KR20170041116A - 신경계의 보호 및/또는 복구용 조성물 및 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신경계를 보호하거나 및/또는 복구를 촉진하기 위한 조성물과 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 신경계를 보호하거나 및/또는 복구를 촉진하기 위한, 가교되어 미세입자를 형성하는 무라밀 다이펩타이드의 용도에 관한 것이다.

Description

신경계의 보호 및/또는 복구용 조성물 및 방법 {COMPOSITIONS AND METHODS FOR PROTECTION AND/OR REPAIR OF THE NERVOUS SYSTEM}

본 출원은 2015년 10월 6일자 호주 특허 출원번호 제 2015904055호에 대해 우선권을 주장한다.

본 발명은 신경계의 보호 및/또는 복구 촉진을 위한 조성물과 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 신경계의 보호 및/또는 복구 촉진을 위한, 가교에 의해 미세입자를 형성하는 무라밀 다이펩타이드의 용도에 관한 것이다.

본 명세서 전체에서 언급되는 종래 기술에 대한 모든 논의들은, 이러한 종래 기술이 널리 공지되어 있다거나 또는 당해 기술 분야의 통상적인 일반 지식의 일부를 형성한다는 것에 대한 용인으로서 간주되어서는 결코 안된다.

신경계는 2종의 주요 파트, 즉 중추 신경계 (CNS)와 말초 신경계 (PNS)로 구성된다. CNS는 뇌와 척추를 포함하는 반면, PNS는 주로 CNS를 신체의 그외 모든 부위들과 연결하는 신경들로 구성된다.

신경계는, 세포 수준에서, 뉴런과 신경교 세포를 포함한다. 뉴런은, 신호를 신속 정확하게 다른 세포로 보낼 수 있는 특수한 구조를 가지고 있다. 신호는 축삭돌기 (axon)를 따라 뉴런의 세포체로부터 다른 뉴런으로 이동하는 전기화학적 웨이브 형태로 존재한다. 신경교 세포는 뉴런에 대한 구조적이고 대사적인 지지를 제공한다. 신경교 세포는, 축삭돌기를 둘러싸 수초를 형성함으로써 축삭돌기를 절연시키는 희소돌기신경교와, 구조적이고 대사적인 뒷받침을 제공하는 성상 세포를 포함한다.

신경계의 손상 또는 상해는 언어 장애, 촉감 둔화, 균형 상실, 쇠약, 정신 기능 문제, 시각적 변화, 비정상적인 반사 반응 및 보행 불능을 비롯한 신경학적 기능에 이상을 일으킨다.

신경계의 손상 또는 상해는, 유전적 결함 (예, 헌팅턴 질환 및 근위축증), 발달 장애 (예, 척추갈림증), 신체적 외상, 퇴행 (예, 파킨슨 질환 및 알츠하이머 질환), 혈액 공급 감소 (예, 뇌졸증), 감염 (예, 수막염), 발작 (예, 간질) 및 암 (예, 뇌 종양)을 포함하여, 다양한 외상 또는 질환을 초래할 수 있다.

신경계의 손상 또는 상해는 정확하게 조절되는 미세 환경을 파괴함으로써, 조직 손상을 일으키며, 종종 유의한 기능 복원과 신경 재생에 결함을 발생시킨다. CNS가 외상 또는 질환으로 인해 손상되면, 이차 손상 케스케이드가 뒤따른다. 이러한 손상으로 인한 혈관 반응, 세포 반응 및 화학 반응으로는 조직 염증, 혈류 감소 및 흉터 발생이 있다. 손상된 축삭돌기에서는 탈수초화가 발생하여, 신경 임펄스의 전달이 느려지고, 추가적인 손상으로부터 축삭돌기를 보호하지 못하게 된다.

신경계를 외상 또는 질환으로부터 보호하는 물질에 대한 요구가 존재하고 있다. 또한, 외상 또는 질환으로부터 신경계의 복구를 촉진하는 물질이 요구되고 있다.

본 발명의 과제는 종래 기술의 한가지 이상의 문제점을 극복 또는 개선하거나, 또는 유용한 대안을 제공하는 것이다.

놀랍게도 가교에 의해 미세입자 (MDP)를 형성하는 무라밀 다이펩타이드가, 탈수초화 및/또는 척추 손상이 발생된 이후에, 운동 기능을 강화하고, 신경보호 인자/회복 인자들의 수준을 증가시키고, 대식세포의 활성화를 저하시킨다는 것을 확인하게 되었다.

본 발명은, 일 측면에서, 개체에서 신경 손상을 예방학적으로 및/또는 치료학적으로 치료하기 위한, 가교에 의해 미세입자 (MDP)를 형성하는 무라밀 다이펩타이드를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은, 일 측면에서, 가교에 의해 미세입자 (MDP)를 형성하는 무라밀 다이펩타이드를 포함하는 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 신경 손상을 예방학적으로 및/또는 치료학적으로 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 개체에서 신경 손상을 예방학적으로 및/또는 치료학적으로 치료하기 위한 약제의 제조에 있어, 가교에 의해 미세입자 (MDP)를 형성하는 무라밀 다이펩타이드의 용도를 제공한다.

본 발명의 다른 측면에서, 개체에서 신경 손상을 예방학적으로 및/또는 치료학적으로 치료하는데 사용하기 위한, 가교에 의해 미세입자 (MDP)를 형성하는 무라밀 다이펩타이드를 포함하는 조성물을 제공한다.

일 구현예에서, MDP 미세입자는 DNA 단편을 포함한다.

다른 구현예에서, MDP 미세입자는 대식세포로부터 분리된다.

다른 구현예에서, 신경 손상은 척추 손상이다.

다른 구현예에서, 신경 손상은 탈수초화이다.

다른 구현예에서, 조성물 또는 약제는 개체에서 하나 이상의 신경보호 인자/회복 인자의 수준을 증가시킨다.

다른 구현예에서, 신경보호 인자/회복 인자는 혈관 내피 성장인자 (VEGF), 인슐린 성장인자-1 (IGF-1), 간세포 성장인자 (HGF) 및 에리트로포이에틴 (EPO)으로부터 선택된다.

다른 구현예에서, 조성물 또는 약제는 대식세포의 활성화를 감소시킨다.

다른 구현예에서, 조성물 또는 약제는 MHC 클래스 II를 발현하는 대식세포의 수를 감소시킨다.

다른 구현예에서, 조성물 또는 약제는 대식세포 상의 MHC 클래스 II의 농도를 감소시킨다.

다른 구현예에서, 조성물 또는 약제는 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제, 담체, 비히클 또는 희석제를 포함한다.

다른 구현예에서, MDP 미세입자는 리포좀 안에 캡슐화되지 않는다.

다른 구현예에서, 조성물 또는 약제는 개체에게 비경구로 투여되거나 또는 투여가능하다.

다른 구현예에서, 조성물 또는 약제는 개체에게 정맥내로 투여되거나 또는 투여가능하다.

다른 구현예에서, 조성물 또는 약제는 개체에게 경구로 투여되거나 또는 투여가능하다.

다른 구현예에서, 조성물 또는 약제는 MDP 미세입자를 약 1 ㎍ - 약 100 ㎍의 투여량으로 개체에게 투여되거나 또는 투여가능하다.

다른 구현예에서, 조성물 또는 약제는 MDP 미세입자를 약 100 ㎍ - 약 1000 ㎍의 투여량으로 개체에게 투여되거나 또는 투여가능하다.

다른 구현예에서, 조성물 또는 약제는 MDP 미세입자를 약 100 ㎍ - 약 700 ㎍의 투여량으로 개체에게 투여되거나 또는 투여가능하다.

다른 구현예에서, 조성물 또는 약제는 MDP 미세입자를 약 300 ㎍ - 약 700 ㎍의 투여량으로 개체에게 투여되거나 또는 투여가능하다.

다른 구현예에서, 조성물 또는 약제는 MDP 미세입자를 약 500 ㎍ - 약 700 ㎍의 투여량으로 개체에게 투여되거나 또는 투여가능하다.

다른 구현예에서, 조성물 또는 약제는 MDP 미세입자를 약 1, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975 또는 1000 ㎍의 투여량으로 개체에게 투여되거나 또는 투여가능하다.

다른 구현예에서, 조성물 또는 약제는 개체에게 매일 1회로 투여되거나 또는 투여가능하다.

다른 구현예에서, 조성물 또는 약제는 개체에게 매주 1회로 투여되거나 또는 투여가능하다.

다른 구현예에서, 조성물 또는 약제는 개체에게 2주에 1회로 투여되거나 또는 투여가능하다.

다른 구현예에서, 조성물 또는 약제는 개체에게 매달 1회로 투여되거나 또는 투여가능하다.

MDP 미세입자의 적절한 투여량, 투여되는 총 양 및 투여 기간은 본원에 제공되는 지침, 치료할 질환의 특성과 중증도 및 치료에 대한 개체 반응을 기초로 의료 실무자가 쉽게 결정할 수 있다. 그 예로, 사용가능한 투여량은 MDP 미세입자 1 ㎍ 내지 1000 ㎍ 범위로부터 선택할 수 있으며, 개체의 상태, 증상, 허용성 및 치료 반응에 따라 1일 1회, 1주일에 1회, 2주에 1회 또는 1개월에 1회로 투여할 수 있다. 필요에 따라서는, 이 보다 더 높은 범위의 투여량, 예를 들어 MDP 미세입자는 1000 ㎍ 내지 1500 ㎍ 범위의 투여량으로 사용할 수 있다. 다른 투여 빈도도 적용할 수 있다. 적합한 투약 용법의 예는, 초기 투여량 100 ㎍에서 시작해, 유의한 부작용 없이 적절한 유익한 치료 효과가 개체에서 관찰될 때까지 투여량을 높이는 방법일 수 있다. 투여량은 단일한 볼루스 용량 (single bolus dose)으로서 제공하거나, 또는 경시적으로 주입할 수 있다. MDP 미세입자의 투여되는 총 양은 개체의 반응과 치료에 대한 허용성에 따라 결정될 것이다. 조성물은 1일 1회, 1주일에 1회, 2주일에 1회 또는 1개월에 1회로 개체의 반응에 따라 전 기간 동안 투여할 수 있다.

MDP 미세입자-함유 조성물 또는 약제는 경구, 코, 국소 (불 및 설하를 포함함), 직장, 질, 에어로졸 및/또는 비경구 투여에 적합할 수 있다. 조성물은 단위 투약 형태로 편리하게 존재할 수 있으며, 약학 기술 분야에 잘 알려진 임의 방법으로 제조할 수 있다. 단위 투약 형태를 제조하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 MDP 미세입자-함유 조성물의 양은 치료 중인 개체와 구체적인 투여 방식에 따라 달라질 수 있다.

MDP 미세입자-함유 조성물 또는 약제는, 1회 투여 또는 반복 투여로서, 단독으로 투여하거나, 또는 약제학적으로 허용가능한 부형제, 담체, 비히클 또는 희석제와 조합하여 투여할 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 절합한 부형제, 담체, 비히클 및 희석제로는 불활성 고체 희석제 또는 충진제, 무균성 수용액 및 다양한 유기 용매를 포함한다. MDP 미세입자-함유 조성물과 약제학적으로 허용가능한 부형제, 담체, 비히클 또는 희석제를 조합하여 제조되는 조성물은, 정제, 산제, 로젠제, 시럽제, 주사 용액 등과 같은 다양한 투여 형태로 쉽게 투여된다. 이들 약학 조성물은, 필요에 따라, 향제, 결합제, 부형제 등과 같은 추가적인 성분을 포함할 수 있다. 즉, 경구 투여용인 경우, L-아르기닌, 소듐 사이트레이트, 칼슘 카보네이트 및 칼슘 포스페이트와 같은 다양한 부형제를 함유한 정제가 전분, 알긴산 및 특정 복합체 실리케이트와 같은 다양한 붕해제와 함께, 폴리비닐피롤리돈, 슈크로스, 젤라틴 및 아카시아 등의 결합제와 더불어 사용될 수 있다. 또한, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 라우릴 설페이트 및 탈크와 같은 윤활제도 타정을 위해 종종 사용가능하다. 유사한 타입의 고체 조성물은, 또한, 연질 및 경질의 충전된 젤라틴 캡슐제 형태로 충진제로서 사용될 수 있다. 이러한 것으로 적절한 물질로는 락토스 또는 우유 당 및 고분자량의 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 수성 현탁제 또는 엘릭서제가 경구 투여용으로 바람직한 경우, 제형의 필수 활성 성분은 다양한 감미제 또는 착향제, 색소 또는 염료와 조합될 수 있으며, 필요에 따라서는 유화제 또는 현탁제가 물, 에탄올, 프로필렌 글리콜, 글리세린 및 이들의 조합과 같은 희석제와 더불어 조합될 수 있다. MDP 미세입자-함유 조성물은 또한 장용 코팅된 투약 형태를 포함할 수 있다.

적절한 제형 프로토콜과 적합한 부형제, 담체, 비히클 및 희석제는 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Ed, 1995 (Mack Publishing Co. Pennsylvania, USA), British Pharmacopoeia, 2000 등의 표준 문헌에서 찾아볼 수 있다.

정의

본 발명의 내용에서, "가교에 의해 미세입자를 형성하는 무라밀 다이펩타이드"라는 용어와 "MDF 미세입자"라는 용어는 무라밀 다이펩타이드 (MDP)가 가교된 반복체로 형성된 미세입자를 지칭하며, 여기서 MDP 반복체는 서로 가교되어 있다. 또한, MDP 미세입자는 DNA 단편 및/또는 면역계를 자극 및/또는 조절하는 기타 물질을 포함할 수 있다.

본 발명의 내용에서, "포함한다", "포함하는" 등의 용어는 제외와는 반대되는 포함으로 해석되며, 즉 "포함하나, 이로 제한되지 않는"의 의미이다.

본 발명의 내용에서, "치료" 또는 "치료하는"이라는 용어는 질환에 취약할 수 있지만 아직 걸린 것으로 진단받지 않은 동물에서 질환, 장애 또는 병태의 발병에 대한 예방; 질환, 장애 또는 병태의 저해, 예를 들어 이의 진행 방해; 및 질환, 장애 또는 병태의 완화, 예를 들어 질환, 장애 및/또는 병태의 퇴행 유발을 포함한다. 질환 또는 병태의 치료는, 기저 병인에는 영향을 미치지 않더라도, 특정 질환 또는 병태의 한가지 이상의 증상의 완화를 포함한다.

본 발명의 내용에서, "치료학적 유효량"이라는 표현은 어떠한 의학적인 치료에 적용가능한 합리적인 효과/위험 비율로 다소 바람직한 효과를 발생시키는 MDP 미세입자의 양을 지칭한다. 특정 구현예에서, 이 용어는 일정 기간 동안 의학적인 증상을 없애거나 또는 완화하는데 필수적이거나 충분한 양을 의미한다. 유효량은 치료 중인 질환 또는 병태, 투여 중인 구체적인 타겟화된 구축물 (targeted construct), 개체의 신체 크기 또는 질환 또는 병태의 중증도와 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자는 과도한 실험없이도 특정 조성물의 유효량을 경험으로 정할 수 있다. 특정 구현예에서, 조성물은, 환자에게 치료학적인 유효량으로, 예방학적 또는 치료학적 치료의 일환으로서 전달될 수 있는 방식으로 제형화된다. 환자에게 투여할 조성물의 적정량은 MDP 미세입자의 흡수, 불활성화 및 배출 속도 뿐만 아니라 MDP 미세입자의 전달율에 따라 결정될 것이다.

본 발명의 내용에서, "비경구 투여"라는 표현은 본원에서 주사와 같이 장 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 지칭하며, 비제한적인 예로, 정맥내, 근육내, 흉막내, 혈관내, 심막내, 동맥내, 경막내, 관절낭내, 안와내, 심장내, 진피내, 복막내, 경기관내, 피하, 각피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내 및 흉골내 주사와 주입을 포함한다.

본 발명의 내용에서, "약제학적으로 허용가능한"이라는 표현은 당업계에서 인정된다. 특정 구현예에서, 이 용어는, 적절한 의학적 판단 내에서, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 그외 문제나 합병증이 없으며 합리적인 효과/위험 비율을 충족시키는, 포유류, 인간 및 동물의 조직과 접촉 사용하는데 적합한 조성물, 폴리머 및 기타 물질 및/또는 투약 형태를 포함한다.

본 발명의 내용에서, "신경 손상"이라는 표현은 신경계의 조직 또는 세포의 손상을 의미한다.

본 발명의 내용에서, "신경계"라는 표현은 중추 신경계와 말초 신경계를 포괄한다.

도 1: MIS416 치료는 회복/복구 시기에 투여하였을 때 쿠프리존 탈수초화 모델에서 운동 기능의 회복을 강화한다.
도 2: MIS416 치료는 인간 말초혈 혈장 샘플내 혈관 내피 성장인자 (VEGF), 인슐린 성장인자-1 (IGF-1), 간세포 성장인자 (HGF) 및 에리트로포이에틴 (EPO)의 농도를 증가시킨다.
도 3: 손상된 후 1일, 3일 및 7일째 척추 손상 (SCI) 마우스에서 Basso Mouse Scale 측정. MIS416 (3 mg/Kg 또는 6 mg/Kg) 또는 식염수를 손상 후 1일째에 전신 투여하였다. 식염수 처리된 SCI 그룹은 SCI 후 7일째까지 회복율이 가장 낮았다. 반면에, MIS416 처리한 2가지 그룹들 모두 7일까지 운동 회복 (locomotive recovery)을 나타내며, 6 mg/kg MIS416 처리 그룹에서는 식염수 대조군과 비교해 통계학적으로 유의한 수준에 도달하였다.
도 4: SCI 발생 후 7일째 회수한 마우스의 척추에 대한 유세포 측정 분석. 도 4A는, MHC 클래스 II를 발현하는 전체 대식세포에 대한 %를 근거로, 대식세포 활성화가 건강한 대조군과 비교해 식염수 처리한 SCI 마우스에서 명확하게 나타남을 보여준다. MIS416 처리한 양쪽 그룹들은 식염수/SCI 처리 그룹에 비해 활성화된 대식세포의 비율이 명확하게 낮다. 도 4B는 식염수/SCI 처리 그룹에 비해 MHC 클래스 II⁺ 대식세포 상의 MHC 클래스 II 발현 수준이 낮음을 보여준다.

본 발명은 본원에 상세하게 기술된 구현예들을 참조하여 설명되지만, 다른 구현예들도 동일하거나 유사한 결과를 달성할 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면 본 발명에 대한 변경 및 수정이 자명할 것이며, 본 발명은 이러한 수정 및 등가를 모두 포괄하는 것으로 의도된다.

본 발명은 아래 비-제한적인 실시예들을 들어 더욱 설명된다.

실시예

실시예 1: MIS416 제조

프로피오니박테리움 아크네 (Propionibacterium acnes)를 미드-정체기 단계로 배양하고, 당해 기술 분야의 당업자에게 널리 공지된 기법을 적용해 세척하여 박테리아 배양물의 오염 물질을 제거하였다. 세포벽과 세포질에 함유된 소수성 물질은, 승온된 온도에서 에탄올/이소프로판올/물을 농도를 순차적으로 높이면서 (10%:10%:80%, 25%:25%:50% 및 40%:40%:20%) 세척함으로써 연속 추출하였다. 그런 후, 승온된 온도에서 농도를 낮추면서 (80%, 50%, 40% 및 20%) 연속 세척하여 이소프로판올을 제거하였다. 수득되는 미세입자 (MIS416)는 이후 6M 구아니딘-HCl에 현탁한 다음 세정 (irrigation)을 위해 물로 세척하고, 565 nm에서의 이의 흡광도를 탁도 표준치와 연관시켜 그 농도를 측정하였다.

MIS416은 가교된 MDP, 아미노-연결된 L-알라닌-D-이소글루타민 다이펩타이드 및 박테리아 DNA 단편을 다량 함유한다. 본 발명의 방법에 의해 제조된 MIS416은 폭넓은 크기 범위 (예를 들어, 0.01 - 30 micron)를 가지지만, 대부분은 1 내지 7 micron 범위의 크기를 가진다. 바람직한 크기는 0.5 - 3 micron 범위이다.

MIS416은 전술한 바와 같이 천연 소스로부터 분리하거나, 또는 널리 공지된 합성 공정을 이용해 합성할 수 있다 (예, Liu et al., Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, 10 (12), 2000, pp. 1361-1363(3); Schwartzman & Ribi, Prep Biochem. 1980; 10(3): 255-67; Ohya et al. Journal of Bioactive and Compatible Polymers, 1993; 8: 351-364).

MIS416의 농도는 정맥내 투여를 위해 염화나트륨에 0.2 mg/mL로 적정하였다.

실시예 2: 초기 수초 재생에 대한 MIS416의 효과

초기 수초 재생에 미치는 MIS416 치료 효과를 쿠프리존 탈수초화 모델에서 조사하였다. C57/Bl6 마우스 (n=7 또는 8/그룹)는 사료 펠릿 형태로 혼합된 0.3 % (w/w) 쿠프리존 [옥살 비스-(사이클로헥실리덴하이드라지드); Sigma-Aldrich] 사료를 6주간 자유롭게 계속적으로 섭취하게 하였다. 쿠프리존 식이 6주 후, 마우스에 정상적인 마우스 사료를 공급하여, 2주간 자발적인 수초 복구가 진행되게 하였다 (회복기). 회복기의 MIS416 치료 효과를 조사하기 위해, 5, 6, 7 및 8주에 매주 투여하는 사이클로 100 ㎍/mouse 또는 200 ㎍/mouse로 정맥내 투여하였으며, 1차 투여는 쿠프리존을 식이하는 마지막 주와 겹치게 하였다.

쿠프리존은 특히 중추 신경계에서 수초 세포인 희소돌기신경교의 사멸을 유발한다. 이의 주 기능은 축삭돌기에 대한 지지를 제공하고, 또한 축삭 돌기를 절연시키는 수초를 생산하는 것이다. 쿠프리존 노출로 인해 희소돌기신경교가 없어지면, 운동 기능도 점진적으로 사라지게 된다.

신경학적 기능에 대한 쿠프리존 탈수초화 효과를, 온동 제어, 협력 및 균형을 측정하는 로타로드 검사 (rotarod test)를 이용해 매주 측정하였다. 로타로드 측정들 모두 맹검으로 수행하였다.

그 결과, MIS416 처리 동물이 회복기 (6주 이후) 동안에 운동 기능의 꾸준한 증가를 나타내는 것으로 확인된다. 이는, 수초 회복 초기 단계에서 자발적인 회복 증거가 거의 없었던, 무처리 동물과는 대비된다 (도 1).

실시예 3: 신경 보호/회복 인자들의 농도에 대한 MIS416의 효과

신경보호/회복 인자의 농도에 미치는 MIS416 치료 효과를 진행성 MS에 대한 임상 1b/2a 상 실험에 참여한 환자로부터 유래된 말초혈 혈장 샘플에서 조사하였다. 인간 실험 환자의 혈액 혈장을 베이스라인과 MIS46 투여 (500　 ㎍/dose) 후 24시간째에 수집하여, 신경보호 인자의 농도를 분석하기 전까지 -80℃에서 보관하였다. 혈관 내피 성장인자 (VEGF), 인슐린 성장인자-1 (IGF-1) 및 간세포 성장인자 (HGF)의 농도는 유세포 측정 사이토카인 비드 어레이 (Antigenix)를 이용해 측정하고, 에리트로포이에틴 (EPO)은 표준적인 ELISA (Cusbio Asia)를 이용해 정량하였다.

MIS416를 투여한 지 24시간째에, 혈장내 EGF, EPO, IGF-1 및 HGF 농도가 처리 전 수준에 비해 증가하였다 (도 2). VEGF는 뉴런과 신경교 세포에 신경영양 효과와 신경보호 효과 (Zachary 2005, Neuro-Signals, 14(5): 207-21; Nicoletti et al 2008, Neuroscience, 151(1): 232-41), 뿐만 아니라 탈수초화된 병변에 혈관신생을 촉진 (Girolamo et al 2014, Acta Neuropathologica Communications, 2: 84)하는 것으로 알려져 있다. IGH-1은 뉴런의 생존을 촉진하고 (Heck et al 1999, Journal of Biological Chemistry, 274(14): 9828-35), 회복 반응시 농도가 증가 (Mangolia et al 2014, BioMed Research International, Article ID　736104)하는 것으로 알려져 있다. HCF는 세포 분열촉진 (mitogenic), 운동촉진 (motogenic), 항-세포자살 활성 및 신경영양 활성을 가지고 있으며, 세포 사멸을 방지하는 것으로 확인된 바 있다 (Kadoyama et al 2011, Current Drug Therapy, 6(3): 197-206). EPO는 전-염증성 사이토카인의 발생을 감소시키고, 조직 재생이 가능하도록 영양적인 지원을 제공한다 (Brines & Cerami 2008, Journal of Internal Medicine, 264(5): 405-32). EPO는 척추 외상 후 신경 회복을 강화하고 (Celik et al 2002, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 99(4): 2258-63), 신경발생 및 뇌졸증 후 회복에 역할을 하는 것으로 알려져 있다 (Tsai et al 2006, Journal of Neuroscience, 26(4): 1269-74). 따라서, 이들 결과는, MIS416의 투여가 신경보호/회복 인자들을 증가시킴을 입증해준다.

실시예 4: MIS416 독성 실험

유리형/용해성 MDP가 생체내에서 현저한 독성을 나타낸다는 것은 잘 확립되어 있다. MDP 독성을 낮추기 위한 시도에서는 리포좀 또는 기타 관련 화합물 안에 리포좀 투입, 또는 말단 기의 변형과 같이, 방출을 지연하기 위한 방법을 적용한다. 화학적 변형은 활성의 현저한 저하를 발생시키고, 전달율에 변화를 주는 설계는 통제하기가 어렵다. MIS416에 대한 생체내 독성 연구는 표 1에 개괄된 바와 같이 수행하였다.

실험ID.	실험명	방법	MIS416 용량	성과
G6121	MIS416: 스위스 알비노 마우스에서 IV 경로에 의한 급성 독성 연구	MIS416은 증가시킨 용량들로 1회 투여하였다. 동물에서 독성 신호 및 사망을 15일까지 모니터링하고, 15일째 최종 희생시 정밀 부검하였다	10,000, 15,000 30,000 및 45,000 mcg/kg(체중)	최대 허용 용량 (MTD)이 15,000 mcg/kg(체중)로 확립됨
G6122	MIS416: 뉴질랜드 백토끼에서 IV 경로에 의한 급성 독성 연구	MIS416은 증가시킨 용량들로 1회 투여하였다. 동물에서 독성 신호 및 사망을 15일까지 모니터링하고, 15일째 최종 희생시 정밀 부검하였다	50, 200, 800 및 3200 mcg/kg(체중) (토끼)	MTD는 3,200 mg/kg(체중)로 확립됨
G6123	MIS416: 스위스 알비노 마우스에서 IV 경로에 의한 4주 반복 투약 독성 연구	급성 독성 연구에서 선정된 MIS416 용량을 4주간 매주 2회 투여하였다. 동물은 마지막 희생시 정밀 부검하였다	1,000 3,000 및 10,000 mcg/kg(체중) (마우스)	무독성량 (no-observed-adverse-effect-level, NOAEL)은 1,000 mcg/kg으로 간주됨 (또는 총 매주 용량 2,000 mcg/kg/week)
G6124	MIS416: 뉴질랜드 백토끼에서 IV 경로에 의한 4주 반복 투약 독성 연구	급성 독성 연구에서 선정된 MIS416 용량을 4주간 매주 2회 투여하였다. 동물은 마지막 희생시 정밀 부검하였다	50, 500 및 5,000 mcg/kg(체중)	NOAEL은 매주 2회 주사 (100 mcg/kg/week)시 50 mcg/kg으로 간주됨
1370-002	MIS416: 토끼에서 26주 IV 독성 연구	MIS416을 26주간 매주 1회 투여하였다. 동물은 마지막 희생시 정밀 부검하였다. 1개월 회복 부문(arm)은 동물 2마리/성별/그룹으로 구성되었다	20, 200, 1000 mcg/kg(체중)	본 연구에서 NOAEL은 인간 안전 범위를 추정하기 위한 목적시 20 mcg/kg에 근접한 것으로 볼 수 있었음

표 1 독성 연구 요약

최대 26주간의 기간 동안 마우스와 토끼에 대해 수행한 독성 연구들은 환자에서 20 mcg/kg/주까지의 투여량 범위에서 장기간의 임상 실험들을 지원하기 위한 적합한 안전성 범위를 제공해준다.

독성 실험에서, MIS416은 유리형/용해성 MDP 보다 현저하게 낮은 독성을 가지는 것으로 확인된다.

실시예 5: 척추 손상 후 MIS416의 기능성 회복 강화력 측정

자일라진 (10 mg/kg, Troy laboratories Pty Ltd, Australia)과 졸레틸 (틸에타민/졸라제팜) (50 mg/kg, Virbac Australia Pty Ltd, Australia)의 50/50 혼합물을 IP 주사하여 마우스를 마취시켰다. 등쪽 흉추의 털을 제모하고, 제모된 피부를 식염수로 닦아낸 다음 클로르헥시딘과 70% 알코올로 소독하였다. 동물을 IH-0400 impactor (Precision Systems and Instrumentation (PSI), LLC, USA)의 고정판 위에 복와위로 위치시켰다. 무균 절차는 수술하는 동안 유지하였다. 타입 #11의 메스 날을 사용해 흉추 T6에서 T11으로 이어지는 추궁절제 부위에 수직 절개 (~2 cm)를 만들었다. 지방 조직이 상부 척추쪽 (대략 T7 위쪽)에 위치하고 있어, 잠재적으로 치명적인 출혈 발생을 방지하기 위해, 그 부근의 큰 혈관 (상대정맥)의 위치를 확인하도록 양쪽에서 조심스럽게 분리하였다. 척추의 우측 및 좌측에 위치한 척추 주위근을 #5 포셉을 사용해 T10에서 T8까지 절개하였다. 중앙의 근육질 (muscle flesh)을 모두 적출하여, 척추의 극돌기를 노출시켰다. T7, 8 & 9번의 척추 극돌기는 꼬리 방향으로 위치하고, T10번은 거의 후방 방향이며, T10과 T11의 척추 극돌기 사이에는 T10과 T9와 비교해 더 큰 갭이 존재하는 것으로서, T8번 및 T10번 척추의 위치를 식별하였다. 먼저 T9번 극돌기를 에디슨 포셉으로 고정하고 #2 포셉으로 양측 상의 추궁판 뼈(lamina bone)를 제거한 다음, T8번 극돌기를 에디슨 포셉으로 고정하고 T9번 극돌기를 제거함으로써, 추궁절제술을 수행하였다.

추궁절제술 시술 후, 척추를 임팩터의 고정판 위에서 에디슨 마이크로포셉을 사용해 T8 및 T10의 횡돌기를 두측과 미측에서 클램핑함으로써 안정시켰다. 마우스를 임팩터 아래에 위치시키고, 먼저 팁을 가능한 척수에 가깝게 낮춘 다음 포지션 센서를 반시계 반향으로 3번 돌려 팁을 위로 올림으로써, 팁을 조정하였다. IH 임팩터 소프트웨어를 사용해, IH-0400 임팩터의 1.3 mm 직경의 프로브에 의해 70 kilodyne-제어력을 척추에 인가하였다. 임팩터에서 동물을 꺼내고, 절개부의 양쪽척추주위근과 천근막을 봉합하여, 상해 부위를 덮고, 상처를 식염수로 깨끗하게 한 다음 피부를 클립핑하였다. 실험 그룹들 간에 전달력과 조직 배치에 유의한 차이는 없었다.

마우스에, 겐타마이신 (1 mg/kg, Troy laboratories Pty limited, Australia)이 첨가된 하트만 용액 (25 ㎕/g)을 수술하기 전에 수술 중에 가능한 탈수에 대한 전투약으로서 피하로 제공하였다. 동물을 수술한 후, 반사신경이 회복될 때까지 10-15분마다 육안 모니터링하고, 완전히 회복될 때까지 15-30분마다 육안으로 모니터링하였다. 마우스는 회복실에서 가열 패드 (절반은 켜고, 절반은 끔) 위에 밤새 둔 후, 다음날 동물 사육실 (holding room)로 이동시켰다. 수술 후 첫주에, 마우스의 체중을 측정하고, 겐타마이신을 1일 기준의 피하 투여량 (1 mg/kg)으로 제공하였다. 방광을 수동으로 매일 2회 눌러 짜내었다. 상해를 입은 마우스는 실험 기간 동안 꼬리를 이용해 집어들거나/다루지 않았으며, 사료와 물/겔을 무제한 접근가능하게 제공하였다.

MIS416을 3 mg/kg 또는 6 mg/kg으로, SCI 시술 후 24시간째에 이소플루란으로 마취한 후, 안와-후방 주사를 통해 전신 투여하였다.

널리-인정되는 임상 운동 척도인 운동 점수 평가 시스템 Basso Mouse Scale (BMS) (Basso et al 2006, Journal of Neurotrauma 23(5):635-59)을 이용해, 척추 손상 후 운동 회복을 평가하였다. 손상 효과를 평가하기 위해, 2명의 맹검 평가자가 독립적으로 손상 후 1일, 3일 및 7일에 마우스에 점수를 매겼다.

손상 후 7일째에 마우스를 희생시켰다. 마우스에 PBS를 심장내로 주입하고, 척추 전체를 분리하고, 유세포 측정 분석을 위해 단핵구 세포를 추출하였다. 간략하게는, 척추 조직을 작은 조각으로 자르고, 45분간 37℃에서 DNAse와 콜라게나제로 분해시켰다. 그런 후, 70 ㎛ 체를 통과시켜 조직을 균질화하고, 33% 퍼콜 농도구배로 단핵구 세포를 분리한 다음 시험관 바닥에서 수집하였다. 세포를 다음과 같은 항체-형광단 접합체 (Biolegend, USA)로 표지하였고: CD45-BV510, CD115-AF488, CD11b-BV421, CD11c-PE/Dazzle 594, MHC 클래스 II (IA-IE)-APC/Cy7, CX3CR1-AF647, CCR2-PE, GR1-PerCp/Cy5.5, Fortessa X20 유세포 측정기 (BD Biosciences, USA)를 이용해 획득하였다. 데이타는 FlowJo 소프트웨어 (Treestar, USA)로 분석하였다. 척추의 말초혈-유래 대식세포를, 다른 말초혈-유래 골수성 세포와 미세교세포로부터 다음과 같은 표현형에 기반하여 구분하였다: CD45^Hi CD11b⁺ CCR2^Lo CX3CR1⁺ Gr1^- CD11c⁺. 이들 세포의 활성화 상태는 MHC 클래스 II 공동-발현 수준에 의해 결정하였다.

도 3은 척추 손상 (SCI) 후 1일, 3일 및 7일째에 척추 손상된 마우스에서의 Basso Mouse Scale 측정을 도시한 것이다. MIS416 (3 mg/kg 또는 6 mg/kg) 또는 식염수를 손상 1일 후 전신 투여하였다. 식염수 처리한 SCI 그룹의 경우, SCI 후 7일까지 최소로 회복되었지만, MIS416 처리 그룹에서는 7일까지 운동 능력이 회복되었고, 6 mg/kg MIS416 처리 그룹에서는 식염수 대조군과 비교해 통계학적으로 유의한 수준에 도달하였다.

도 4는 손상에 대한 반응으로 활성화된 말초혈 유래 대식세포를 정량하기 위한 SCI 후 7일째에 회수한 마우스의 척추에 대한 유세포 측정 분석 결과를 보여준다. 척추 실질 (the spinal cord parenchyma)에서의 대식세포 활성화는 염증이 발생된 척추 미세환경에 대한 직접적인 소스이다. 대식세포는 전-염증성 사이토카인과 신경독소의 소스이다. 염증성이 낮은 대식세포가 회복 경로를 지원하는데 더 유능할 수 있다. 대식세포 활성화는, MHC 클래스 II를 발현하는 전체 대식세포의 % (도 4A)를 토대로, 건강한 대조군과 비교해, 식염수 처리된 SCI 마우스에서 명확하게 입증된다. MIS416 처리 그룹 둘다 식염수/SCI 처리 그룹에 비해 활성화된 대식세포의 비율의 명확한 감소를 보인다. 이러한 사실은 식염수/SCI 처리 그룹과 비교해, MHC 클래스 II⁺ 대식세포 상의 MHC 클래스 II의 발현 수준 감소를 뒷받침해준다 (도 4B).

Claims (15)

1. 개체에서 신경 손상을 예방학적으로 및/또는 치료학적으로 치료하기 위한, 가교에 의해 미세입자 (MDP 미세입자)를 형성하는 무라밀 다이펩타이드 (muramyl dipeptide)를 포함하는 약학 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 MDP 미세입자가 DNA 단편을 포함하는, 약학 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 조성물이 신경 손상에 의해 손상된 신경계의 회복을 촉진하는, 약학 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 조성물이 신경 손상에 의해 손상된 운동 기능을 강화하는, 약학 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 신경 손상이 척추 손상인, 약학 조성물.
6. 제1항에 있어서, 상기 신경 손상이 탈수초화 (demyelination)인, 약학 조성물.
7. 제1항에 있어서, 상기 조성물이 개체에서 하나 이상의 신경보호 인자/회복 인자의 수준을 증가시키는, 약학 조성물.
8. 제7항에 있어서, 상기 신경보호 인자/회복 인자가 혈관 내피 성장인자, 인슐린 성장인자-1, 간세포 성장인자 및 에리트로포이에틴으로부터 선택되는, 약학 조성물.
9. 제1항에 있어서, 상기 조성물이 대식세포의 활성화를 낮추는, 약학 조성물.
10. 제1항에 있어서, 상기 조성물이 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제, 담체, 비히클 또는 희석제를 더 포함하는, 약학 조성물.
11. 제1항에 있어서, 상기 조성물이 개체에게 비경구로 투여되는, 약학 조성물.
12. 제11항에 있어서, 상기 조성물이 개체에게 정맥내로 투여되는, 약학 조성물.
13. 제1항에 있어서, 상기 조성물이 개체에게 경구로 투여되는, 약학 조성물.
14. 제1항에 있어서, 상기 조성물이 개체에게 매주 투여되는, 약학 조성물.
15. 제1항에 있어서, 상기 조성물이 개체에게 2주마다 투여되는, 약학 조성물.

Images