KR20100080112A

KR20100080112A - 에리스로포이에틴을 함유하는 발모 촉진 또는 탈모 방지용 조성물

Info

Publication number: KR20100080112A
Application number: KR1020080138743A
Authority: KR
Inventors: 김후정
Original assignee: 김후정
Priority date: 2008-12-31
Filing date: 2008-12-31
Publication date: 2010-07-08
Also published as: WO2010077093A3; WO2010077093A2; WO2010077093A9

Abstract

본 발명은 에리스로포이에틴(Erythropoietin; EPO)을 함유하는 발모 촉진 또는 탈모 방지용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 에리스로포이에틴이 모발의 성장을 촉진하고, 모근 세포의 성장인자로 알려진 인간 혈관내피 성장인자(human-Vascular endothelial growth factor C; hVEGF), 인간 각질세포 성장인자(human-keratinocyte growth factor; hKGF), 인간 인슐린 유사 성장인자(human-Insulin like Growth Factor; hlGF) 및 인간 특대 기저세포 림프종(human-Basal cell lymphoma-extra large; hBCLXL)의 발현을 촉진함으로써 발모 촉진 또는 탈모 방지용 조성물의 유효성분으로 유용하게 이용될 수 있다.

에리스로포이에틴(Erythropoietin), 발모, 탈모 방지.

Description

에리스로포이에틴을 함유하는 발모 촉진 또는 탈모 방지용 조성물{A composition comprising Erythropoietin for promoting hair growth or inhibiting hair loss}

본 발명은 에리스로포이에틴(Erythropoietin)을 함유하는 발모 촉진 또는 탈모 방지용 조성물에 관한 것이다.

대머리에 관한 역사는 매우 길며 이에 따른 탈모 치료에 관한 처방의 역사 역시 이미 5000여년 전 이집트(Egypt)의 파피루스(Papyrus)에도 쓰여져 있는 것으로 알려져 있으며, 기원전 400년경 유명한 그리스의 히포크라테스(Hipocrates) 역시 자신의 탈모를 여러 가지 방법으로 치료하려 하였으나 불행히도 탈모 치료에 효과가 있던 치료법의 개발에는 실패한 것으로 전해져, 많은 현대인 뿐 아니라 고대인 역시 대머리와 탈모치료 및 발모 기술에는 지극한 관심을 가져왔으나 그 기술에는 도달하지 못하였다.

현대 사회는 많은 스트레스로 인해 생체가 서서히 손상을 받고 있으며 이로 인한 모발손실이 커다란 사회 이슈가 되고 있다. 모발 손실은 모발 성장의 부진과 모근 세포의 성장촉진을 하는 성장인자의 결핍으로 유발된다. 또한, 모발 및 모근 세포의 조기 사망에 의해 탈모가 가속되는 것으로 알려져 있다. 따라서 이를 극복하는 인자의 개발이 모발 손실을 극복하는 목표가 될 것이다.

탈모는 여러가지 원인에 의해 발생되며 전세계적으로 발병률이 높다. 또한, 탈모는 정신적 스트레스로 삶의 질을 저하시키며 대인관계나 사회생활에 많은 지장을 준다. 이런 탈모는 여러 질병과 관련이 있으며 외모를 중시하는 사회적 풍토가 상당히 진행되는 있는 지금은 질병으로서 그 원인과 치료에 관심이 높아졌으며 최근에는 하나의 이슈로 받아들여지고 있다. 탈모는 유전적 요인 이외에 스트레스나 환경 오염 등 외부적 요인에 의해 성별 또는 연령대를 막론하고 야기되어 국내의 탈모 인구가 2006년 약 5백만명에서 올해 9백만명까지 증가한 것으로 추산하고 있다. 이와 관련하여 발모 및 탈모 방지 관련 시장이 급팽창하고 있으며, 국내 시장규모가 2005년 약 8천억대에서 올해 약 2조원대로 성장되었다. 이중 탈모 치료제 시장은 2007년 약 3백억원 규모를 형성했는데 올해 약 5백억원에 육박하였다.

현재 전세계적으로 대머리 및 탈모 방지를 위한 많은 발모제들이 시판되어 지고 있으나 아직도 치료효과를 만족할 수 있는 약물이나 기술은 미미한 실정이다. 미국 식품의약청인 FDA가 임상실험을 거쳐 발모제로 유일하게 승인한 약물은 미녹시딜(minoxidil)로 원래 고혈압 치료제로써 개발되어 발견된 부작용의 일종인 발모를 상품화한 것이며 전세계에서 최초로 미국 연방정부가 공인한 최초의 대머리 및 탈모증 치료약이다. 또한, 현재 사용되는 다른 약물로 프로페시아(Propecia)가 있 는데 이는 탈모의 원인 중 호르몬설에 근거를 둔 것으로 남성호르몬은 5-알파환원효소의 작용을 받아 대사산물인 디하이드로테스토스테론(DHT)으로 바뀌는데 이 물질이 모낭을 위축, 소멸시키는 것으로 알려져 있다. 상기 프로페시아는 5-알파환원효소를 차단함으로써 DHT생성을 억제하여 남성형 탈모가 진행되는 것을 최대한 늦추는 효과가 있는 것으로 이 약물의 효과는 발모가 아니라 탈모의 추가방지에 있는 것이다.

그 외에도 발모 및 탈모 방지에 효과 있다고 알려진 물질들이 보고되고 있으다. 예를 들어, 화합물로는 사이클로스포린(Cyclosporin) 유도체(대한민국 등록특허 10-0439467, 대한민국 등록특허 10-0695611), N-헤테로사이클릭 카복실산 및 카르밤산염(대한민국 공개특허 10-2001-0052502), 퀴나졸리논 유도체(대한민국 공개특허 10-1999-0023754), 크라이신 7-Ｏ-크로토네이트(대한민국 공개특허 10-2001-0009474) 및 1,2-이치환벤젠카르복사미드 유도체(대한민국 공개특허 10-1999-0037394) 등이 보고된 바 있으며, 부작용이 적은 천연물로는 사삼 추출물(대한민국 공개특허 10-2005-0102346), 살구씨오일(대한민국 공개특허 10-2004-0092755), 석곡 추출물(대한민국 공개특허 10-2006-0008662), 백두옹 추출물(대한민국 공개특허 10-2005-0102345), 인디고 추출물(대한민국 공개특허 10-2005-0077310) 및 상황버섯 추출물(대한민국 등록특허 10-0348155) 등이 보고된 바 있다. 이런 물질들의 효과는 미미하여 그 효과를 기대하기에는 장기간의 치료가 필요하며 중단시에는 다시 탈모가 진행하는 양상을 보이고 있다. 그러므로 많은 경우 평생에 걸쳐 사용해야 하며 장기간의 사용시에 나타날 수 있는 부작용들도 환자의 고통을 증가시킬 수 있다.

에리스로포이에틴(Erythropoietin; EPO)은 콜로니 자극 인자(colony stimulating factor; CSF) 중 하나인 당단백질로써 신장에서 주로 생성되며(Youssoufian H. et al., Blood 81, 2223-2236, 1993), 간에서도 소량 생성되는 것으로 알려져 있다. 에리스로포이에틴은 적혈구 계열의 전구세포의 성장 및 분화를 촉진시켜 성숙한 적혈구의 생성을 도와주는 역할을 하므로, 신장기능 장해로 인한 빈혈, 골수이식성 빈혈, 류마티스성 빈혈, 암 또는 항암제 관련 빈혈, AIDS성 빈혈 등에 이용될 수 있고, 재생 불량성 빈혈 환자 및 만성 신부전증 환자 치료에 광범위하게 이용되고 있다(Jelkmann, W., Clin. Invest. 72, S3-310, 1994).

최근에는 에리스로포이에틴의 획기적인 조직보호능력이 보고되고 있다. 이는 현재까지의 정확한 기전은 알려져 있지 않으나, 세포사멸(apoptosis)을 막아주며 혈류공급 등에 의한 것으로 알려져 있다(Brines, M. et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 97, 10526-10531, 2000). 이와 관련하여, 에리스로포이에틴이 저산소 또는 화합물 등의 스트레스에 의한 세포사멸로부터 모낭(hair follicle)을 보호할 수 있음이 보고된 바 있다(Bodo E, et al., FASEB J. 2007 oct;21(12):3346-54).

그러나, 에리스로포이에틴이 직접 모발 성장을 촉진시켜 발모 촉진 및 탈모 방지 효능을 가진다는 보고는 없으며, 상기 Bodo 등의 문헌에서는 모간의 성장에 영향이 없다고 기재하고 있다.

이에, 본 발명자들은 에리스로포이에틴의 발모 촉진 및 탈모 방지에서의 효과를 알아보기 위해 연구하던 중, 에리스로포이에틴이 모발의 성장을 촉진하고, 모근세포의 성장인자로 알려진 hVEGF, hKGF, hlGF 및 hBCLXL의 발현을 촉진하여 발모 촉진 또는 탈모 방지용 조성물의 유효성분으로 이용될 수 있음을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 에리스로포이에틴(Erythropoietin)을 함유하는 발모 촉진 또는 탈모 방지용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 에리스로포이에틴(Erythropoietin)을 유효성분으로 함유하는 발모 촉진용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 발모 촉진 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 에리스로포이에틴을 유효성분으로 함유하는 발모 촉진용 외용제를 제공한다.

또한, 본 발명은 에리스로포이에틴을 유효성분으로 함유하는 탈모 방지용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 탈모 방지 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 에리스로포이에틴을 유효성분으로 함유하는 탈모 방지용 외용제를 제공한다.

본 발명의 에리스로포이에틴(Erythropoietin)은 모발 성장을 촉진하고 모근 세포의 성장인자 발현을 촉진하여 발모를 촉진하며, 배양된 모근 세포의 생존을 촉진하여 탈모를 지연시킴으로써, 외부 스트레스에 대한 모발 보호 및 모발 생성촉진기능을 함께 가지는 발모제 또는 탈모 방지제로 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명에서 사용하는 용어를 정의한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "개체"는 본 발명의 조성물을 투여하여 발모 촉진 또는 탈모 억제의 증상이 호전될 수 있는 질환을 가진 인간, 원숭이, 개, 염소, 돼지 또는 쥐 등 모든 동물을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜 또는 위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 이는 개체의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 에리스로포이에틴(Erythropoietin; EPO)을 유효성분으로 함유하는 발모 촉진 및 탈모 방지용 조성물을 제공한다.

본 발명의 에리스로포이에틴은 인간을 포함한 모든 포유류 유래의 에리스로포이에틴을 포함할 수 있다. 상기 에리스로포이에틴은 자연적으로 존재하는, 즉 야생형 형태 뿐만 아니라, 야생형의 생물학적 효과를 나타내는 한, 이의 유도체(derivatives), 동족체(analogs), 변형체, 변이 단백질(mutein) 또는 변종체들을 포함할 수 있다.

상기 유도체(derivatives)는 기본적인 에리스로포이에틴 구조를 보유한 채, 하나 또는 그 이상의 원자 또는 분자단 또는 라디칼의 치환, 특히 에틸렌 글리콜과 같은 당 사슬의 치환에 의해 얻어지거나, 또는 아미노산 서열이 자연적으로 존재하는 인간 또는 동물 에리스로포이에틴 단백질의 것과 적어도 한 위치에서 다르나 본질적으로 아미노산 레벨 및 유사한 생물학적 활성에서 높은 상동성(homology)을 가지는 에리스로포이에틴의 기능적 동등물 또는 유도체를 의미한다. 상기 상동성은 둘 또는 그 이상의 폴리펩티드 분자 사이의 관계도를 의미하는데 적어도 80 % 이상, 바람직하게는 적어도 90 % 이상의 서열 일치를 의미한다. 에리스로포이에틴 유도체와 천연 에리스로포이에틴 사이의 차이는 예를 들어 에리스로포이에틴 아민산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 결실, 치환, 삽입, 부가, 염기 교환 또는 재조합과 같은 돌연변이를 통하여 일어날 수 있다. 따라서 본 발명의 유도체는 돌연변이 에리스로포이에틴 분자, 즉 에리스로포이에틴 돌연변이 단백질을 포함한다.

상기 동족체(analogs)는 에리스로포이에틴 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖지 않지만 그 3차원 구조가 에리스로포이에틴과 매우 유사하여 상응하는 생물학적 활성을 갖는 화합물을 포함한다. 예를 들어, 적절한 입체적 배치에서 에리스로포이에틴의 수용체와의 결합에 책임이 있는 아미노산 잔기를 포함하고 이에 따라 에리스로포이에틴 결합 부위의 필수적인 표면 특성을 자극할 수 있는 화합물일 수 있다.

본 발명의 에리스로포이에틴은 여러 가지 방식으로, 예를 들어 인간 요로부터 또는 재생불량성 빈혈 환자의 요 또는 혈장(혈청을 포함하는)으로부터 분리하는 것에 의해 생산될 수 있다. 인간 에리스로포이에틴은 인간 신장암세포의 조직 배양으로부터, 인간 에리스로포이에틴을 생산하는 능력을 갖는 림프 모세포로부터, 및 인간 세포주의 세포 융합에 의해 얻어진 융합세포 배양으로부터 얻어질 수도 있다. 또한, 에리스로포이에틴은 적절한 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 또는 RNA를 사용하여 원하는 단백질을, 예를 들어 세균, 효모, 식물세포주 또는 동물세포주 내에서 재조합 방식으로 생산하는 유전공학방식에 의해 생산될 수도 있다.

본 발명에서는 에리스로포이에틴이 모발 성장 촉진 효능을 가지는지 알아보기 위해, 인체에서 분리한 모낭을 상기 분리한 모낭을 대조군으로서 기본배지에서 배양하고, 실험군으로서 상기 기본배지에 10 U/ml의 에리스로포이에틴을 첨가한 배지에 배양하면서 모낭의 길이를 측정하였다. 그 결과, 모낭의 길이는 에리스로포이에틴을 첨가한 실험군이 대조군에 비해 배양 시간에 따라 길이 성장이 더 증가하는 것을 알 수 있었다(도 1 참조). 따라서, 에리스로포이에틴이 모낭의 길이 성장 을 증가시킴으로써 발모를 촉진시키는 것을 알 수 있다.

또한, 본 발명에서는 에리스로포이에틴이 모근세포 성장인자의 발현을 촉진시키고 세포사멸 유도 인자의 발현을 억제하는 효능을 가지는지 알아보기 위해, 인체 모낭의 진피세포인 모유두 세포로부터 분리한 모낭을 대조군은 에리스로포이에틴(Erythropoietin)을 첨가하지 않은 기본배지에서 모낭을 대조군으로서 기본배지에서 배양하고, 실험군으로서 상기 기본배지에 10 U/ml의 에리스로포이에틴을 첨가한 배지에 배양한 후, total RNA 추출하고 이로부터 cDNA를 합성한 다음, RT-PCR 및 Real time-PCR을 이용하여 다양한 단백질들의 발현 정도를 확인하였다. 그 결과, 에리스로포이에틴을 첨가한 실험군이 대조군에 비해 모근 세포의 성장인자인 hVEGF, hKGF, hlGF 및 hBCLXL의 발현을 유의적으로 증가시켰다. 따라서, 에리스로포이에틴이 모근 세포의 성장을 촉진시키고 생존을 유지시킴으로써 발모를 촉진하고 탈모를 억제하는 것을 알 수 있다(도 2 내지 도 5 참조).

따라서, 에리스로포이에틴은 모발 성장을 촉진시키고, 모근 세포의 성장인자 발현을 촉진하며, 모근 세포의 생존을 유지시킴으로써 발모 촉진 및 탈모 지연 기능을 가지는 것을 알 수 있다. 그러므로 본 발명의 에리스로포이에틴은 발모 촉진 및 탈모 방지용 조성물의 유효성분으로 이용될 수 있음을 알 수 있다.

본 발명의 에리스로포이에틴을 의약품으로 사용하는 경우, 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

상기 에리스로포이에틴은 임상 투여 시에 비경구로 투여가 가능하며 일반적 인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.

즉, 본 발명의 에리스로포이에틴은 실제 임상 투여 시에 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 상기 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 에리스로포이에틴의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 일일 투여량은 에리스로포이에틴의 양을 기준으로 0.0001 내지 100 ㎎/㎏이 바람직하고, 0.001 내지 10 ㎎/㎏이 더욱 바람직하며, 하루 1 ~ 6 회 투여될 수 있다.

본 발명의 에리스로포이에틴은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 에리스로포이에틴을 유효성분으로 함유하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 발모 촉진 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 에리스로포이에틴을 유효성분으로 함유하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 탈모 방지 방법을 제공한다.

상기 조성물은 에리스로포이에틴에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

상기 조성물은 임상 투여 시에 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.

상기 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 일일 투여량은 에리스로포이에틴의 양을 기준으로 0.0001 내지 100 ㎎/㎏이 바람직하고, 0.001 내지 10 ㎎/㎏이 더욱 바람직하며, 하루 1 ~ 6 회 투여될 수 있다.

아울러, 본 발명은 에리스로포이에틴을 유효성분으로 함유하는 발모 촉진 또는 탈모 방지용 외용제를 제공한다.

본 발명의 에리스로포이에틴은 모발 성장을 촉진시키고, 모근 세포의 성장인자 발현을 촉진하며, 모근 세포의 생존을 유지시킴으로써 발모 촉진 및 탈모 방지용 조성물의 유효성분으로 이용될 수 있음을 알 수 있다.

상기 에리스로포이에틴은 외용제로 사용하는 경우, 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전 제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 피부용 외용제에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 관련분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 또한 상기 성분들은 관련분야에서 통상적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.

상기 외용제는 크림, 로션, 연고, 겔, 점액, 스프레이 및 습포제로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 형태인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 외용제를 화장품으로 사용하는 경우, 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조할 수 있다. 유화 제형의 화장품으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 가용화 제형의 화장품으로는 유연화장수가 있다. 적합한 화장품의 제형으로는 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예, 실험예 및 제조예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예, 실험예 및 제조예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 생체 외(Ex vivo) 모낭 조직배양을 이용한 모발성장 측정

<1-1> 모낭의 분리

본 발명자들은 informed written content를 받은 정상 성인으로부터 후두부 두피 조직에서 구멍생검(punch-biopsy, 직경 4 mm)을 통해 모낭을 분리하였고, 이중 생장기 모낭을 선별하였다. 모낭의 분리는 Philpott 등(Philpott MP, et al., J Cell Sci 1990;97;463-471)의 방법을 변형하여 분리하였다. 우선, 진피-피하지방층의 경계부를 15번 메스로 두피 조직을 반으로 나누어 윗부분을 버리고, 아랫부분은 피부의 진피세포인 섬유아세포와의 오염을 막기 위해 모낭 주변 조직들을 정리하였다. 정리된 모낭은 최대한의 성장을 위해 표피(epidermis)와 피지선(sebaceous gland)을 제거하였다.

<1-2> 모낭의 배양

분리한 생장기 모낭을 William E 배지(W 412H, Sigma, St. Louis, MO, USA) 1 ㎖에 각 실험조직당 6 ~ 8개의 모낭을 넣고 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 모낭은 배지안에서 자유롭게 부유하면서 배양하였다. 대조군은 에리스로포이에틴(Erythropoietin)을 첨가하지 않은 기본배지에서 모낭을 배양하였으며, 실험군은 기본배지에 10 U/ml의 에리스로포이에틴을 첨가하였다.

<1-3> 모낭의 길이 측정

모낭의 길이는 모구의 끝에서 모간(hair shaft)의 절단부까지로 정하였으며, Filar micrometer eyepiece(American Optical, NY, USA)를 이용하여 3일 간격으로 모낭의 길이를 측정한 후 배양액을 교체하였으며, 총 배양 9일까지 측정한 후에 통계 처리하였다. 모낭의 길이 성장 및 모낭의 생장기 유지 기간을 비교하기 위하여 모낭의 길이 성장 항목을 repeated measure ANOVA 검정하였으며, 생존분석을 위하여 Kaplan-Meier survival analysis를 이용하여 Log-rank test로 생존곡선을 비교하였다. 통계 프로그램(SPSS, Win 10.0)을 이용하였으며 통계적 유의성은 p＜0.05로 하였다.

그 결과, 도 1에서 보는 바와 같이 모낭의 길이는 에리스로포이에틴(Erythropoietin)을 첨가한 실험군이 대조군에 비해 배양 3일째까지는 유사하였으나, 배양 6일 후 약 2.5 mm 더 성장하였고, 배양 9일 후 약 3 mm 더 성장하였다. 즉, 전체 배양기간 동안 생장기 유지 비율은 실험군이 대조군과 유사하였으나 실험군에서 시간에 따라 길이 성장이 증가하는 경향을 나타내었다. 따라서, 에리스로포이에틴이 모낭의 길이 성장을 증가시킴으로써 발모를 촉진시키는 것을 알 수 있어다(도 1).

<실시예 2> 모근세포 성장인자 및 세포사멸 유도 인자의 발현 측정

<2-1> 모유두(dermal papilla, DP)의 분리 및 배양

인체 모낭의 진피세포인 모유두 세포는 안드로겐성 탈모환자의 후두부로부터 얻어진 두피 조직에서 상기 실시예 <1-1>의 방법으로 모낭을 분리한 후, Magerl 등(Magerl M. et al., Exp Dermatol 2002;11;381-385)의 방법을 변형하여 분리하였다. 우선, 수술용 입체박리 현미경 하에서 미세수술용 포셉으로 모구(hair bulb)의 바로 윗부분을 잡고 서서히 압력을 가하면서, 모구의 아랫부분에 있는 결체조직초낭(connective tissue sheath capsule)을 비스듬히 절개하여 잘라내고 주사바늘로 그것의 끝 부분을 눌러 공 모양의 모유두를 튀어나오게 하여 분리하였다. 분리된 모유두를 제 1형(type 1) 콜라겐이 코팅된 배양접시(Iwaki Glass, Japan)에 넣고 20% FBS가 첨가된 DMEM 배양액[페니실린(penicillin)(100 u/ml), 스트렙토마이신(streptomycin)(100ug/ml), 펀지존(fungizone)(250ng/ml) 첨가]에서 모유두 세포가 자라나오도록 하였다. 1 ~ 2주 후 약 70 ~ 80% 정도의 세포층을 보이면 일반 폴리에틸렌 배양접시로 계대배양하고 10% FBS가 첨가된 DMEM용액으로 배양하였다. 대조군은 에리스로포이에틴(Erythropoietin)을 첨가하지 않은 기본배지에서 모낭을 배양하였으며, 실험군은 기본배지에 10 U/ml의 에리스로포이에틴을 첨가하였다. 이하, 실험은 배양 6시간 후 및 18시간 후의 모유두 세포를 이용하여 각각 수행하였다.

<2-2> 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcription-polymerase chain reaction; RT-PCR) 이용한 모발 성장인자의 발현 측정

상기 실시예 <1-1>에서 6시간 및 18시간 배양된 모유두 세포 및 모낭조직으로부터 각각 total RNA를 분리하였다. 상기 total RNA는 Trizol(Invitrogen, CA, USA)을 사용하여 추출되었다. 세포나 조직을 Trizol로 녹인 후 1/10의 1-브로모-3-클로로 프로판(1-bromo-3-chloro propane)을 첨가하여 세게 교반한 다음 수용액 층을 수거하였다. 동량의 이소-프로판올(iso-propanol)을 첨가하고 -20℃에서 3시간 방치하여 total RNA를 침전시켰다. 침전된 펠릿(pellet)을 DEPC(diethylpyrocarbonate) 처리된 물에 녹인 다음 UV 분광계로 260 및 280 nm의 흡광도를 측정하여 정성 및 정량 분석하였다. 가역 전사반응(reverse transcription; RT)은 5 ug의 total RNA를 70℃, 10분간 oligo-dT 프라이머(primer)로 어닐링(annealing)한 후에 Improm-Ⅱ^™ reverse transcription system(Promega, Madison, USA)를 사용하여 42℃에서 2시간 동안 수행하였다. 그 결과로 얻어진 cDNA 생성물은 반응 완충용액, dNTP, MgCl₂, GoTag DNA 폴리머라제(polymerase)와 각 유전자의 프라이머 쌍(primer pair)[IGF-1 포워드(Forward) 5'-TCAACAAGCCCACAGGGTAT-3'(서열번호: 1), 리버스(Reverse) 5'-ACTCGTGCAGAGCAAAGGAT-3'(서열번호: 2); HGF 포워드 5'-CGAGGCCATGGTGCTATACT-3'(서열번호: 3), HGF 리버스 5'-ACACCAGGGTGATTCAGACC-3'(서열번호: 4); KGF 포워드 5'-GACATGGATCCTGCCAACTT-3'(서열번호: 5), 리버스 5'-AATTCCAACTGCCACTGTCC-3'(서열번호: 6); VEGF 포워드 5'-TCTTCAAGCCATCCTGTGTG-3'(서열번호: 7), 리버스 5'-GCGAGTCTGTGTTTTTGCAG-3'(서열번호: 8); 및 BclX/L 포워드 5'-CTGAATCGGAGATGGAGACC-3'(서열번호: 9), 리버스 5'-TGGGATGTCAGGTCACTGAA-3'(서열번호: 10)]과 혼합한 다음 PCR 반응에 의해 증폭되었다. 상기 PCR 반응은 94℃에 서 2분간 초기 변성(initial denaturation), 28 ~ 35회 사이클 동안 94℃에서 1분간 변성(denaturation), 60℃에서 1분간 어닐링(annealing) 및 72℃에서 1분간 연장(extension)으로 반복 반응을 시킨 후, 마지막으로 72℃ 5분간 연장(extension) 반응을 진행시킨 다음, 4℃로 유지되었다.

그 결과, 도 2 및 도 3에서 보는 바와 같이 에리스로포이에틴을 첨가한 실험군이 대조군에 비해 모근 세포의 성장인자인 hVEGF, hKGF 및 hlGF의 발현이 유의적으로 증가하였다. 따라서, 에리스로포이에틴은 모근 세포의 성장을 촉진시킴으로써 발모를 촉진할 수 있음을 알 수 있다(도 2 및 도 3).

<2-3> 실시간 중합효소 연쇄반응(Real time-polymerase chain reaction; Real time-PCR) 이용한 hBCLXL 인자의 발현 측정

상기 실시예 <2-2>에서 합성한 모유두 cDNA 및 hBCLXL 유전자의 프라이머 쌍을 이용하여, 에리스로포이에틴을 첨가한 배지에서 배양된 실험군 및 에리스로포이에틴이 첨가되지 않은 배지에서 배양된 대조군의 hBCLXL의 발현을 Real time-PCR을 수행하였다.

그 결과, 도 4 및 도 5에서 보는 바와 같이 에리스로포이에틴을 첨가한 실험군에서는 대조군에 비해 hBCLXL의 발현이 유의적으로 증가하였다. 따라서, 에리스로포이에틴은 hBCLXL 발현을 증가시켜 세포 자연사멸사(apoptosis)를 방지함으로써 모근 세포의 생존을 촉진하여 탈모를 방지할 수 있음을 알 수 있다(도 4 및 도 5).

하기는 본 발명의 에리스로포이에틴을 함유시킨 몇몇 제제화 방법을 예시한 것으로 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

<제제예 1> 정제(직접 가압)

에리스로포이에틴 5.0 ㎎을 락토스 14.1 ㎎, 크로스포비돈 USNF 0.8 ㎎ 및 마그네슘 스테아레이트 0.1 ㎎을 혼합하고 가압하여 정제로 제조하였다.

<제제예 2> 정제(습식 조립)

에리스로포이에틴 5.0 ㎎을 락토스 16.0 ㎎과 녹말 4.0 ㎎을 섞었다. 폴리솔베이트 80 0.3 ㎎을 순수한 물에 녹인 후 이 용액의 적당량을 첨가한 다음, 미립화하였다. 건조 후에 미립을 체질한 후 콜로이달 실리콘 디옥사이드 2.7 ㎎ 및 마그네슘 스테아레이트 2.0 ㎎과 섞었다. 미립을 가압하여 정제로 제조하였다.

<제제예 3> 분말과 캡슐제

에리스로포이에틴 5.0 ㎎을 락토스 14.8 ㎎, 폴리비닐 피롤리돈 10.0 ㎎, 마그네슘 스테아레이트 0.2 ㎎와 함께 혼합하였다. 상기 혼합물을 적당한 장치를 사용하여 단단한 No. 5 젤라틴 캡슐에 채웠다.

<제제예 4> 주사제

에리스로포이에틴 100 mg을 함유시키고, 그 밖에도 만니톨 180 mg, Na₂HPO₄12H₂O 26 mg 및 증류수 2974 mg를 함유시켜 주사제를 제조하였다.

<제제예 5> 유화 제형의 외용제 제조

하기 표 1에 기재된 조성으로 유화제형을 제조하였다. 제조 방법은 하기와 같다.

1) 1 내지 9의 원료를 혼합한 혼합물을 65∼70℃로 가열하였다.

2) 10의 원료를 상기 단계 1)의 혼합물에 투입하였다.

3) 11 내지 13의 원료의 혼합물을 65∼70℃로 가열하여 완전히 용해시켰다.

4) 상기 단계 3)을 거치면서, 상기 2)의 혼합물을 서서히 첨가하여 8,000 rpm에서 2∼3분간 유화시켰다.

5) 14의 원료를 소량의 물에 용해시킨 후 상기 단계 4)의 혼합물에 첨가하고 2분간 더 유화시켰다.

6) 15 내지 17의 원료를 각각 평량한 후 상기 단계 5)의 혼합물에 넣고 30초간 더 유화시켰다.

7) 상기 단계 6)의 혼합물을 유화 후 탈기과정을 거쳐 25∼35℃로 냉각시킴으로써 유화제형의 화장품을 제조하였다.

유화 제형 1, 2, 3의 조성

조성		유화제형 1	유화제형 2	유화제형 3
1	스테아린 산	0.3	0.3	0.3
2	스테알리 알콜	0.2	0.2	0.2
3	글리세릴 모노스테아레이트	1.2	1.2	1.2
4	밀납	0.4	0.4	0.4
5	폴리옥시에틸렌솔비탄 모노라우린산 에스테르	2.2	2.2	2.2
6	파라옥시안식향산 메틸	0.1	0.1	0.1
7	파라옥시안식향산 프로필	0.05	0.05	0.05
8	세틸에틸헥사노에이트	5	5	5
9	트리글리세라이드	2	2	2
10	사이클로메티콘	3	3	3
11	증류수	~ 100	~ 100	~ 100
12	농글리세린	5	5	5
13	트리에탄올아민	0.15	0.15	0.15
14	폴리아크릴산 중합체	0.12	0.12	0.12
15	색소	0.0001	0.0001	0.0001
16	향	0.10	0.10	0.10
17	에리스로포이에틴	0.0001	1	10

<제제예 6> 가용화 제형의 외용제 제조

하기 표 2에 기재된 조성으로 가용화 제형을 제조하였다. 제조 방법은 하기와 같다.

1) 2 내지 6의 원료를 1의 원료(정제수)에 넣고 아직믹서를 이용하여 용해시켰다.

2) 8 내지 11의 원료를 7의 원료(알코올)에 넣고 완전용해시켰다.

3) 상기 단계 2)의 혼합물을 상기 단계 1)의 혼합물에 서서히 첨가하면서 가용화시켰다.

가용화 제형 1, 2, 3의 조성

조성		가용화 제형 1	가용화 제형 2	가용화 제형 3
1	정제수	~ 100	~ 100	~ 100
2	농글리세린	3	3	3
3	1,3-부틸렌글리콜	2	2	2
4	EDTA-2Na	0.01	0.01	0.01
5	색소	0.0001	0.0002	0.0002
6	에리스로포이에틴	0.1	5	5
7	알코올(95%)	8	8	8
8	파라옥시안식향산 메틸	0.1	0.1	0.1
9	폴리옥시에틸렌 하이드로제네이디트에스테르	0.3	0.3	0.3
10	향	0.15	0.15	0.15
11	사이클로메티콘	-	-	0.2

본 발명은 에리스로포이에틴의 모발에 대한 작용 기작 연구, 최근에 급팽창하고 있는 발모 및 탈모 관련 시장에 요구되는 약학 제제 개발, 및 항생제 또는 항암제 등에 의한 모발 보호 효능 및 조혈 기능을 함께 가지는 획기적인 발모제 및 탈모 방지제 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 인체 유래 모낭을 배양하면서 3일 간격으로 모낭의 길이를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다:

control: 기본배지에서 배양된 모낭; 및

EPO(10 U/ml): 기본배지에 10 U/ml의 에리스로포이에틴을 첨가한 배지에서 배양된 모낭.

도 2는 인체 유래 모낭의 진피세포인 모유두 세포를 6시간 동안 배양한 후, total RNA를 분리하고 이로부터 cDNA를 합성한 다음 Rt-PCR을 이용하여 모근 세포의 성장인자의 발현 정도를 나타내는 그래프이다:

control: 기본배지에서 배양된 모유두 세포; 및

EPO: 기본배지에 에리스로포이에틴을 첨가한 배지에서 배양된 모유두 세포.

도 3은 인체 유래 모낭의 진피세포인 모유두 세포를 18시간 동안 배양한 후, total RNA를 분리하고 이로부터 cDNA를 합성한 다음 Rt-PCR을 이용하여 모근 세포의 성장인자의 발현 정도를 나타내는 그래프이다.

도 4는 인체 유래 모낭의 진피세포인 모유두 세포에서 total RNA를 분리하고 이로부터 cDNA를 합성한 다음 Real time-PCR을 이용하여 BclX/L의 발현 정도를 나타내는 그림이다.

도 5는 인체 유래 모낭의 진피세포인 모유두 세포에서 Real time-PCR을 이용하여 정량한 BclX/L의 발현 정도를 나타내는 그래프이다.

<110> KIM, Hoojung <120> A composition comprising Erythropoietin for promoting hair growth or inhibiting hair loss <130> 8p-11-49 <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGF-1 Forward primer <400> 1 tcaacaagcc cacagggtat 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGF-1 Reverse primer <400> 2 actcgtgcag agcaaaggat 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HGF Forward primer <400> 3 cgaggccatg gtgctatact 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HGF Reverse primer <400> 4 acaccagggt gattcagacc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KGF Forward primer <400> 5 gacatggatc ctgccaactt 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KGF Reverse primer <400> 6 aattccaact gccactgtcc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGF Forward primer <400> 7 tcttcaagcc atcctgtgtg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGF Reverse primer <400> 8 gcgagtctgt gtttttgcag 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BclX/L Forward primer <400> 9 ctgaatcgga gatggagacc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BclX/L Reverse primer <400> 10 tgggatgtca ggtcactgaa 20

Claims

에리스로포이에틴(Erythropoietin)을 유효성분으로 함유하는 발모 촉진용 조성물.
제 1항에 있어서, 에리스로포이에틴은 모낭 세포(hair follicle cell)의 성장을 촉진하는 것을 특징으로 하는 발모 촉진용 조성물.
제 1항에 있어서, 에리스로포이에틴은 인간 혈관내피 성장인자(human-Vascular endothelial growth factor C; hVEGF), 인간 각질세포 성장인자(human-keratinocyte growth factor; hKGF) 및 인간 인슐린 유사 성장인자(human-Insulin like Growth Factor; hlGF)의 발현을 촉진하는 것을 특징으로 하는 발모 촉진용 조성물.
약학적으로 유효한 양의 제 1항의 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 발모 촉진 방법.
에리스로포이에틴(Erythropoietin)을 유효성분으로 함유하는 발모 촉진용 외용제.
에리스로포이에틴(Erythropoietin)을 유효성분으로 함유하는 탈모 방지용 조성물.
제 6항에 있어서, 에리스로포이에틴은 인간 특대 기저세포 림프종(human-Basal cell lymphoma-extra large; hBCLXL)의 발현을 촉진하는 것을 특징으로 하는 탈모 방지용 조성물.
약학적으로 유효한 양의 제 6항의 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 탈모 방지 방법.
에리스로포이에틴(Erythropoietin)을 유효성분으로 함유하는 탈모 방지용 외용제.