实施例1和实施例2制备的载体溶液与编码虫荧光素酶基因的质粒DNA(pGL-2)复合，涡旋30s，制备成非靶向的PAMAM/DNA和PAMAM-PEG/DNA纳米粒以及靶向的PAMAM-PEG-RVG29/DNA纳米粒，经Balb/c小鼠尾静脉给药，剂量为50ug DNA/裸鼠，于给药后48h采用颈椎脱臼法处死，分别在冰上取脑、心、肝、脾、肺和肾，置于5ml离心管中，剪碎，加入1ml组织细胞裂解液(CCLR)，采用组织细胞超声粉碎仪，将组织破碎成匀浆，去800ul匀浆置于1.5ml离心管中，在4℃12，000rpm下离心20min，取上清液600ml，40ul上清液与100ul虫荧光素酶活性分析底物混匀后采用光学发光计数仪测定每10s的计数之和，再分别利用蛋白测定试剂盒测定每个样品的蛋白量，每个样品的结果以计数/mg蛋白表示，结果如图9所示，PAMAM-PEG-RVG29/DNA纳米粒给药组脑内的单位蛋白中虫荧光素酶活性高于非靶向纳米粒给药组。
SEQUENCE LISTING
 
<110>  复旦大学
 
<120> 一种多肽修饰的脑靶向纳米基因递释系统及其制备方法
      
 
<130> 
 
<160>  1    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  29
<212>  PRT
<213>  Rabies virus
 
<400>  1
 
Tyr Thr Ile Trp Met Pro Glu Asn Pro Arg Pro Gly Thr Pro Cys Asp
1               5                   10                  15     
 
 
Ile Phe Thr Asn Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Asn Gly
            20                  25                 
 
 

Claims (10)

1.一种多肽修饰的脑靶向纳米基因递释系统，其特征在于，由脑靶向载体和编码特定基因的质粒DNA构成，所述的脑靶向载体由阳离子树状大分子材料、亲水性聚合物和狂犬病毒糖蛋白衍生肽RVG29组成。
2.按权利要求1所述的多肽修饰的脑靶向纳米基因递释系统，其特征在于，所述的脑靶向载体为RVG29修饰的树枝状大分子脑靶向载体，其中，以阳离子树枝状大分子材料、亲水性聚合物和RVG29多肽为组分，三者以共价方式连接。
3.按权利要求1所述的多肽修饰的脑靶向纳米基因递释系统，其特征在于，所述的脑靶向载体通过静电与编码特定基因的质粒DNA复合。
4.按权利要求1或2所述的脑靶向纳米基因递释系统，其特征在于，所述的脑靶向载体通过下述步骤制备：
阳离子树枝状大分子材料和亲水性聚合物以1∶1～20的分子比溶于pH值7.8～8.2磷酸盐缓冲液中，室温搅拌反应60～180分钟，生成阳离子树枝状大分子材料-亲水性聚合物，超滤法除去未反应的亲水性聚合物并更换为pH值6.8～7.2磷酸盐缓冲液；同时，RVG29多肽以1～10∶1的分子比与阳离子树状大分子材料-亲水性聚合物上的特异基团室温搅拌反应12～36小时后生成阳离子树状大分子材料-亲水性聚合物-RVG29，分子排阻色谱法除去未反应的RVG29多肽，制得脑靶向载体。
5.按权利要求1或2所述的脑靶向纳米基因递释系统，其特征在于，所述的亲水性聚合物与阳离子树状大分子材料的分子比是1～20∶1；
所述的RVG29多肽与阳离子树状大分子材料的分子比为1～10∶1。
6.按权利要求1或2所述的脑靶向纳米基因递释系统，其特征在于，所述的狂犬病毒糖蛋白衍生肽RVG29多肽具有SEQ ID NO.1的序列。
7.按权利要求1或2所述的脑靶向纳米基因递释系统，其特征在于，所述的阳离子树枝状大分子材料选自树枝状聚赖氨酸或聚酰胺-胺。
8.按权利要求1或2所述的脑靶向纳米基因递释系统，其特征在于，所述的亲水性聚合物为聚乙二醇PEG。
9.按权利要求3所述的脑靶向纳米基因递释系统，其特征在于，所述的脑靶向载体与质粒DNA复合的质量之比是3～10∶1。
10.权利要求1的脑靶向纳米基因递释系统的制备方法，其特征在于，其包括步骤：
将质粒DNA溶于50mM硫酸钠溶液中，所述脑载体溶液与DNA溶液以摩尔比3～10∶1混合后，涡旋30s，制得脑靶向纳米基因递释系统。
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