CN115813881A

CN115813881A - 脑靶向辛酸纳米颗粒包含其的药物及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN115813881A
Application number: CN202211548667.6A
Authority: CN
Inventors: 张茂; 周兴; 杨婧媛; 王盼; 徐杰丰
Original assignee: Zhejiang University ZJU; Chongqing University of Technology
Current assignee: Zhejiang University ZJU; Chongqing University of Technology
Priority date: 2022-12-05
Filing date: 2022-12-05
Publication date: 2023-03-21

Abstract

本发明提供了一种脑靶向辛酸纳米颗粒包含其的药物及其制备方法和用途，涉及生物靶向递送系统技术领域。所述脑靶向辛酸纳米颗粒为中性粒细胞包裹的辛酸纳米颗粒，所述中性粒细胞的细胞膜上修饰有跨越血脑屏障的功能性分子，所述跨越血脑屏障的功能性分子为RVG29肽。所述脑靶向辛酸纳米颗粒(RVG29‑H‑NP_OA)的膜涂层可以驱动RVG29‑H‑NP_OA归巢结合脑微血管内皮细胞，然后通过RVG29介导血脑屏障穿透，进一步向损伤部位募集并精确地将OA传递到损伤的脑细胞，以减轻心脏骤停/心肺复苏(CA/CPR)脑损伤和挽救其神经功能。

Description

脑靶向辛酸纳米颗粒包含其的药物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及生物靶向递送系统技术领域，尤其是涉及一种脑靶向辛酸纳米颗粒包含其的药物及其制备方法和用途。

背景技术

心脏骤停(CA)是导致人类死亡的主要原因之一，每年仅有1.0％～10％的患者存活出院。尽管CA后心肺复苏(CPR)成功，自主循环(ROSC)恢复，但大多数幸存者仍遭受以脑损伤为主的多器官损伤，仅有5％～17％的患者能避免长期严重的神经问题。CA/CPR后的脑损伤主要与缺血再灌注(I/R)损伤有关，即CA引起的脑供血突然受限，随后通过ROSC恢复血流和复氧。

由于这些病理生理过程启动了一系列的细胞反应，包括线粒体功能障碍、能量代谢障碍、有害代谢物积聚、自由基产生、炎性细胞因子上调、内皮细胞激活、免疫细胞迁移以及脑细胞坏死和凋亡，所以最终导致神经功能损害。尽管治疗性低温的应用取得了进展，但由于存在严重的不良反应，包括高血糖、心律失常和感染，其保护效果仍然很不理想。因此，迫切需要研究和开发CA/CPR所致脑I/R损伤的有效治疗方法。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种脑靶向辛酸纳米颗粒(RVG29-H-NP_OA)，所述脑靶向辛酸纳米颗粒为表达RVG29的中性粒细胞膜包裹的辛酸纳米颗粒，所述中性粒细胞的细胞膜上修饰有跨越血脑屏障的功能性分子。进而所述脑靶向辛酸纳米颗粒能够精确地将OA传递到损伤的脑细胞，以减轻心脏骤停/心肺复苏(CA/CPR)所导致的脑损伤。

具体的，申请人在研究发现，辛酸(OA)是一种富含于乳制品和椰子油中的中链单羧酸饱和脂肪酸，是一种能量底物，能以非酯化形式迅速渗透到线粒体膜并被代谢。越来越多的体内外研究表明，OA可通过抗氧化应激、抗炎、抗细胞凋亡等多种机制在多种疾病中发挥治疗作用，稳定线粒体功能，尤其是在I/R损伤中。

在大脑中，OA主要在星形胶质细胞中代谢，星形胶质细胞是中枢神经系统的主要管家细胞，具有多种调节功能。在脑I/R损伤中，星形胶质细胞可从静息状态转变为反应状态，释放大量炎性细胞因子、细胞毒性分子以及受损的线粒体，并破坏生理稳态，启动或加重神经元损伤。相比之下，正常星形胶质细胞可以增强共培养的缺氧/复氧(H/R)损伤神经元的存活和可塑性。

这些研究表明，星形胶质细胞是OA减轻脑I/R损伤的潜在治疗靶点，然而，OA在减轻I/R损伤方面的应用仍然受到其短的半衰期(<5分钟)以及与循环中白蛋白结合的严格挑战，这使得OA在脑中的利用非常少，浓度低至7.5nM。显然，向脑损伤细胞靶向输送OA是克服这一挑战的关键，这将为减轻I/R脑损伤提供一种有前途的策略。

同时，随着生物材料、纳米医学和药剂学的快速发展，药物跨血脑屏障靶向损伤部位给药逐渐显现出曙光。各种穿膜多肽和血脑屏障受体(BBR)特异性配体的发现和修饰，极大地提高了载药药物穿透血脑屏障的能力。

研究发现，狂犬病病毒糖蛋白衍生的29个氨基酸的多肽RVG29至少可以与烟碱型乙酰胆碱受体(NAchR)和GABA B受体结合，通过受体介导的跨细胞作用或小凹介导的能量依赖的内吞作用，将其修饰的靶物质通过血脑屏障输送到脑实质。

此外，细胞膜包裹的纳米粒子因其仿生特性而受到人们的关注，它为靶向穿过血脑屏障到达大脑焦点区域的纳米粒子提供了一种策略。在CA/CPR后的脑I/R损伤中，循环中的中性粒细胞可以通过膜上的黏附蛋白，如中性粒细胞上的整合素β-2和内皮细胞上表达的ICAM-1，在炎症初期进一步迁移到脑损伤部位。由于中性粒细胞归巢到脑并黏附于脑血管内皮细胞的过程，与纳米颗粒通过血脑屏障(BBB)转运的第一阶段非常相似，即纳米粒从血液中靶向脑并结合到BBB顶膜上的受体，然后在趋化因子浓度梯度的指导下，中性粒细胞选择性地募集到特定的损伤部位。这意味着在跨越BBB之后，纳米颗粒可以到达最需要它们的地方。

因此，我们制备包被中性粒细胞膜的辛酸纳米粒(H-NP_OA)，其能与BBB结合，并在穿过血脑屏障后靶向损伤细胞。

然而，中性粒细胞膜的辛酸纳米粒(H-NP_OA)仍有两个问题有待解决。其一是H-NP_OA仍然缺乏BBB-穿透能力，无法将BBB内外侧连接起来，从而实现中性粒细胞膜包裹纳米粒脑损伤靶向的完美效果。二是辛酸是一种脂类油，不易作为纳米药物负载。

有鉴于此，根据本发明的一个方面，本发明提供的一种脑靶向辛酸纳米颗粒(RVG29-H-NP_OA)，所述脑靶向辛酸纳米颗粒为中性粒细胞包裹的辛酸纳米颗粒，所述中性粒细胞的细胞膜上修饰有跨越血脑屏障的功能性分子。所述脑靶向辛酸纳米颗粒(RVG29-H-NP_OA)的膜涂层可以驱动RVG29-H-NP_OA归巢结合脑微血管内皮细胞，然后通过RVG29介导血脑屏障穿透，后进一步向损伤部位募集并精确地将OA传递到损伤的脑细胞，即接力靶向递送纳米疗法，以减轻心脏骤停/心肺复苏(CA/CPR)脑损伤和挽救其神经功能。

本申请通过研究确认接力靶向递送辛酸纳米疗法在CA/CPR大鼠后脑损伤的保护中的应用效果、并在此基础上进行该药物的产品研发及临床转化，将为临床心肺复苏救治提供一种新的重要医疗手段，具有很好的研究意义及应用前景。

在本发明的一种优选实施方式中，所述中性粒细胞包裹的辛酸纳米颗粒中的辛酸纳米颗粒为聚乙烯亚胺与辛酸共价结合得到的两亲性自组装辛酸纳米颗粒；

在本发明的一种优选实施方式中，细胞膜上修饰有跨越血脑屏障功能性分子的中性粒细胞主要由含有RVG29肽目的序列的PiggyBac转座子质粒与HL-60细胞经电转得到。

作为一种优选的实施方式，本申请将聚乙烯亚胺(PEI)和辛酸(OA)之间的多个非共价键结合起来，设计了一种两亲性超分子自组装OA纳米粒(NPOA)。随后，为了继承RVG29与nAchR结合并介导BBB穿透的能力，我们首次通过PiggyBac转座子系统制备了膜上高表达RVG29多肽的中性粒细胞，并将其用于构建表达RVG29的中性粒细胞膜包裹的OA纳米粒(RVG29-H-NP_OA)，用于向CA/CPR大鼠脑损伤细胞靶向传递OA。

优选地，所述RVG29肽目的序列如SEQ ID NO:1所示。

具体SEQ ID NO:1序列如下：“atggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctct gggttccaggttccactggtgacggtaactcgactatgggcagtggatacaccatttggatgcccgagaatccgagaccagggacaccttgtgacatttttaccaatagcagagggaagagagcatccaacgggggcagtggatctggatccggtggctcgagtgaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatgctgtgggccaggacacgcaggaggtcatcgtggtgccacactccttgccctttaaggtggtggtgatctcagccatcctggccctggtggtgctcaccatcatctcccttatcatcctcatcatgctttggcagaagaagccacgttag”；

在本发明的一种优选实施方式中，所述脑靶向辛酸纳米颗粒的粒径为80～200nm。

根据本发明的一个方面，一种脑靶向辛酸纳米颗粒的制备方法，所述制备方法包括：

(a)、提供细胞膜上修饰有跨越血脑屏障功能性分子的中性粒细胞，破碎提取细胞膜蛋白；

(b)、提供辛酸纳米颗粒，随后将步骤(a)提取的细胞膜蛋白与辛酸纳米颗粒混合后挤压，得到脑靶向辛酸纳米颗粒。

本发明提供的一种脑靶向辛酸纳米颗粒的制备方法，所述制备方法首先将细胞膜上修饰有跨越血脑屏障功能性分子的中性粒细胞破碎提取细胞膜蛋白；随后将细胞膜蛋白与辛酸纳米颗粒混合后挤压，得到脑靶向辛酸纳米颗粒。上述制备方法具有加工工艺简单，易于操作的优势。

在本发明的一种优选实施方式中，所述步骤(b)中辛酸纳米颗粒与细胞膜蛋白的混合质量比为5～10∶1，优选为8：1；

优选地，所述步骤(b)包括以下步骤：辛酸纳米颗粒与细胞膜蛋白以8：1的浓度混合，超声后，通过脂质体挤出仪反复挤压10次，得到脑靶向辛酸纳米颗粒。

根据本发明的一个方面，本发明提供的一种药物，所述药物包括上述脑靶向辛酸纳米颗粒；

本发明提供的一种药物，所述药物包括上述脑靶向辛酸纳米颗粒；由辛酸纳米颗粒的性质决定，上述药物可以精确地将辛酸传递到损伤的脑细胞，以减轻心脏骤停/心肺复苏所导致的脑损伤并挽救其神经功能。

优选地，所述药物还包括药学上可接受的赋形剂或辅料。

在本发明的一种优选实施方式中，所述药物的剂型为注射剂；

优选地，所述药物的给药途径为静脉给药。

根据本发明的一个方面，本发明提供的一种上述脑靶向辛酸纳米颗粒或上述药物在制备用于治疗或预防以下至少一种疾病或症状的药物中的用途：

心脏骤停所导致的缺血再灌注脑损伤；

心肺复苏所导致的缺血再灌注脑损伤。

本发明提供的脑靶向辛酸纳米颗粒或药物可以广泛应用于制备心脏骤停/心肺复苏所导致的脑损伤疾病的治疗药物中。

进一步的，所述缺血再灌注脑损伤包括脑星形胶质细胞损伤、脑海马组织促炎因子表达、脑海马神经元结构损伤。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提供的一种脑靶向辛酸纳米颗粒(RVG29-H-NP_OA)，所述脑靶向辛酸纳米颗粒为中性粒细胞包裹的辛酸纳米颗粒，所述中性粒细胞的细胞膜上修饰有跨越血脑屏障的功能性分子。所述脑靶向辛酸纳米颗粒(RVG29-H-NP_OA)的膜涂层可以驱动RVG29-H-NP_OA归巢结合脑微血管内皮细胞，然后通过RVG29介导血脑屏障穿透，后进一步向损伤部位募集并精确地将OA传递到损伤的脑细胞，即接力靶向递送纳米疗法，以减轻心脏骤停/心肺复苏(CA/CPR)脑损伤和挽救其神经功能。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1提供的RVG29表达的HL-60细胞的荧光显微镜观察图；

图2为本发明实施例1提供的WB检测RVG29的表达图；

图3为本发明实施例1提供的流式细胞术检测RVG29在细胞膜上的表达示意图；

图4为本发明实施例1提供的流式细胞术检测RVG29在HL60细胞膜上的表达图；

图5为本发明实施例1提供的RVG29-H-NP_OA的TME表征图；

图6为本发明实施例1提供的RVG29-H-NP_OA的粒径与zeta电位关系图；

图7为本发明实施例2提供的各实验组流式细胞术检测细胞内ROS含量示意图；

图8为本发明实施例2提供的各实验组酶标仪检测细胞LDH释放水平图；

图9为本发明实施例2提供的各实验组流式细胞术检测细胞凋亡水平图；

图10为本发明实施例3提供的RVG29-H-NPOA对大鼠CA/CPR后24小时海马星形胶质细胞损伤及炎症的影响图；

图11为本发明实施例3提供的海马CA1区H&E染色以及存活神经元计数图；

图12为本发明实施例3提供的各组动物24h存活率、脑功能及损伤标志物的变化图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行进一步地说明。

实施例1

(一)、RVG29表达的HL-60细胞的构建：

1.通过snapgene V5.2软件设计目的序列：atggagacagacacactcctgctatggg tactgctgctctgggttccaggttccactggtgacggtaactcgactatgggcagtggatacaccatttggatgcccgagaatccgagaccagggacaccttgtgacatttttaccaatagcagagggaagagagcatccaacgggggcagtggatctggatccggtggctcgagtgaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatgctgtgggccaggacacgcaggaggtcatcgtggtgccacactccttgccctttaaggtggtggtgatctcagccatcctggccctggtggtgctcaccatcatctcccttatcatcctcatcatgctttggcagaagaagccacgttag，由浙江美森细胞科技有限公司将目的序列与PiggyBac转座子质粒构建。

2.取状态良好的对数期生长的HL-60细胞，使用PBS重悬计数并取用1×106细胞至EP管，离心获得细胞沉淀。使用电转缓冲液重悬HL-60，并加入含目的序列的PiggyBac转座子质粒或对照质粒与PiggyBac转座酶辅助质粒充分混匀。对上述混合物进行电转。

3.将电转后的各组细胞分别转移至对应的培养器皿中，放置培养箱中培养，24h后观察细胞状态，并根据EGFP表达情况判断电转效率。

4.在细胞培养48h后，使用嘌呤霉素0.6μg/mL对电转后的HL-60进行药筛。药筛周期结束后，撤去含药培养基更换新鲜培养基，培养24-48h恢复细胞状态。

5.使用1/2药筛浓度的含药培养基，继续培养HL-60稳转细胞株进行扩大培养，得到RVG29表达的HL-60细胞。

图1为本实施例RVG29表达的HL-60细胞的荧光显微镜观察图；由图1可知，实验组PiggyBac转座子质粒与对照组转座子质粒均成功转入HL-60细胞中；

图2为本实施例中WB检测RVG29的表达图，由图2可知，RVG29在HL-60中成功表达；

图3为本实施例中流式细胞术检测RVG29在细胞膜上的表达示意图；

图4为本实施例中流式细胞术检测RVG29在HL60细胞膜上的表达图。

(二)、RVG29-H-NP_OA的制备：

1.NPOA的制备：取适量支化聚乙烯亚胺溶解于DMSO，vortex涡旋震荡混匀，使其充分溶解。取适量体积PEI溶液加入到3500Da的透析袋中，按质量比PEI：辛酸＝1:3吸取适量体积OA加入到透析袋中，适当吹打混匀。后置于2L超纯水中透析，每隔1h换一次超纯水，共透析8h，获得纳米粒NPOA。

2、RVG29-H-NPOA的制备：通过反复冻融破碎细胞，提取细胞膜，BCA检测膜蛋白浓度，将多聚物与膜蛋白浓度＝8:1混合，超声后，通过脂质体挤出仪反复挤压10次获得。后对RVG29-H-NPOA进行TEM形貌表征以及通过动态光散射法检测粒径与zeta电位。

所述超声的参数为：冰浴下超声3min(40w,开2s，关3s)；挤出参数：依次通过400nm、200nm和100nm的聚碳酸酯多孔膜重复挤压。

图5为本实施例RVG29-H-NP_OA的TME表征图；

图6为本实施例RVG29-H-NP_OA的粒径与zeta电位关系图。

实施例2

(一)、体外H/R损伤3D星形胶质细胞-BBB模型建立与分组：

1.采用人脑微血管内皮细胞系hCMEC/D3、大鼠星形胶质细胞系CTX TNA2以及大鼠脑微血管周细胞BMPC，在文献报道方法的基础上稍加修改来构建体外血脑屏障模型EPA。

2.接种细胞前，鼠尾I型胶原(10μg/cm²)室温下包被Transwell小室聚酯膜顶面、基底面与下室。先将BMPC以3×10⁴—9×10⁴个/cm²的细胞密度接种于小室聚酯膜基底面，于常氧细胞培养箱在5％CO₂ 37℃条件下牢固贴壁。然后将hCMEC/D3以6.0×10⁴个/cm²的细胞密度接种于小室聚酯膜顶面，CTX TNA2以0.5×10⁵个/cm²细胞数目接种于下室进行共培养。共培养次日起，BBB模型维持在EGM-2培养液中。共培养10d后，形成致密的细胞单层(跨内皮细胞电阻达到325±9Ωcm^-2)。根据FDA建议，TEER≥100Ωcm^-2用于体外血脑屏障药物转运的研究。

3.在进行后续实验时，将用于构建BBB的Transwell聚酯膜转移到另一个接种适宜密度CTX TNA2细胞的Transwell下室，由此构建星形胶质细胞-BBB模型。

4.基于星形胶质细胞-BBB模型，构建H/R损伤的BBB模型：缺氧复氧前，100ng/mLTNF-α处理hCMEC/D3细胞单层4h，后将星形胶质细胞-BBB体系更换无糖无血清DMEM培养基置于低氧工作站(氧浓度0.4％)中培养10h后，更换高糖10％FBS DMEM培养基，放入常氧培养箱(氧浓度21％)继续共培养14h。

(二)、星形胶质细胞-BBB体系随机化分组与干预：

1.实验分组：

低氧工作站中培养10h的后星形胶质细胞-BBB体系随机分为4组：Control组(n＝6)、H/R组(n＝6)、H/R+NaO组(n＝6)、H/R+RVG29-H-NPOA组(n＝6)

2.干预措施：

1)Control组：体系在常氧培养箱中使用常规培养基培养24h。

2)H/R组：缺氧过程结束后，Transwell上室更换含有等量溶媒的高糖10％FBSDMEM培养基，下室更换常规高糖10％FBS DMEM培养基进行复氧培养。

3)H/R+NaO组：缺氧过程结束后，Transwell上室更换含有等量溶媒溶解的0.5mM辛酸钠高糖10％FBS DMEM培养基，下室更换常规高糖10％FBS DMEM培养基进行复氧培养。

4)H/R+RVG29-H-NP_OA组：缺氧过程结束后，Transwell上室更换含有等量溶媒溶解的RVG29-H-NP_OA(辛酸终浓度为0.5mM)高糖10％FBS DMEM培养基，下室更换常规高糖10％FBS DMEM培养基进行复氧培养。

注：H/R为缺氧/复氧；NaO为辛酸钠。

(三)观察指标：

复氧培养过程结束后，对下室CTX TNA2细胞进行LDH释放、细胞内ROS含量以及凋亡水平检测。

图7为本实施例各实验组流式细胞术检测细胞内ROS含量示意图；

图8为本实施例各实验组酶标仪检测细胞LDH释放水平图；

图9为本实施例各实验组流式细胞术检测细胞凋亡水平图；

注：图中H/R为缺氧/复氧；NaO为辛酸钠；*P<0.05

如图7～9所示，经过H/R处理，Transwell下室CTX TNA2细胞内ROS含量明显增加；NaO与RVG29-H-NP_OA干预能不同程度的减少CTX TNA2细胞内的ROS含量，而与H/R+NaO组相比，H/R+RVG29-H-NP_OA组能更增加显著的降低ROS水平。LDH释放与细胞凋亡的检测也显示相同的趋势，H/R组CTX TNA2细胞LDH释放与凋亡细胞比率显著增加；相比H/R+NaO组，H/R+RVG29-H-NP_OA组能最显著减少CTX TNA2细胞LDH释放与凋亡细胞比率。组间比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。

实施例3动物实验：

(一)、动物准备：

1.所有动物在实验前12h时开始禁食、不禁水。

2.实验动物经由腹腔注射戊巴比妥钠45mg/kg进行麻醉，后续每小时追加10mg/kg进行麻醉维持。

3.迅速进行气管插管、呼气末二氧化碳分压(ETCO2)监测及机械通气，呼吸机参数设置：潮气量(tidal volume TV)：0.65ml/100g；呼吸频率：70次/min；FiO2：0.21；吸呼比：1:1.5。

4.手术暴露右侧股动、静脉，分别置入聚乙烯导管PE50，并用2.5IU/ml肝素钠生理盐水间歇冲洗，以测量动脉血压和建立静脉输液途径。

5.双上肢，左下肢连接心电图导联，经由心电监护仪记录平均动脉血压、标准II导联心电图(electrocardiogram ECG)和体温。核心温度由直肠温度探头监测，并使用加热灯维持。实验期间直肠温度维持在36.8±0.4℃。

(二)、模型建立：

1.模型条件设置：心脏骤停6min+心肺复苏10min。

2.心脏骤停方法：经皮心外膜电刺激诱导心室颤动，无干预观察6min。

3.心肺复苏方法：

1)连续性人工胸外按压；

2)使用呼吸机进行机械通气(在此期间其他机械通气参数不变，呼吸频率调整为100次/min，FiO2调整为1.0。)；

3)肾上腺素：心肺复苏开始时，予以20μg/kg，此后每2min重复1次；

4)除颤：心肺复苏2min时，予以4J电除颤1次；

5)若未恢复自主循环，立即重启心肺复苏2min后除颤1次，重复此循环≤5次，直至复苏成功或宣告失败。

4.复苏后监护4h：

1)重启机械通气(参数设置：潮气量(tidal volume TV)：0.65ml/100g；呼吸频率：70次/min；FiO2：0.21；吸呼比：1:1.5。)；

2)继续麻醉监护；3)维持38℃正常体温。

5.鼠笼观察20h。

(三)、动物随机化分组与干预：

1.实验分组

14周龄雄性Wistar大鼠，体重380-430g，ROSC后随机分为4组：Sham组(n＝8)、CPR组(n＝8)、CPR+NaO组(n＝8)、CPR+RVG29-H-NPOA组(n＝8)

2.干预措施

1)Sham组：不建立心脏骤停复苏模型，同其它组经静脉给予等量溶媒；

2)CA/CPR组：建立心脏骤停复苏模型，在ROSC后即刻，同其它组经静脉给予等量溶媒；

3)CA/CPR+NaO组：建立心脏骤停复苏模型，在ROSC后即刻，经静脉给予等量溶媒溶解的辛酸钠5mg/kg。

4)CA/CPR+RVG29-H-NPOA组：建立心脏骤停复苏模型，在ROSC后即刻，经静脉给予等量溶媒溶解的RVG29-H-NPOA(辛酸终浓度为5mg/kg)。

注：Sham，假手术；CPR，心肺复苏；NaO，辛酸钠。

(四)、观察指标

(1)、心肺复苏期间，连续动态监测心率、血压的变化，并记录各组动物的诱颤电流、心肺复苏时间、除颤次数、PC0、PC1以及PC2等情况。

各组动物的基本情况如下表所述：(均数±标准差)

注：PETCO2，呼气末二氧化碳分压；PC0：胸外按压即刻呼气末二氧化碳分压；PC1：胸外按压1分钟时呼气末二氧化碳分压；PC2：胸外按压2分钟时呼气末二氧化碳分压；Sham，假手术；CPR，心肺复苏；NaO，辛酸钠。

(2)、RVG29-H-NP_OA减轻CA/CPR后大鼠脑星形胶质细胞损伤及炎症反应

图10为RVG29-H-NP_OA对大鼠CA/CPR后24小时海马星形胶质细胞损伤及炎症的影响图。图10中A为海马CA1区区星形胶质细胞损伤和激活图；图10中B、C为逆转录-定量聚合酶链式反应检测海马炎性细胞因子肿瘤坏死因子TNF-α(B)、IL-1β(C)的影响图。

注：Sham，假手术；CA/CPR，心脏骤停/心肺复苏；NaO，辛酸钠；*P<0.05

由图10可知，相比sham组，CA/CPR组星形胶质细胞损伤与激活明显增多，而CA/CPR+NaO组能星形胶质细胞损伤与激活仅轻微减少；

相比CA/CPR+NaO组，CA/CPR+RVG29-H-NP_OA组能显著减少星形胶质细胞损伤与激活。

海马组织的炎症水平也显示相同的趋势，CA/CPR组相较于sham组，促炎细胞因子水平明显升高；

相比CA/CPR+NaO组，CA/CPR+RVG29-H-NP_OA组能最显著的减少促炎细胞因子TNF-α、IL-1β的水平；组间比较差异均有统计学意义(均P<0.05)，

(3)、RVG29-H-NP_OA对CA/CPR大鼠海马神经元结构损伤的改善作用

图11为海马CA1区H&E染色以及存活神经元计数图。

由图11可知，Sham组存活神经元排列整齐致密，胞核清晰可见，胞浆完整，轮廓清晰。CA/CPR组细胞层数减少，组织结构紊乱，核固缩碎裂，出现大量变形的锥体细胞，染色深染，边界模糊，神经元损伤严重。与Sham组比，CA/CPR后存活神经元数量显著减少。NaO与RVG29-H-NPOA处理组不同程度地减轻了神经元的损伤，海马区结构改善的趋势与靶向制剂减少星形胶质细胞的损伤、激活以及炎症因子水平结果相一致。

RVG29-H-NP_OA处理显著减轻了神经元的损伤，表现为神经元形态完整、整齐，颜色均匀，数量增加；组间比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。

(4)、RVG29-H-NPOA对CA/CPR大鼠24小时存活率和神经功能的改善

图12为本实施例各组动物24h存活率、脑功能及损伤标志物的变化图。图12中A为ROSC术后24小时累积生存期的Kaplan-Meier曲线；图12中B为24小时的NDS评分；图12中C、D为Elisa检测血清NDS与S100β水平图。

注：NSE，神经元特异性烯醇化酶；S100B，S100B蛋白；NDS，神经功能缺损评分；Sham，假手术；CA/CPR，心脏骤停/心肺复苏；NaO，辛酸钠；*P<0.05

由图12可知，Sham组所有的大鼠存活；CA/CPR组8只大鼠中有4只存活24小时；NaO组8只大鼠中有5只存活；RVG29-H-NP_OA组所有大鼠存活。NDS评分结果显示，CA/CPR组在ROSC后24小时存在严重的神经功能缺失，在所有治疗组中，大鼠的神经功能改善与图3所示的神经元损伤的减少趋势一致。CA/CPR大鼠的神经功能改善最显著的是RVG29-H-NP_OA干预组。血清NSE与S100β水平也显示相同的趋势，CA/CPR组血清NSE与S100β水平相较于Sham组明显升高，而RVG29-H-NP_OA干预能显著降低血清NSE与S100β水平；组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims

1.一种脑靶向辛酸纳米颗粒，其特征在于，所述脑靶向辛酸纳米颗粒为表达RVG29的中性粒细胞膜包裹的辛酸纳米颗粒；

所述中性粒细胞的细胞膜上修饰有跨越血脑屏障的功能性分子，所述跨越血脑屏障的功能性分子为RVG29肽。

2.根据权利要求1所述的脑靶向辛酸纳米颗粒，其特征在于，所述中性粒细胞包裹的辛酸纳米颗粒中的辛酸纳米颗粒为聚乙烯亚胺与辛酸共价结合得到的两亲性自组装辛酸纳米颗粒。

3.根据权利要求1所述的脑靶向辛酸纳米颗粒，其特征在于，细胞膜上修饰有跨越血脑屏障功能性分子的中性粒细胞主要由含有RVG29肽目的序列的PiggyBac转座子质粒与HL-60细胞经电转得到；

优选地，所述RVG29肽目的序列如SEQ ID NO:1所示。

4.根据权利要求1所述的脑靶向辛酸纳米颗粒，其特征在于，所述脑靶向辛酸纳米颗粒的粒径为80～200nm。

5.一种根据权利要求1～4任一项所述的脑靶向辛酸纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：

6.根据权利要求5所述的脑靶向辛酸纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤(b)中辛酸纳米颗粒与细胞膜蛋白的混合质量比为5～10：1，优选为8：1；

优选地，所述步骤(b)包括以下步骤：辛酸纳米颗粒与细胞膜蛋白以8：1的质量比混合，超声后，通过脂质体挤出仪反复挤压10次，得到脑靶向辛酸纳米颗粒。

7.一种药物，其特征在于，所述药物包括权利要求1～4任一项所述的脑靶向辛酸纳米颗粒；

优选地，所述药物还包括药学上可接受的赋形剂或辅料。

8.根据权利要求7所述的药物，其特征在于，所述药物的剂型为注射剂；

优选地，所述药物的给药途径为静脉给药。

9.一种根据权利要求1～4任一项所述的脑靶向辛酸纳米颗粒或权利要求7或8所述的药物在制备用于治疗或预防以下至少一种疾病或症状的药物中的用途：

心脏骤停所导致的缺血再灌注脑损伤；

心肺复苏所导致的缺血再灌注脑损伤。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述缺血再灌注脑损伤包括脑星形胶质细胞损伤、脑海马组织促炎因子表达、脑海马神经元结构损伤。