WO2019135407A1 - 神経障害性疼痛の処置および／または予防方法 - Google Patents

神経障害性疼痛の処置および／または予防方法 Download PDF

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stem cells
dental pulp
neuropathic pain
pulp stem
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朗仁 山本
田中　栄二
瑶 劉
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国立大学法人徳島大学
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    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]

Definitions

  • Pain is expressed by the International Pain Institute (IASP) as “the unpleasant sensation or discomfort expressed when any tissue damage actually occurs, or when tissue damage may occur, or upon such damage. It is defined as “emotional experience”. Pain is subjective and is classified into nociceptive pain and neuropathic pain according to its cause.
  • IASP International Pain Institute
  • Neuropathic pain was defined by IASP in 2011 as "pain caused by lesions and diseases of the somatosensory nervous system". For example, pathogenic pains such as cancer pain, diabetic neuropathy, postherpetic neuralgia, trigeminal neuralgia, those caused by nerve compression, and those caused by side effects caused by drugs such as anticancer agents are known. For neuropathic pain, it may be difficult for existing analgesics such as NSAIDs and opioids to be effective, and combinations of analgesic depressants such as antidepressants and antiepileptic drugs are considered. The development of effective neuropathic pain medications is urgently needed.
  • Dental pulp stem cells combine the properties of neural stem cells and bone marrow stem cells and produce a large amount of extracellular matrix and humoral factors.
  • Patent Documents 1 to 3 and Non-patent Document 1 disclose that a composition containing stem cells such as dental pulp stem cells and fat stem cells is useful for treating neurological diseases and pain.
  • Patent documents 4 and 5 disclose that the culture supernatant of dental pulp stem cells is effective for the treatment of a lesion and an inflammatory disease.
  • Patent documents 6 and 7 and non-patent documents 2 and 3 show that MCP-1 and sSiglec-9 produced by dental pulp stem cells interact with chondroitin sulfate present at the site of inflammation to induce M2 macrophages and M2 macrophages It discloses the production of various trophic factors and immunoregulatory factors and regeneration of tissues.
  • Matsubara K Matsushita Y, Sakai K, Kano F, Kondo M, Noda M, Hashimoto N, Imagama S, Ishiguro N, Suzumura A, Ueda M, Furukawa K, Yamamoto A. Secreted ectodomain of sialic acid-binding Ig-like lectin -9 and monocyte chemoattractant protein-1 promote recovery after rat spinal cord injury by altering macrophage polarity. J Neurosci. 2015; 35: 2452-2464.
  • the present application aims to provide new methods for the treatment and / or prevention of neuropathic pain.
  • the present inventors have found that the culture supernatant of dental pulp stem cells is effective in the treatment and / or prevention of neuropathic pain.
  • the present application provides a composition for treatment and / or prevention of neuropathic pain comprising a culture supernatant of dental pulp stem cells.
  • the present application provides a method of producing a composition for treatment and / or prevention of neuropathic pain, comprising culturing dental pulp stem cells and collecting the culture supernatant.
  • the present disclosure provides new methods of treating and / or preventing neuropathic pain.
  • FIG. 6 shows the effect of dental pulp stem cell culture supernatant (SHED-CM) on pain in neuropathic pain model rats.
  • SHED-CM dental pulp stem cell culture supernatant
  • Pulp stem cells means somatic stem cells derived from dental pulp.
  • Dental pulp stem cells can be derived from permanent teeth or primary teeth.
  • dental pulp stem cells are derived from deciduous primary teeth.
  • the dental pulp stem cells are preferably derived from the same species as the subject to which the composition is applied (for example, if the subject is a human, human dental pulp stem cells are used), more preferably autologous dental pulp stem cells.
  • Dental pulp stem cells can be sorted as adherent cells in dental pulp cells. That is, dental pulp stem cells can be adherent cells or their passage cells contained in dental pulp cells collected from primary teeth and permanent teeth. Alternatively, dental pulp stem cells established as a cell line may be used. Alternatively, dental pulp stem cells differentiated from pluripotent stem cells such as iPS cells and ES cells may be used.
  • Dental pulp stem cells may have at least one gene that has been artificially modified or introduced, as long as its culture supernatant has the same effect on neuropathic pain as that of dental pulp stem cells.
  • one, two, three, four or more genes may be introduced for the purpose of immortalizing dental pulp stem cells.
  • the effect of such culture supernatant of dental pulp stem cells on neuropathic pain can be evaluated, for example, by supplying the culture supernatant to an evaluation system for neuropathic pain and evaluating the effect on neuropathic pain. .
  • an evaluation system of neuropathic pain for example, the method described in the example of the present application can be used.
  • the “culture supernatant of dental pulp stem cells” is a supernatant of a culture fluid obtained by culturing dental pulp stem cells.
  • the culture supernatant is substantially free of cellular components (pulp stem cells or dental pulp cells).
  • the present composition is typically a composition that is free of dental pulp stem cells and dental pulp cells, and is composed of only the culture supernatant of dental pulp stem cells.
  • Cellular components are removed by separating out cellular components after culture. Separation of cellular components from the culture medium can be carried out by methods known to those skilled in the art. Furthermore, various treatments (eg, centrifugation, concentration, substitution of solvent, dialysis, freezing, drying, lyophilization, dilution, desalting, storage, etc.) may be appropriately performed on the culture solution.
  • a basic medium for culture of dental pulp stem cells, it is possible to use a basic medium, or a basic medium to which serum or the like is added.
  • a basic medium in addition to DMEM, Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) (GIBCO, etc.), Ham's F12 medium (HamF12) (SIGMA, GIBCO, etc.), RPMI 1640 medium, etc. can be used. Two or more basic media may be used in combination.
  • IMDM Iscove's modified Dulbecco's medium
  • Ham's F12 medium HamF12
  • RPMI 1640 medium etc.
  • Two or more basic media may be used in combination.
  • a culture medium in which IMDM and HamF12 are mixed in equal amounts for example, commercially available as trade name: IMDM / HamF12 (GIBCO)
  • IMDM / HamF12 a culture medium in which IMDM and HamF12 are mixed in equal amounts
  • the medium may be supplemented with any component that does not inhibit the survival and / or proliferation of dental pulp stem cells.
  • components that can be added to the medium include serum (fetal bovine serum, human serum, sheep serum, etc.), serum substitute (Knockout serum replacement (KSR), etc.), bovine serum albumin (BSA), antibiotics, various vitamins, Various minerals can be mentioned.
  • the composition is free of serum.
  • a serum-free culture supernatant can be prepared. It is also possible to obtain serum-free culture supernatant by carrying out one or more subcultures and culturing the last or last several subcultures in serum-free medium.
  • a culture supernatant free of serum can also be obtained by removing serum from the collected culture supernatant using dialysis or solvent substitution with a column.
  • the conditions usually used for stem cells can be applied as they are or by appropriately changing them.
  • Production of a culture supernatant of dental pulp stem cells can be appropriately performed by those skilled in the art.
  • the culture supernatant may be obtained by the following operation.
  • adherent cells selected from dental pulp are cultured in the above-described medium.
  • adherent cell culture dishes are seeded in adherent cell culture dishes and cultured in an incubator adjusted to appropriate conditions (eg, 5% CO 2 , 37 ° C.).
  • subculture is performed 1 to 8 times, and grown to the required cell number (eg, about 1 ⁇ 10 7 cells / ml).
  • Detachment of cells from the culture vessel can be carried out by a conventional method such as trypsin treatment. After the above culture, cells may be recovered and stored (eg, at 4 ° C. or -198 ° C.).
  • the culture supernatant collected when a sufficient number of dental pulp stem cells have been cultured for a sufficient time is used for the present composition.
  • the medium is added to dental pulp stem cells at about 70 to 100% confluency, preferably about 80 to 90% confluency, and about 12 to 72 hours, about 36 to 60 hours, about 42 to 54 hours, or about 46 to 50 hours.
  • the culture supernatant is recovered.
  • dental pulp stem cells are cultured to about 80-90% confluence, washed, serum free medium is added, cultured for about 48 hours, and the culture supernatant is recovered.
  • the culture supernatant can be collected using, for example, a dropper or a pipette.
  • the collected culture supernatant is used as an active ingredient of the present composition as it is or after one or more treatments.
  • the treatment here, centrifugation, concentration, substitution of solvent, dialysis, freezing, drying, lyophilization, dilution, desalting, storage (eg, 4 ° C., -80 ° C.) can be exemplified.
  • the main culture supernatant can also be subjected to concentration processing as appropriate. That is, the main culture supernatant may be a concentrate.
  • concentration method can be appropriately selected and used by those skilled in the art from known methods.
  • the main culture supernatant may be subjected to a lyophilization treatment. That is, the main culture supernatant may be a lyophilizate.
  • neuropathic pain refers to pain caused by a lesion or disease in the nervous system from somatic sensory nerves that transmit noxious information to the cerebrum.
  • the lesion or disease may be in the central nervous system or in the peripheral nervous system.
  • Lesions of the nervous system include lesions with irreversible anatomic changes (such as injury) and lesions without irreversible anatomic changes (such as compression).
  • the lesion or disease is present in peripheral nerves (ie, somatic sensory nerves).
  • neuropathic pain examples include cancer pain, drug pain, pain due to diabetes, trigeminal neuralgia, cervical spondylosis, sciatica, low back pain, pain after spinal injury or stroke, chronic pain due to nerve root compression
  • the neuropathic pain is cancer pain, drug pain, pain due to diabetes or sciatica.
  • the neuropathic pain is sciatica.
  • Neuropathic pain may or may not be accompanied by nociceptive pain.
  • Nociceptive pain is defined as pain caused by exciting a nociceptor due to substantial or potential injury to living tissues other than nerve tissue, and pain and inflammatory pain caused by thermal stimulation, mechanical stimulation, chemical stimulation, etc. including.
  • neuropathic pain is not accompanied by nociceptive pain.
  • treat or “treatment” refers to reducing or eliminating the cause of neuropathic pain, delaying or halting its progression in a subject having neuropathic pain, And / or to reduce, alleviate, ameliorate or eliminate the symptoms.
  • preventing refers to a neuropathic pain in a subject, particularly in a subject who is likely to develop neuropathic pain but has not yet developed it. It means preventing the onset or reducing the likelihood of developing neuropathic pain.
  • Subjects who may develop neuropathic pain but have not yet developed include, for example, subjects with lesions (eg, compression) or disease in the nervous system from somatic sensory nerves to the cerebrum.
  • the composition may include macromolecular compounds such as proteins secreted by dental pulp stem cells in culture, as well as small molecule organic compounds.
  • the composition may also include components from the culture medium.
  • the composition may take the form of liquid (liquid, gel, etc.) and solid (powder, fine, granular etc.) forms.
  • the composition can take various known pharmaceutical forms depending on the type of disease, the characteristics of the individual having the disease, the administration method and the dose.
  • solid agents such as suppositories, liquid injections (intravenous / muscle injection), injections And liquid preparations such as drops, eye drops, sprays, lotions, creams, topical preparations such as patches, and the like.
  • the composition can include known pharmaceutically acceptable salts. Those skilled in the art can make appropriate formulations.
  • the composition is in the form of a formulation for intravenous administration.
  • the composition may contain other pharmaceutically acceptable ingredients (eg, carriers, excipients, disintegrants, buffers, emulsifiers, suspensions, soothing agents, stabilizers) depending on the type of disease and the form of preparation. Preservatives, preservatives, saline etc.).
  • the excipient lactose, starch, sorbitol, D-mannitol, sucrose or the like can be used.
  • the disintegrant starch, carboxymethylcellulose, calcium carbonate and the like can be used.
  • As a buffer, phosphate, citrate, acetate and the like can be used.
  • As an emulsifier gum arabic, sodium alginate, tragacanth etc. can be used.
  • glycerin monostearate, aluminum monostearate, methylcellulose, carboxymethylcellulose, hydroxymethylcellulose, sodium lauryl sulfate and the like can be used.
  • benzyl alcohol, chlorobutanol, sorbitol or the like can be used.
  • propylene glycol, ascorbic acid and the like can be used.
  • preservatives phenol, benzalkonium chloride, benzyl alcohol, chlorobutanol, methyl paraben and the like can be used.
  • benzalkonium chloride, p-hydroxybenzoic acid, chlorobutanol and the like can be used.
  • Antibiotics, pH adjusters, growth factors eg, epidermal growth factor (EGF), nerve growth factor (NGF), brain derived neurotrophic factor (BDNF)
  • growth factors eg, epidermal growth factor (EGF), nerve growth factor (NGF), brain derived neurotrophic factor (BDNF)
  • growth factors eg, epiderma
  • the administration route of the present composition is not particularly limited.
  • Various known administration forms can be adopted according to the application site and the target disease.
  • parenteral administration may be systemic or local. More specifically, it includes injection, application or spray to the site of a lesion or disease.
  • intravenous administration, intraarterial administration, intraportal administration, intradermal administration, subcutaneous administration, intramuscular administration, intraperitoneal administration, intranasal administration, oral administration and the like can be mentioned.
  • the composition is administered intravenously.
  • the dosage of the present composition is not particularly limited. It can be set in consideration of the sex, age, weight, pathological condition etc. of the subject. For example, a culture supernatant of about 0.01 to about 100 ml / kg body weight, about 0.1 to about 50 ml / kg body weight, about 0.5 to about 30 ml / kg body weight, or about 1 to about 10 ml / kg body weight To be administered. Alternatively, for example, a culture of about 0.01 to about 500 mg / kg body weight, about 0.1 to about 300 mg / kg body weight, about 1 to about 100 mg / kg body weight, or about 5 to about 50 mg / kg body weight by dry weight Allow the supernatant to be administered.
  • the subject's sex, age, weight, pathological condition and the like can be considered in the preparation of the administration schedule.
  • the composition may be administered once or multiple times. In the case of multiple administration, for example, once to several times a day, once every 2 to 7 days, once a week to several weeks, once every 1 month to several months may be administered. In one embodiment, the composition is administered once.
  • the subjects to which the present composition is applied include mammals including humans (pets, livestock, laboratory animals, etc.). For example, besides humans, dogs, cats, rabbits, mice, cows, pigs, goats, sheep, horses, monkeys, guinea pigs, rats and mice and the like can be mentioned.
  • the present application provides a method of producing the present composition, which comprises culturing dental pulp stem cells and recovering the culture supernatant.
  • the culture of dental pulp stem cells and the recovery of the culture supernatant can be carried out as described above, but not limited thereto, any method known to those skilled in the art may be used.
  • This production method further includes the steps of obtaining dental pulp cells from primary teeth or permanent teeth, selecting and obtaining adherent cells contained in the dental pulp cell population as dental pulp stem cells, and a conventional preparation known to those skilled in the art. It may include a step of conversion, for example, a step of processing the culture supernatant, a step of adding pharmaceutically acceptable other components, and / or a step of preparing the culture supernatant into various formulation forms.
  • the present application provides a method for treating and / or preventing neuropathic pain comprising administering to a subject an effective amount of a culture supernatant of dental pulp stem cells.
  • the present application provides the use of a culture supernatant of dental pulp stem cells for the treatment and / or prevention of neuropathic pain.
  • the present application provides the use of a culture supernatant of dental pulp stem cells for the manufacture of a medicament for the treatment and / or prevention of neuropathic pain.
  • a composition for treatment and / or prevention of neuropathic pain which comprises a culture supernatant of dental pulp stem cells.
  • the composition according to item 1 wherein the dental pulp stem cells are derived from primary teeth.
  • the composition according to item 1 or 2 wherein the dental pulp stem cells are autologous dental pulp stem cells.
  • the composition according to any one of Items 1 to 3 which does not contain dental pulp stem cells.
  • the composition according to any one of Items 1 to 4 which does not contain serum.
  • neuropathic pain is cancer pain, drug pain, pain due to diabetes, trigeminal neuralgia, cervical spondylosis, sciatica, back pain, pain after spinal injury or stroke, or chronic pain due to nerve root compression
  • the results are shown in FIG.
  • the neuropathic pain model rat was hypersensitive and showed intense avoidance behavior when the paralyzed lower limb was stimulated with a von-Frey hair of 4 mm in diameter.
  • the hypersensitivity state of the control group that received a single intravenous injection of PBS after treatment did not improve.
  • the hypersensitivity state improved up to 5 mm stimulation.
  • sciatic nerve partial ligation model mouse was prepared according to Seltzer Z, Dubner R, and Shir Y., Pain. 1990; 43: 205-218. Briefly, 11-week-old ICR mice (20 g body weight) were anesthetized with 20 mg / kg pentobarbital, the skin of the left thigh was dissected, and the sciatic nerve was revealed after fascial detachment. One half of the sciatic nerve was ligated with silk thread and the nerve membrane was fixed with 8-0 nylon suture.
  • SHED-CM has a therapeutic effect on neuropathic pain.
  • the culture supernatant of dental pulp stem cells enables treatment and / or prevention of neuropathic pain for which there has been no definitive treatment.
  • dental pulp stem cells can be collected from fallen milk teeth that were conventionally discarded, and can be easily obtained.

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Abstract

本開示は、歯髄幹細胞の培養上清を含む、神経障害性疼痛の処置および／または予防用の組成物を提供する。有効量の歯髄幹細胞の培養上清を対象に投与することを含む、神経障害性疼痛の処置および／または予防方法を提供する。また、歯髄幹細胞を培養し、培養上清を回収することを含む、神経障害性疼痛の処置および／または予防用の組成物の製造方法を提供する。

Description

神経障害性疼痛の処置および／または予防方法
　本特許出願は、日本国特許出願第２０１８－０００５７８号について優先権を主張するものであり、ここに参照することによって、その全体が本明細書中へ組み込まれるものとする。
　本願は、神経障害性疼痛を処置および／または予防するための歯髄幹細胞の培養上清の使用に関する。
　疼痛は、国際疼痛学会（ＩＡＳＰ）によって、「実際に何らかの組織損傷が起こったとき、または組織損傷を起こす可能性があるとき、あるいはそのような損傷の際に表現される、不快な感覚や不快な情動体験」と定義されている。疼痛は主観的なものであり、その原因により、侵害受容性疼痛と神経障害性疼痛に分類される。
　神経障害性疼痛は、２０１１年にＩＡＳＰによって「体性感覚神経系の病変や疾患によって引き起こされる疼痛」と定義された。例えば、がん性疼痛、糖尿病性ニューロパチー、帯状疱疹後神経痛、三叉神経痛など病原性のもの、神経の圧迫により生じるもの、抗がん剤などの薬剤による副作用によって生じるものが知られている。神経障害性疼痛に対しては、ＮＳＡＩＤやオピオイドなどの既存の鎮痛薬が効きにくいことがあり、抗うつ薬や抗てんかん薬などの鎮痛補助薬の併用が考慮される。有効な神経障害性疼痛治療薬の開発は急務となっている。
　歯髄幹細胞は、神経幹細胞と骨髄幹細胞の性質を併せ持ち、細胞外マトリックスおよび液性因子を多く産生する。特許文献１～３および非特許文献１は、歯髄幹細胞や脂肪幹細胞などの幹細胞を含む組成物が、神経疾患や疼痛の処置に有用であることを開示している。特許文献４および５は、歯髄幹細胞の培養上清が損傷部および炎症性疾患の治療に有効であることを開示している。特許文献６および７、非特許文献２および３は、歯髄幹細胞により産生されるＭＣＰ－１およびｓＳｉｇｌｅｃ－９が、炎症部位に存在するコンドロイチン硫酸と相互作用してＭ２マクロファージを誘導し、Ｍ２マクロファージが様々な栄養因子や免疫調節因子を産生し、組織を再生することを開示している。
特開２０１１－２１９４３２号公報 国際公開第２０１４／１８５４７０号 国際公開第２０１５／０４２１８２号 国際公開第２０１１／１１８７９５号 国際公開第２０１４／１２６１７６号 国際公開第２０１４／０９８２４９号 特開２０１５－１６６６９４号公報
S. Franchi, et al., Adult Stem Cell as New Advanced Therapy for Experimental Neuropathic Pain Treatment. BioMed Research International Volume 2014, Article ID 470983 Kano F, Matsubara K, Ueda M, Hibi H, Yamamoto A. Secreted Ectodomain of Sialic Acid-Binding Ig-Like Lectin-9 and Monocyte Chemoattractant Protein-1 Synergistically Regenerate Transected Rat Peripheral Nerves by Altering Macrophage Polarity. Stem Cells. 2017;35:641-653. Matsubara K, Matsushita Y, Sakai K, Kano F, Kondo M, Noda M, Hashimoto N, Imagama S, Ishiguro N, Suzumura A, Ueda M, Furukawa K, Yamamoto A. Secreted ectodomain of sialic acid-binding Ig-like lectin-9 and monocyte chemoattractant protein-1 promote recovery after rat spinal cord injury by altering macrophage polarity. J Neurosci. 2015;35:2452-2464.
　本願は、新たな神経障害性疼痛の処置および／または予防方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、歯髄幹細胞の培養上清が神経障害性疼痛の処置および／または予防に有効であることを見出した。
　従って、ある態様では、本願は、歯髄幹細胞の培養上清を含む、神経障害性疼痛の処置および／または予防用の組成物を提供する。
　また別の態様では、本願は、歯髄幹細胞を培養し、培養上清を回収することを含む、神経障害性疼痛の処置および／または予防用の組成物の製造方法を提供する。
　本願の開示により、新たな神経障害性疼痛の処置および／または予防方法が提供される。
神経障害性疼痛モデルラットにおける歯髄幹細胞培養上清（ＳＨＥＤ－ＣＭ）の疼痛に対する効果を示す。 坐骨神経部分結紮モデルマウスの作製後、早期に投与されたＳＨＥＤ－ＣＭの疼痛に対する効果を示す。 坐骨神経部分結紮モデルマウスの作製後、中期および末期に投与されたＳＨＥＤ－ＣＭの疼痛に対する効果を示す。 坐骨神経部分結紮モデルマウスの作製後、中期に投与されたＳＨＥＤ－ＣＭの疼痛に対する効果を示す。 坐骨神経部分結紮モデルマウスの作製後、末期に投与されたＳＨＥＤ－ＣＭの疼痛に対する効果を示す。 坐骨神経部分結紮モデルマウスにおけるＳＨＥＤ－ＣＭの抗炎症効果を示す。
　特に具体的な定めのない限り、本明細書で使用される用語は、有機化学、医学、薬学、分子生物学、微生物学等の分野における当業者に一般に理解されるとおりの意味を有する。以下にいくつかの本明細書で使用される用語についての定義を記載するが、これらの定義は、本明細書において、一般的な理解に優先する。
　本明細書では、数値が「約」の用語を伴う場合、その値の±１０％の範囲を含むことを意図する。例えば、「約２０」は、「１８～２２」を含むものとする。数値の範囲は、両端点の間の全ての数値および両端点の数値を含む。範囲に関する「約」は、その範囲の両端点に適用される。従って、例えば、「約２０～３０」は、「１８～３３」を含むものとする。
　「歯髄幹細胞」は、歯髄に由来する体性幹細胞を意味する。歯髄幹細胞は、永久歯または乳歯に由来し得る。好ましくは、歯髄幹細胞は脱落した乳歯に由来する。歯髄幹細胞は、組成物を適用する対象と同一生物種に由来することが好ましく（例えば、対象がヒトであれば、ヒト由来の歯髄幹細胞を用いる）、より好ましくは自家歯髄幹細胞である。歯髄幹細胞は、歯髄細胞中の接着性細胞として選別することができる。即ち、歯髄幹細胞は、乳歯や永久歯から採取した歯髄細胞に含まれる接着性細胞またはその継代細胞であり得る。また、細胞株として樹立された歯髄幹細胞を使用してもよい。あるいは、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞などの多能性幹細胞から分化誘導された歯髄幹細胞を使用してもよい。
　歯髄幹細胞は、その培養上清が神経障害性疼痛に対して歯髄幹細胞のものと同等の効果を有する限り、人為的に改変または導入された少なくとも１つの遺伝子を有してもよい。例えば、歯髄幹細胞の不死化を目的として、１、２、３、４またはそれ以上の遺伝子が導入されていてもよい。そのような歯髄幹細胞の培養上清の神経障害性疼痛に対する効果は、例えば、培養上清を神経障害性疼痛の評価系に供給し、神経障害性疼痛への作用を評価することにより評価し得る。神経障害性疼痛の評価系としては、例えば、本願の実施例に記載の方法などを用いることができる。
　「歯髄幹細胞の培養上清」は、歯髄幹細胞を培養して得られる培養液の上清である。培養上清は、実質的に細胞成分（歯髄幹細胞または歯髄細胞）を含まない。本組成物は、典型的には、歯髄幹細胞および歯髄細胞を含まず、歯髄幹細胞の培養上清のみで構成された組成物である。細胞成分は、培養後に細胞成分を分離除去することによって、除去される。培養液からの細胞成分の分離は、当業者に周知の方法で実施できる。さらに、培養液に対して各種処理（例えば、遠心処理、濃縮、溶媒の置換、透析、凍結、乾燥、凍結乾燥、希釈、脱塩、保存等）を適宜施してもよい。
　歯髄幹細胞の培養には、基本培地、あるいは基本培地に血清等を添加したものを使用できる。基本培地としてはＤＭＥＭの他、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（ＧＩＢＣＯ社等）、ハムＦ１２培地（ＨａｍＦ１２）（ＳＩＧＭＡ社、ＧＩＢＣＯ社等）、ＲＰＭＩ１６４０培地等を用いることができる。二種以上の基本培地を併用してもよい。混合培地の一例として、ＩＭＤＭとＨａｍＦ１２を等量混合した培地（例えば商品名：ＩＭＤＭ／ＨａｍＦ１２（ＧＩＢＣＯ社）として市販される）を挙げることができる。培地には、歯髄幹細胞の生存および／または増殖を阻害しないいかなる成分を添加してもよい。培地に添加可能な成分の例として、血清（ウシ胎仔血清、ヒト血清、羊血清等）、血清代替物（Knockout serum replacement（ＫＳＲ）など）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、抗生物質、各種ビタミン、各種ミネラルを挙げることができる。
　本組成物は、血清を含まないことが好ましい。例えば、血清を含まない培地（無血清培地）で歯髄幹細胞を培養することによって、血清を含まない培養上清を調製することができる。１回または複数回の継代培養を行い、最後または最後から数回の継代培養を無血清培地で培養することによっても、血清を含まない培養上清を得ることができる。一方、回収した培養上清から、透析やカラムによる溶媒置換などを利用して血清を除去することによっても、血清を含まない培養上清を得ることができる。
　歯髄幹細胞の培養には、幹細胞に通常用いられる条件をそのまま、あるいは適宜変更して適用できる。歯髄幹細胞の培養上清の製造は、当業者であれば適宜行うことができる。例えば、出典明示により本明細書の一部とする国際公開第２０１１／１１８７９５号（特許文献４）、国際公開第２０１４／１２６１７６号（特許文献５）等の記載を参照し得る。また、例えば、以下のような操作で培養上清を取得してもよい。
　まず、歯髄から選抜した接着性細胞（歯髄幹細胞）を、上記した培地で培養する。例えば、細胞を付着性細胞培養用ディッシュに播種し、適当な条件（例えば、５％ＣＯ２、３７℃）に調整したインキュベータにて培養する。必要に応じて継代培養を行う。例えば、肉眼で観察してサブコンフルエント（培養容器の表面の約７０％を細胞が占める状態）からコンフルエント（培養容器の表面の約１００％を細胞が占める状態）に達したときに細胞を培養容器から剥離して回収し、再度、培養液を満たした培養容器に播種する。継代培養を繰り返し行ってもよい。例えば継代培養を１～８回行い、必要な細胞数（例えば、約１×１０７個／ｍｌ）まで増殖させる。培養容器からの細胞の剥離は、トリプシン処理など常法で実施することができる。以上の培養の後、細胞を回収して保存（例えば、４℃または－１９８℃で）してもよい。
　十分な数の歯髄幹細胞を十分な時間培養した時点で回収した培養上清を、本組成物に用いる。例えば、約７０～１００％コンフルエント、好ましくは約８０～９０％コンフルエントの歯髄幹細胞に培地を添加し、約１２～７２時間、約３６～６０時間、約４２～５４時間または約４６～５０時間、例えば約４８時間培養した後、培養上清を回収する。ある実施態様では、歯髄幹細胞を約８０～９０％コンフルエントになるまで培養し、洗浄し、無血清培地を添加し、約４８時間培養し、培養上清を回収する。培養上清は、例えば、スポイトやピペットなどを用いて回収することができる。
　回収した培養上清は、そのまま、あるいは一以上の処理を経た後に、本組成物の有効成分として使用される。ここでの処理として、遠心処理、濃縮、溶媒の置換、透析、凍結、乾燥、凍結乾燥、希釈、脱塩、保存（例えば、４℃、－８０℃）を例示することができる。
　本培養上清に対して適宜濃縮処理を施すこともできる。すなわち、本培養上清は濃縮物であってもよい。濃縮方法としては公知の手法から当業者であれば適宜選択して用いることができる。本培養上清は、凍結乾燥処理が施されていてもよい。すなわち、本培養上清は、凍結乾燥物であってもよい。
　本組成物は、神経障害性疼痛の処置および／または予防のために用いることができる。本明細書において、「神経障害性疼痛」とは、侵害情報を伝達する体性感覚神経から大脳へ至る神経系における病変または疾患によって引き起こされる疼痛を意味する。病変または疾患は、中枢神経系にあっても、末梢神経系にあってもよい。神経系の病変には、不可逆性の解剖学的変化を伴う病変（損傷等）、および、不可逆性の解剖学的変化を伴わない病変（圧迫等）が含まれる。ある実施態様では、病変または疾患は、末梢神経（即ち、体性感覚神経）に存在する。神経障害性疼痛の例には、がん性疼痛、薬剤性疼痛、糖尿病による疼痛、三叉神経痛、頚椎症、坐骨神経痛、腰痛、脊椎損傷または脳卒中後の疼痛、神経根圧迫による慢性疼痛が含まれるが、これらに限定されない。ある実施態様では、神経障害性疼痛は、がん性疼痛、薬剤性疼痛、糖尿病による疼痛または坐骨神経痛である。ある実施態様では、神経障害性疼痛は坐骨神経痛である。
　神経障害性疼痛は、侵害受容性疼痛を伴っても、伴わなくてもよい。侵害受容性疼痛は、神経組織以外の生体組織に対する実質的ないしは潜在的な傷害によって、侵害受容器が興奮して起こる疼痛と定義され、熱刺激、機械刺激、化学刺激などによる疼痛および炎症性疼痛を含む。ある実施態様では、神経障害性疼痛は、侵害受容性疼痛を伴わない。
　本明細書で使用されるとき、「処置する」または「処置」は、神経障害性疼痛を有する対象において、神経障害性疼痛の原因を軽減または除去すること、その進行を遅延または停止させること、および／または、その症状を軽減、緩和、改善または除去することを意味する。
　本明細書で使用されるとき、「予防する」または「予防」は、対象において、特に、神経障害性疼痛を発症する可能性が高いが、未だ発症していない対象において、神経障害性疼痛の発症を防止すること、または、神経障害性疼痛を発症する可能性を低減することを意味する。神経障害性疼痛を発症する可能性があるが、未だ発症していない対象には、例えば、体性感覚神経から大脳へ至る神経系における病変（例えば圧迫）または疾患を有する対象が含まれる。
　本組成物は、歯髄幹細胞が培養中に分泌したタンパク質などの高分子化合物、並びに、低分子有機化合物を含み得る。さらに、本組成物は、培地由来の成分も含み得る。
　本組成物は、液体状（液状、ゲル状など）および固体状（粉状、細粒、顆粒状など）の形態を採り得る。また、本組成物は、疾患の種類、疾患を有する個体の特徴、投与方法および投与量に応じて、公知の各種製剤形態を採り得る。例えば、錠剤、粉剤、粒剤、顆粒剤、細粒剤、カプセル剤、用時溶解する固形の注射剤、坐剤などの固形性剤、液状の注射剤（静注／筋注）、注入剤、点滴用剤などの液状性剤、点眼剤、スプレー剤、ローション剤、クリーム剤、貼付剤などの局所外用剤等が挙げられる。また、体内留置型の医療器具等に担持される形態を採ることもできる。そのほか、本組成物は、公知の薬学上許容される塩を含むことができる。当業者であれば、適切な製剤化が可能である。ある実施態様では、本組成物は、静脈投与用の製剤形態をとるものである。
　本組成物は、疾患の種類や製剤形態に応じて、製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）を含み得る。賦形剤としては乳糖、デンプン、ソルビトール、Ｄ－マンニトール、白糖等を用いることができる。崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。無痛化剤としてはベンジルアルコール、クロロブタノール、ソルビトール等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等を用いることができる。抗生物質、ｐＨ調整剤、成長因子（例えば、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ））等を含んでもよい。
　本組成物の投与経路は特に限定されない。適用部位や対象とする疾患に応じて公知の各種投与形態を採用できる。例えば、非経口投与は、全身投与であってもよいし局所投与であってもよい。より具体的には、病変または疾患のある部位への注入、塗布または噴霧が挙げられる。また、静脈内投与、動脈内投与、門脈内投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、口腔内投与等が挙げられる。ある実施態様では、本組成物を静脈内投与する。
　本組成物の用法用量は特に限定されない。対象の性別、年齢、体重、病態等を勘案して設定することができる。例えば、約０.０１～約１００ｍｌ／ｋｇ体重、約０.１～約５０ｍｌ／ｋｇ体重、約０.５～約３０ｍｌ／ｋｇ体重、または、約１～約１０ｍｌ／ｋｇ体重の培養上清が投与されるようにする。あるいは、例えば、乾燥重量で約０.０１～約５００ｍｇ／ｋｇ体重、約０.１～約３００ｍｇ／ｋｇ体重、約１～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、または、約５～約５０ｍｇ／ｋｇ体重の培養上清が投与されるようにする。投与スケジュールの作成においては、対象の性別、年齢、体重、病態などを考慮することができる。本組成物は、単回投与してもよく、複数回投与してもよい。複数回投与する場合、例えば、１日１回～数回、２日～７日に１回、１週～数週に１回、１月～数月に１回、投与し得る。ある実施態様では、本組成物を単回投与する。
　本組成物が適用される対象としては、ヒトを含む哺乳動物（ペット、家畜、実験動物等）が挙げられる。例えば、ヒトのほか、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、サル、モルモット、ラットおよびマウス等が挙げられる。
　ある態様では、本願は、歯髄幹細胞を培養し、培養上清を回収することを含む、本組成物の製造方法を提供する。この製造方法において、歯髄幹細胞の培養および培養上清の回収は上記の通りに実施することができるが、これらに限定されず、当業者に公知のいかなる方法を用いてもよい。この製造方法は、さらに、乳歯または永久歯から歯髄細胞を取得する工程、歯髄細胞集団に含まれる接着性細胞を歯髄幹細胞として選別し、取得する工程、並びに、当業者に知られている通常の製剤化の工程、例えば、培養上清を処理する工程、製剤上許容される他の成分を添加する工程、および／または、培養上清を各種製剤形態に調製する工程などを含み得る。
　別の態様では、本願は、有効量の歯髄幹細胞の培養上清を対象に投与することを含む、神経障害性疼痛の処置および／または予防方法を提供する。
　また別の態様では、本願は、神経障害性疼痛の処置および／または予防のための歯髄幹細胞の培養上清の使用を提供する。
　また別の態様では、本願は、神経障害性疼痛の処置および／または予防用の医薬を製造するための、歯髄幹細胞の培養上清の使用を提供する。
　本願は、例えば、下記の実施態様を提供する。
［１］歯髄幹細胞の培養上清を含む、神経障害性疼痛の処置および／または予防用の組成物。
［２］歯髄幹細胞が乳歯に由来する、第１項に記載の組成物。
［３］歯髄幹細胞が自家歯髄幹細胞である、第１項または第２項に記載の組成物。
［４］歯髄幹細胞を含まない、第１項ないし第３項のいずれかに記載の組成物。
［５］血清を含まない、第１項ないし第４項のいずれかに記載の組成物。
［６］神経障害性疼痛が、がん性疼痛、薬剤性疼痛、糖尿病による疼痛、三叉神経痛、頚椎症、坐骨神経痛、腰痛、脊椎損傷もしくは脳卒中後の疼痛、または、神経根圧迫による慢性疼痛である、第１項ないし第５項のいずれかに記載の組成物。
［７］神経障害性疼痛が、がん性疼痛、薬剤性疼痛、糖尿病による疼痛または坐骨神経痛である、第１項ないし第５項のいずれかに記載の組成物。
［８］神経障害性疼痛が坐骨神経痛である、第１項ないし第７項のいずれかに記載の組成物。
［９］神経障害性疼痛が侵害受容性疼痛を伴わない、第１項ないし第８項のいずれかに記載の組成物。
［１０］神経障害性疼痛が末梢神経の病変または疾患に起因する、第１項ないし第９項のいずれかに記載の組成物。
［１１］歯髄幹細胞を培養し、培養上清を回収することを含む、第１項ないし第１０項のいずれかに記載の組成物の製造方法。
　本明細書で引用するすべての文献は、出典明示により本明細書の一部とする。
　上記の説明は、すべて非限定的なものであり、添付の特許請求の範囲において定義される本発明の範囲から逸脱せずに、変更することができる。さらに、下記の実施例は、すべて非限定的な実施例であり、本発明を説明するためだけに供されるものである。
ヒト脱落乳歯歯髄幹細胞培養上清（ＳＨＥＤ－ＣＭ）の調製
　１０ｃｍディッシュを用いてＤＭＥＭ（SIGMA ALORICH Co.USA）＋１０％ＦＢＳ（SIGMA ALORICH Co USA）＋１％ Penicillin Streptomycin（Life Technologies Japan Ltd）でヒト脱落乳歯歯髄幹細胞を培養し、８０～９０％コンフルエントになるまで培養を行った。ＰＢＳで２回洗浄した後に、無血清培養液（ＤＭＥＭ）を添加し、４８時間培養を行った。上清を回収し、１５００ｒｐｍで４～５分間、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、その上清を、歯髄幹細胞培養上清として以下の実施例に使用した。
神経障害性疼痛モデルラットにおけるＳＨＥＤ－ＣＭの効果
　７～８週齢雄ラット（体重２５０ｇ）をペントバルビタール２０ｍｇ／ｋｇで麻酔し、左大腿部の皮膚を切開し、筋膜剥離後に坐骨神経を明示した。１２ｍｍの坐骨神経を切除し、１２ｍｍシリコンチューブ（１．６ｍｍ径）に切断末端を１ｍｍ挿入し、神経膜を８－０ナイロン縫合糸で固定した。術後１週間でＳＨＥＤ－ＣＭ１ｍｌを尾静注した。対照のラットにはＰＢＳ１ｍｌを尾静注した。神経障害性疼痛を左足におけるVon Frey試験で評価した。
　結果を図１に示す。神経障害性疼痛モデルラットは知覚過敏状態であり、直径４ｍｍのvon-Frey hair で麻痺側下肢を刺激すると激しい回避行動を示した。処置後単回ＰＢＳを静注した対照群の知覚過敏状態は改善しなかった。一方、ＳＨＥＤ－ＣＭ投与群では５ｍｍ刺激まで知覚過敏状態が改善した。
坐骨神経部分結紮モデルマウスにおけるＳＨＥＤ－ＣＭの効果
　Seltzer Z, Dubner R, and Shir Y., Pain. 1990; 43: 205-218 に記載に準じて、坐骨神経部分結紮モデルマウスを作製した。簡潔に述べると、１１週齢のＩＣＲマウス（体重２０ｇ）をペントバルビタール２０ｍｇ／ｋｇで麻酔し、左大腿部の皮膚を切開し、筋膜剥離後に坐骨神経を明示した。坐骨神経の１／２を絹糸で結紮し、神経膜を８－０ナイロン縫合糸で固定した。
（１）早期の効果
　坐骨神経部分結紮モデルマウスに、術後０、１、２、３、４、５および６日目に、ＳＨＥＤ－ＣＭ０．５ｍｌまたはＤＭＥＭ０．５ｍｌ（対照）を尾静注した。投与前並びに術後３および７日目に、疼痛をVon Frey試験で評価した。結果を図２に示す。ＳＨＥＤ－ＣＭにより、Von Frey試験の結果は改善された。この結果は、ＳＨＥＤ－ＣＭの疼痛予防効果を示す。
（２）中期および末期の効果
　坐骨神経部分結紮モデルマウスに、術後７、２３、２４および２５日目に、ＳＨＥＤ－ＣＭ０．５ｍｌまたはＤＭＥＭ０．５ｍｌ（対照）を投与した。術後０、７、８、１１、１４、２３、２６および３０日目に、疼痛をVon Frey試験で評価した。結果を図３に示す。ＳＨＥＤ－ＣＭの初回投与の翌日には、Von Frey試験の結果は改善された。その後、ＳＨＥＤ－ＣＭ群と対照群の差異は徐々に小さくなったが、再度ＳＨＥＤ－ＣＭを投与すると、再び改善された。この結果は、ＳＨＥＤ－ＣＭの反復投与による疼痛治療効果を示す。
（３）中期の効果
　坐骨神経部分結紮モデルマウスに、術後７、８、９、１０、１１、１２および１３日目に、ＳＨＥＤ－ＣＭ０．５ｍｌまたはＤＭＥＭ０．５ｍｌ（対照）を投与した。術後０、７および１４日目に、疼痛をVon Frey試験で評価した。結果を図４に示す。ＳＨＥＤ－ＣＭの投与後に、Von Frey試験の結果は改善された。この結果は、損傷から１週間後におけるＳＨＥＤ－ＣＭの疼痛治療効果を示す。
（４）末期の効果
　坐骨神経部分結紮モデルマウスに、術後１４、１５、１６、１７、１８、１９および２０日目にＳＨＥＤ－ＣＭ０．５ｍｌまたはＤＭＥＭ０．５ｍｌ（対照）を投与した。術後０、７、１４および２１日目に、疼痛をVon Frey試験で評価した。結果を図５に示す。ＳＨＥＤ－ＣＭの投与後に、Von Frey試験の結果は改善された。この結果は、ＳＨＥＤ－ＣＭの慢性疼痛に対する治療効果を示す。
（５）ＳＨＥＤ－ＣＭの抗炎症効果
　坐骨神経部分結紮モデルマウスに、手術と同時にＳＨＥＤ－ＣＭ０．５ｍｌまたはＤＭＥＭ０．５ｍｌ（対照）を投与した。偽手術群（ＳＨＡＭ）には、坐骨神経の結紮を除いてモデルマウスと同様の手術を行い、ＳＨＥＤ－ＣＭおよびＤＭＥＭのいずれも投与しなかった。２４時間後にマウスを安楽死させ、損傷周囲の組織を採取し、Ａｒｇ－１およびＴＮＦ－αの発現レベルを定量ＲＴ－ＰＣＲにより測定した。結果を図６に示す。ＳＨＥＤ－ＣＭ投与群では、対照群と比較してＡｒｇ－１レベルが高く、ＴＮＦ－αレベルが低かった。Ａｒｇ－１は抗炎症作用を有するマクロファージ２の表現型の１つであり、ＴＮＦ－αは炎症促進性サイトカインである。この結果は、ＳＨＥＤ－ＣＭは、投与のわずか２４時間以内にすでに抗炎症効果を発揮していることを示す。
　以上の結果より、ＳＨＥＤ－ＣＭは神経障害性疼痛に対して治療効果を有することが示された。
　本明細書の開示に従って、歯髄幹細胞の培養上清により、決定的な治療法が存在しなかった神経障害性疼痛の処置および／または予防が可能になる。また、歯髄幹細胞は、従来廃棄されていた脱落乳歯から採取することができ、容易に入手し得る。

Claims (7)

  1. 　歯髄幹細胞の培養上清を含む、神経障害性疼痛の処置および／または予防用の組成物。
  2. 　歯髄幹細胞を含まない、請求項１に記載の組成物。
  3. 　血清を含まない、請求項１または２に記載の組成物。
  4. 　神経障害性疼痛が、がん性疼痛、薬剤性疼痛、糖尿病による疼痛、三叉神経痛、頚椎症、坐骨神経痛、腰痛、脊椎損傷もしくは脳卒中後の疼痛、または、神経根圧迫による慢性疼痛である、請求項１～３のいずれかに記載の組成物。
  5. 　神経障害性疼痛が、がん性疼痛、薬剤性疼痛、糖尿病による疼痛または坐骨神経痛である、請求項１～４のいずれかに記載の組成物。
  6. 　神経障害性疼痛が坐骨神経痛である、請求項１～５のいずれかに記載の組成物。
  7. 　歯髄幹細胞を培養し、培養上清を回収することを含む、請求項１～６のいずれかに記載の組成物の製造方法。
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