JP2022513305A

JP2022513305A - アディポネクチン由来ペプチドを含む発毛促進用組成物

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Publication number: JP2022513305A
Application number: JP2021535476A
Authority: JP
Inventors: ジンホチョン; オサンクォン; ウンジュキム; ジンヨンキム; ドンフンリ
Original assignee: ジョンジンホエフェクトインク
Priority date: 2018-09-03
Filing date: 2018-09-03
Publication date: 2022-02-07
Anticipated expiration: 2038-09-03
Also published as: US11771636B2; CN112638358A; CN112638358B; WO2020050428A1; EP3848020A4; EP3848020A1; US20210196610A1; JP7418437B2

Abstract

本発明は、アディポネクチンから由来されるペプチド断片を含む組成物に関し、より詳細には、配列番号１から配列番号２１のアミノ酸配列からなる群より選択されるアディポネクチン由来ペプチド中の一つ以上を有効成分として含有する発毛促進用化粧料組成物及び薬学的組成物に関する。前記アディポネクチン由来ペプチドは、毛嚢の毛乳頭細胞及び外毛根鞘細胞の細胞分裂を活性化させ、毛嚢における毛髪の成長を促進し、さらに毛乳頭細胞で毛髪成長因子の発現を増加させるので、前記アディポネクチン由来ペプチドを含む本発明の組成物は、発毛の促進及び脱毛の抑制に効果的に用いられ得る。

Description

本発明は、アディポネクチン（ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ）から由来されるペプチド断片（ｐｅｐｔｉｄｅｆｒａｇｍｅｎｔまたはｓｍａｌｌｐｅｐｔｉｄｅ）を含む発毛促進用組成物に関する。

人体の毛髪は約１３０万個以上、頭髪は１０万～１５万個であり、それぞれの毛髪は互いに異なる周期を有し、成長期（ａｎａｇｅｎ、ｔｈｅａｃｔｉｖｅｇｒｏｗｔｈｐｈａｓｅ）、退行期（ｃａｔａｇｅｎ、ｔｈｅａｐｏｐｔｏｔｉｃｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｐｈａｓｅ）、休止期（ｔｅｌｏｇｅｎ、ｔｈｅｒｅｓｔｉｎｇｐｈａｓｅ）の３段階の周期を経て成長、維持及び脱落する。このような周期は３～６年にかけて繰り返されるところ、その結果、正常には一日平均５０～１００個の毛髪が脱落することになる。一般に「脱毛」とは、毛髪や毛がある原因によって正常より少ないかない状態を意味する。

現代の脱毛の原因には、男性ホルモンの作用などの内的要因、または日常生活での精神的なストレス、頭皮での過酸化脂質の蓄積などの外的要因があり、このような要因が複雑に関与して脱毛症状を現すものと知られている。最近は、男性型脱毛だけでなく、食生活の変化、社会環境などによるストレスの増加によって女性脱毛の人口も増加している傾向であり、前記のような頭皮及び毛髪の異常症状で悩む人口が漸次増加しており、その年齢も低くなっている。

前記幾多の要因中、男性ホルモンが脱毛に及ぼす影響を検討すれば、テストステロンが体内の５アルファ－レダクターゼ（５α－ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）酵素と結合してジヒドロキシテストステロン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ：以下「ＤＨＴ」と記す）を生成するようになり、このＤＨＴは、毛根のアンドロゲン受容体と結合して毛根の毛嚢の生成を阻害するのに支配的な影響を与えるようになる。よって、５α－レダクターゼ酵素の抑制剤を用いて脱毛防止効果物質を開発しようとする研究が現在活発に進められている。脱毛は、酵素作用の他にも、栄養不足、頭皮乾燥、ストレスなどによっても発生し得るので、このような原因による脱毛の場合、十分な栄養の供給、頭皮の管理、及び抗酸化物質の摂取または投与で脱毛を防止し、発毛を促進することができる（韓国公開特許第１０－２０１６－００７０５０８号公報）。

現在市販中の発毛剤には、米国のアップジョン社製のミノキシジル（ｍｉｎｏｘｉｄｉｌ）、イタリアのクリノス（Ｃｒｉｎｏｓ，Ｃｏ．）社製のトリコサッカライド（ｔｒｉｃｈｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）などを主成分とする製剤が用いられているが、明らかな効果の不在及び副作用の問題が頭をもたげている。さらに、メルク（Ｍｅｒｃｋ）社によって前立腺肥大症の治療剤として開発されてから脱毛症の治療に導入されたプロペシア（Ｐｒｏｐｅｃｉａ、成分名：フィナステリド（ｆｉｎａｓｔｅｒｉｄｅ））は、毛嚢で男性ホルモンテストステロン代謝に作用する酵素である５α－レダクターゼの活性を抑制させる物質として知られているが、継続的に服用しなければならず、性機能の減少やアレルギー、うつ病などの副作用を誘発するという問題点がある。

また、女性脱毛は、頭皮の発達が頭蓋骨より早く停止するため、老化の進行に伴って頭皮に血流障害が発生するのが原因中の一つと知られているなど、複合的な原因によって発生するものと知られている。よって、前記のようなホルモン抑制などの狭小な治療は、近視眼的な処方に過ぎないという問題点があった。

このような問題点を考慮し、天然物由来の抽出物を有効成分に含有することにより、毒性がないうえに、長期の使用にも副作用が発生しない脱毛防止または毛髪成長促進用組成物に関する研究が進められているが、天然物由来の抽出物を含有する関連製品の場合、期待水準の脱毛防止、発毛促進及び毛髪改善の効果を奏するに足りない場合が多かった（韓国公開特許第１０－２０１６－００２１０８６号公報）。

一方、アディポネクチンは、脂肪細胞から特異的に分泌されるタンパク質ホルモンであるアディポカインの一種であって、インスリンの機能を増進させてインスリン抵抗性を誘導することにより、高血糖、高インスリン症、肥満、動脈硬化のような心血管疾患などの調節に重要な役割を担う。さらに、アディポネクチンには癌細胞の転移と炎症反応を抑制する機能がある。アディポネクチンは、角質細胞の増殖だけでなく、皮膚でフィラグリン（ｆｉｌａｇｇｒｉｎ）、ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ）と細胞外マトリックスの発現を促進することにより、創傷の治癒、繊維化の抑制、肌しわの改善、保湿などの機能を行う（韓国公開特許第１０－２０１５－００３２４０１号公報）。併せて、アディポネクチンは、試験管内で毛髪成長促進の効果があることが公開されている。

アディポネクチンは、２４４個のアミノ酸で構成され、信号配列（ｓｉｇｎａｌｓｅｑｕｅｎｃｅ）、Ｎ－末端（Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ）に位置したコラーゲン様ドメイン、及びＣ－末端に位置したＣ１ｑ様球状ドメイン（ｇｌｏｂｕｌａｒｄｏｍａｉｎ）からなっている。六量体（ｈｅｘａｍｅｒ）と４００ｋＤａの高分子複合体（ＨＭＷｃｏｍｐｌｅｘ）が主なオリゴマー（ｏｌｉｇｏｍｅｒ）であって、前記高分子複合体は、低分子複合体（ＬＭＷｃｏｍｐｌｅｘ）より活性がさらに高いものと知られている。

従来に多様な生理的活性を有するものと知られているアディポネクチン由来のペプチドの開発は、その間国内外の多くの研究者と製薬会社の標的となってきたが、体内重合体の形成の困難さで最終成功の可能性が相対的に低かった。よって、皮膚に塗布でき、かつ優れた生理的活性を有するアディポネクチン由来の短いペプチドの開発が求められている。

本発明の課題は、アディポネクチン由来ペプチドを含有する発毛促進用組成物を提供することである。

前記課題を解決するために、本発明は、配列番号１から配列番号２１のアミノ酸配列からなる群より選択されるアディポネクチン由来ペプチド中の一つ以上を有効成分として含有する発毛促進用化粧料組成物または薬学的組成物を提供する。

本発明の一具現例によれば、本発明の組成物は、配列番号１６及び配列番号２１からなる群より選択されるアディポネクチン由来ペプチド中の一つ以上を有効成分として含有するのが好ましいが、これに限定されるものではない。

本発明の一具現例によれば、前記アディポネクチン由来ペプチドは、化粧料組成物または薬学的組成物に０．００１から２０ｍＭの濃度で含有されてよいが、これに限定されるものではない。

本発明の他の具現例によれば、前記化粧料組成物は、頭皮トリートメント剤、せっけん、ヘアトニック、シャンプー、リンス、ヘアパック、ヘアジェル、ローション、コンディショナー、ヘアオイル、ムース、クリーム、固形剤、溶液剤、乳剤、分散剤、ミセル、リポソーム、軟膏剤、化粧水、エッセンス、パッチまたは噴霧剤の剤形から選択されてよいが、これに限定されるものではない。

さらに、本発明は、薬学的または化粧品学的に有効な量の配列番号１から配列番号２１のアミノ酸配列からなる群より選択されるアディポネクチン由来ペプチド中の一つ以上を個体に処理または投与するステップを含む発毛促進方法を提供する。

本発明の一具現例によれば、前記個体は人間であってよいが、これに限定されるものではない。

本発明は、発毛促進の効果があるアディポネクチン由来ペプチドを含む組成物に関し、前記アディポネクチン由来ペプチドは、毛嚢の毛乳頭細胞及び外毛根鞘細胞の細胞分裂を活性化させ、毛嚢における毛髪の成長を促進し、さらに毛乳頭細胞で毛髪成長因子の発現を増加させるので、前記アディポネクチン由来ペプチドを含む組成物は、発毛の促進及び脱毛の抑制に効果的に用いられ得る。

本発明のアディポネクチン由来ペプチドの皮膚透過度テストの結果を示す写真である。本発明のアディポネクチン由来ペプチドがヒト毛嚢由来の毛乳頭細胞及び外毛根鞘細胞において細胞分裂及び活性化に及ぼす影響を示すグラフであって、Ｃｏｎは陰性対照群、Ｍｎｘは陽性対照群として用いられたミノキシジル、Ｐ１－２はアディポネクチンペプチド陽性対照群、Ｐ３からＰ１０は、本発明で製造されたアディポネクチン由来ペプチドを表す。本発明のアディポネクチン由来ペプチドがヒト毛嚢の成長に及ぼす影響を示すグラフ及び写真である。本発明のアディポネクチン由来ペプチドを処理した毛嚢の周辺に発現しているＫｉ－６７陽性細胞に対する蛍光染色写真である。本発明のアディポネクチン由来ペプチドがヒト毛嚢の毛乳頭細胞において毛髪成長因子の発現に及ぼす影響を示すグラフである。本発明のアディポネクチン由来ペプチドがヒト外毛根鞘細胞においてアディポネクチン受容体の下位信号伝達タンパク質のリン酸化に及ぼす影響を示す電気泳動写真である。本発明のアディポネクチン由来ペプチドが毛髪の生長期誘導に及ぼす影響を示す写真である。本発明のアディポネクチンペプチドがアディポネクチンタンパク質内に存在する構造的な位置に対する結晶構造を示す図である。

前記目的を達成するために、本発明は、配列番号１から配列番号２１のアミノ酸配列からなる群より選択されるアディポネクチン由来ペプチド中の一つ以上を有効成分として含有する発毛促進用化粧料組成物または薬学的組成物を提供する。

本発明のアディポネクチン由来ペプチドは、アディポネクチンから由来される４個のアミノ酸（４－ｍｅｒ）または５個のアミノ酸（５－ｍｅｒ）の長さを有するペプチド断片であって、下記表１に記載されているアミノ酸配列を有する。

本発明の一具現例によれば、前記アディポネクチン由来ペプチドは、化粧料組成物内に０．００１から２０ｍＭの濃度で含有されるのが好ましく、０．０１から１０ｍＭの濃度で含有されるのがさらに好ましいが、これに限定されない。前記ペプチドの濃度が０．００１ｍＭ未満であれば、発毛促進または脱毛抑制の効果を得難く、２０ｍＭを超過すれば、含有量の増加による明らかな効果の増加が現われないため、生産経済性が落ちるという問題点がある。
本発明のペプチドは、一般的な化学合成、例えば、固相ペプチド合成技術（ｓｏｌｉｄ－ｐｈａｓｅｐｅｐｔｉｄｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）によって製造されてよく、前記ペプチドをコーディングする核酸を含有する組換えベクターに形質転換された微生物を培養して前記ペプチドを発現させた後、通常の方法で精製して製造してもよいが、これに限定されない。

本発明に係る化粧料組成物は、前記ペプチドの他に、本発明が目的とする効果を損傷させない範囲内で、好ましくは、前記ペプチドの効果に相乗効果を与えることができる他の成分をさらに含有することができる。例えば、本発明の化粧料組成物は、発毛促進の効果が知られている任意の他の物質だけでなく、抗酸化剤、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料及び香料などの通常の補助剤、または担体を含むことができる。

本発明の化粧料組成物は、その剤形において特に限定されず、本技術分野で通常製造される如何なる剤形にも製造されてよく、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、せっけん、界面活性剤－含有クレンジング、オイル、粉末ファウンデーション、乳濁液ファウンデーション、ワックスファウンデーション及びスプレーなどに剤形化されてよい。他の一方、頭皮トリートメント剤、せっけん、ヘアトニック、シャンプー、リンス、ヘアパック、ヘアジェル、ローション、コンディショナー、ヘアオイル、ムース、クリーム、固形剤、溶液剤、乳剤、分散剤、ミセル、リポソーム、軟膏剤、化粧水、エッセンス、パッチまたは噴霧剤の剤形に製造されてもよい。

前記化粧料組成物の剤形がペースト、クリームまたはゲルの場合は、担体成分として動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、澱粉、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、シリカ、タルクまたは酸化亜鉛などが利用されてよく、パウダーまたはスプレーの場合は、担体成分としてラクトース、タルク、シリカ、アルミニウムヒドロキシド、カルシウムシリケートまたはポリアミドパウダーが利用されてよく、特にスプレーの場合は、追加的にクロロフルオロヒドロカーボン、プロパン／ブタンまたはジメチルエーテルなどの推進体を含むことができる。

本発明の剤形が溶液または乳濁液の場合は、担体成分として溶媒、溶解化剤または乳濁化剤が利用されてよく、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３－ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコールまたはソルビタンの脂肪酸エステルがある。

本発明の剤形が懸濁液の場合は、担体成分として水、エタノールまたはプロピレングリコールなどの液状の希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル及びポリオキシエチレンソルビタンエステルなどの懸濁剤、微小結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガーまたはトラガカントなどが利用されてよく、界面活性剤含有クレンジングの場合は、担体成分として脂肪族アルコールスルフェート、脂肪族アルコールエーテルスルフェート、スルホコハク酸モノエステル、イセチオネート、イミダゾリニウム誘導体、メチルタウレート、サルコシネート、脂肪酸アミドエーテルスルフェート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体またはエトキシル化グリセロール脂肪酸エステルなどが利用されてよい。

本発明の具体的な具現例によれば、本発明のアディポネクチン由来ペプチドは、皮膚に対する透過度に著しく優れ（図１参照）、毛乳頭細胞及び外毛根鞘細胞の細胞分裂を促進させ（図２参照）、毛嚢の成長を促進させることができる（図３参照）。

また、本発明の他の具体的な具現例によれば、本発明のアディポネクチン由来ペプチドは、ヒト毛嚢の毛乳頭細胞でＦＧＦ７、ＦＧＦ１０、ＨＧＦ、ＩＧＦなどのような毛髪成長因子の発現を増加させ（図４参照）、ヒト外毛根鞘細胞でアディポネクチン受容体の下位信号伝達タンパク質のリン酸化を増加させ（図５参照）、さらに毛髪の生長期を著しく誘導することができる（図６参照）。

したがって、本発明のアディポネクチン由来ペプチドは、毛嚢の毛乳頭細胞及び外毛根鞘細胞の細胞分裂を活性化させ、毛嚢での毛髪の成長を促進し、さらに毛乳頭細胞で毛髪成長因子の発現を増加させるので、前記アディポネクチン由来ペプチドを含む組成物は、発毛促進及び脱毛抑制のための化粧料組成物の有効成分として有用に用いられてよい。

一方、本発明に係る発毛促進用薬学的組成物の投与経路は、皮膚、口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸管、局所、舌下または直腸が含まれ、経口または非経口投与が好ましいが、これに限定されない。前記「非経口」は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、病巣内注射または注入の技術を含む。

本発明の薬学的組成物は、本発明に係るアディポネクチン由来ペプチドに追加して同一または類似の機能を示す有効成分を１種以上含有することができる。前記組成物は、それぞれ通常の方法により、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップなどの経口型剤形、外用剤、坐剤及び滅菌注射溶液の形態に剤形化して用いられてよい。

経口投与のための固形製剤には、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、軟質カプセル剤、丸薬などが含まれる。経口のための液状製剤には、懸濁剤、経口液剤、乳剤、シロップ剤などが該当され、一般に用いられる単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に多様な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれてよい。非経口投与のための製剤には、それぞれ通常の方法により、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、滅菌された水溶液、液剤、非水性溶剤、懸濁剤、エマルジョン、シロップ、坐剤、エアロゾルなどの外用剤、及び滅菌注射製剤の形態に剤形化して用いられてよく、好ましくは、クリーム、ゲル、パッチ、噴霧剤、軟膏剤、硬膏剤、ローション剤、リニメント剤、パスタ剤またはパップ剤の皮膚外用薬学的組成物を製造して用いてよいが、これらに限定するものではない。非水性溶剤、懸濁剤には、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物性油、エチルオレートなどの注射可能なエステルなどが用いられてよい。坐剤の基剤には、ウイテプゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイーン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオバター、ラウリン脂肪、グリセロゼラチンなどが用いられてよい。

前記組成物は、防腐剤、安定化剤、水和剤または乳化促進剤、浸透圧調節のための塩及び／または緩衝剤などの補助剤、及びその他治療的に有用な物質をさらに含有してよく、通常の方法である混合、顆粒化またはコーティングの方法によって剤形化することができる。

本発明の薬学的組成物は、個体の年齢、体重、一般的な健康、性別、投与時間、投与経路、排出率、薬物配合及び特定疾患の重症度を含んだ幾多の要因によって多様に変わり得る。

本発明の前記アディポネクチン由来ペプチドを有効成分として含有する薬学的組成物を単位容量の形態に剤形化する場合、有効成分として前記アディポネクチン由来ペプチドが約０．０１から１，５００ｍｇの単位容量で含有されるのが好ましく、成人の治療に必要な投与量は、投与の頻度と強度に従って一日に約１から５００ｍｇの範囲が普通であるが、これに限定されない。成人に筋肉内または静脈内投与する際、一回の投与量には一日に普通約５から３００ｍｇの全体投与量であれば十分なはずであるが、一部患者の場合はさらに高い一日投与量が好ましいことがある。本発明の組成物は、単独で、または手術、放射線治療、ホルモン治療、化学治療及び生物学的反応調節剤を用いる方法と併用して用いることができる。

前記薬学的または化粧品学的に有効な量とは、０．０００１から１００ｍｇ／ｋｇであり、好ましくは０．００１から１０ｍｇ／ｋｇであり、これに制限されるものではない。処理または投与の量は、特定患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与期間、投与方法、消失率、疾患の重症度などにより調節されてよい。処理または投与は一日に一回投与してもよく、数回に分けて実施してもよい。

前記個体は脊椎動物であり、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくは人間または鼠、兎、モルモット、ハムスター、犬、猫などの実験動物であり、最も好ましくは人間であってよいが、これらに限定されるものではない。

前記処理または投与の方法は、塗布、経口または非経口投与してよく、非経口投与の際は腹腔内注射、直腸内注射、皮下注射、静脈注射、筋肉内注射、子宮内硬膜注射、脳血管内注射または胸部内注射によって投与されてよい。

以下、本発明を実施例によってさらに詳しく説明する。

しかし、下記実施例は、本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の内容が下記実施例によって限定されるものではない。

実施例１．アディポネクチン由来ペプチドの製造

本発明のペプチドを合成するためにメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）のＳＰＰＳ（ＳｏｌｉｄＰｈａｓｅＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ）法（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、８５（１４）、２１４９－２１５４）を利用した。先ず、本発明のペプチド合成のために２－クロロトリチルクロリド（ＣＴＣ）樹脂を利用して合成を開始し、初ステップのＦｍｏｃ（９－ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）アミノ酸は、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（Ｎ，Ｎ－ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ、ＤＩＥＡ）を用いてジクロロメタン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ、ＤＣＭ）溶媒下でカップリングした。その次のステップのＦｍｏｃアミノ酸からは、ＨＡＴＵ（Ｎ－［（ジメチルアミノ－）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジン－１－イル－メチレン］－Ｎ－メチルメタンアミニウムヘキサフルオロホスフェートＮ－オキシド）と１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、あるいはＨＢＴＵ（Ｎ－［（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）（ジメチルアミノ）メチレン］－Ｎ－メチルメタンアミニウムヘキサフルオロホスフェートＮ－オキシド）とヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）にＤＩＥＡ（Ｎ，Ｎ－ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）を共に用いてカップリングをして行く方法でペプチドの鎖を延長させた。このとき、Ｃ－末端からＮ－末端の方向に合成して行き、アミノ末端にＦｍｏｃ－アミノ酸をカップリングさせた後、２０％のピペリジン溶液でＦｍｏｃ基を除去（Ｓｏｌｉｄ－ＰｈａｓｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＧｕｉｄｅ（１ｅｄ．）．ＣＲＣＰｒｅｓｓ．８４８）し、ＤＭＦ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒａｍｉｄｅ）で複数回洗浄してからカップリングして行く方法で進めた。最後に、Ｆｍｏｃ－アミノ酸をカップリングさせた後、２０％のピペリジン溶液でＦｍｏｃ基を除去し、カルボン酸とＮ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）を共に用いてアシル基をカップリングした後、ＤＭＦで複数回洗浄して乾燥させた。ここにＴＦＡ（Ｔｒｉｆｕｌｏｒｏａｃｅｔｉｃａｃｉｄ）－Ｈ_２Ｏ－トリイソプロピルシラン（９５：２．５：２．５、ｖｏｌ．／ｖｏｌ．）溶液を加え、２から３時間反応させて保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇｇｒｏｕｐ）を除去し、かつ樹脂からペプチドを分離させた後、ジエチルエーテル（ｄｉｅｔｈｙｌｅｔｈｅｒ）にペプチドを浸漬させることで、前記表１に記載されたアミノ酸配列を有するそれぞれのペプチドを合成した。

前記方法で得た粗（ｃｒｕｄｅ）ペプチドは、０．１％のＴＦＡが含まれているアセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）と水の勾配溶媒の組成でＲＰ－ＨＰＬＣ（２９９６Ｄｅｔｅｃｔｏｒ、５１５Ｐｕｍｐ、Ｗａｔｅｒｓ）を利用して純度を確認し、純度を確認した結果、９５％以下のペプチドはＰｒｅｐ－ＬＣで分離精製して９７％以上のペプチドを得た。前記ペプチドの正確な成分を確認するために元素分析機（ＥＡ１１１２、ＣＥＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Ｉｔａｌｙ）で元素分析を行った結果、ペプチドの元素別含有量がアミノ酸配列から計算して得た元素別含有量と一致するので、正確なアミノ酸配列を有することを確認した。

実施例２．アディポネクチン由来ペプチドの皮膚透過度の測定

アディポネクチンは、球形ドメイン（ｇｌｏｂｕｌａｒｄｏｍａｉｎ）を含むさらに小さな単位に分解されることもあり、全長を有するアディポネクチンより球形ドメインを有する小単位の活性が一層高く、このようなアディポネクチンに対する受容体は、アディポネクチン受容体１（ＡｄｉｐｏＲ１）とアディポネクチン受容体２（ＡｄｉｐｏＲ２）と知られている（Ｃｒｙｓｔａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｏｆｔｈｅｈｕｍａｎａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１５Ａｐｒ１６；５２０（７５４７）：３１２－６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１４３０１）。よって、実施例１で製造された本発明のアディポネクチン由来ペプチドの皮膚透過度を、人肌と最も類似するため一般的に透過度テストに用いられる豚肌を利用して検証した。豚肌の大きさを横、縦２ｃｍに切った後、ＦＩＴＣ蛍光付着された当該ペプチドストック（陽性対照群８－ｍｅｒ長さの２番ペプチド、４－ｍｅｒ４番ペプチド）とＤＭＳＯを濃度別に準備し、豚肌の上に十分な量で塗布した。光を遮断して３７℃のインキュベーターで２時間置いた。ＬＮ２を利用して急速冷凍した後に凍結切断（Ｃｒｙｏｓｅｃｔｉｏｎ）を施行した。ＤＡＰＩ（核染色）で５分間処理した後洗浄し、共焦点顕微鏡で観察した。

その結果、本発明のアディポネクチン由来ペプチドは、対照群として用いられた８個アミノ酸の長さのペプチドに比べて皮膚に対する透過度に著しく優れることを確認した（図１）。

実施例３．アディポネクチン由来ペプチドがヒト毛嚢由来の毛乳頭細胞及び外毛根鞘細胞において細胞分裂及び活性化に及ぼす影響

一次培養したヒト毛嚢由来の毛乳頭細胞及び外毛根鞘細胞をパッセージ２～３まで継代培養した後、従来に脱毛防止及び毛髪成長の治療剤として用いられているミノキシジルを陽性対照群として１ｍＭ濃度で処理し、これとは別に、前記実施例１で製造した本発明のアディポネクチン由来ペプチドを０．５及び５μｇ／ｍｌの濃度で処理した。４８時間後に活性化された生きている細胞をＭＴＴ溶液で染色し、陰性対照群と比べて細胞の分裂及び活性化度を確認した。

その結果、本発明のアディポネクチン由来ペプチドは、毛乳頭細胞及び外毛根鞘細胞の細胞分裂を促進し、特に、アディポネクチン由来ペプチドのうちＰ５とＰ１０ペプチドと二つのペプチドを組み合わせたものは、陽性対照群として用いられたミノキシジルよりも優れた効果を有していることを確認した（図２）。

実施例４．アディポネクチン由来ペプチドがヒト毛嚢の成長に及ぼす影響

ボランティアから得たヒト毛嚢を利用して試験管内で毛嚢器官培養試験を行った。従来に脱毛防止及び毛髪成長の治療剤として用いられているミノキシジルを陽性対照群として１ｍＭ濃度で処理し、これとは別に、前記実施例１で製造したアディポネクチン由来ペプチドを５μｇ／ｍｌの濃度で処理し、ヒト毛嚢の成長に及ぼす影響を確認した。ヒト毛嚢培養実験以後３日目、６日目に育つ毛髪の長さを測定し、これを陰性対照群と比べてヒト毛嚢の毛髪成長促進の効果を確認した。

その結果、本発明のアディポネクチン由来ペプチドは毛嚢の成長を促進し、特に、アディポネクチン由来ペプチドのうちＰ５及びＰ１０を組み合わせたアディポネクチンペプチドは、陽性対照群として用いられたミノキシジルよりも有意に毛髪の成長を促進した（図３）。さらに、前記毛嚢を急速冷凍処理した後に組織切片にセクションし、細胞分裂及び活性化のマーカーであるＫｉ－６７抗体を利用して組織内の細胞を標識し、Ｋｉ－６７抗体を検出することができる蛍光二次抗体を利用して蛍光に標識した後、暗室で蛍光顕微鏡を利用して毛嚢の周辺に発現しているＫｉ－６７陽性細胞の個数を確認した結果、陰性対照群に比べてＰ５及びＰ１０を組み合わせたアディポネクチンペプチド群で有意に増加することを確認した（図４）。

実施例５．アディポネクチン由来ペプチドがヒト毛嚢の毛乳頭細胞において毛髪成長因子の発現に及ぼす影響

一次培養したヒト毛嚢由来の毛乳頭細胞をパッセージ２～３まで継代培養した後、従来に脱毛防止及び毛髪成長の治療剤として用いられているミノキシジルを陽性対照群として１ｍＭ濃度で処理し、これとは別に、前記実施例１で製造したアディポネクチン由来ペプチドを０．５及び５μｇ／ｍｌの濃度で処理した。３時間後、毛乳頭細胞からｍＲＮＡを抽出してこれを再びｃＤＮＡに合成し、実時間定量的ＰＣＲ法を利用して陰性対照群と比べ、毛髪成長因子として知られているＦＧＦ７、ＦＧＦ１０、ＨＧＦ及びＩＧＦの発現に及ぼす影響を確認した。

その結果、本発明のアディポネクチン由来ペプチドは、ＦＧＦ７、ＦＧＦ１０、ＨＧＦ及びＩＧＦの発現を増加させ、特に、最も重要な毛髪成長因子として知られているＦＧＦ７及びＦＧＦ１０の発現を、陽性対照群として用いられたミノキシジルよりも著しく増加させたことを確認した（図５）。

実施例６．アディポネクチン由来ペプチドがヒト外毛根鞘細胞においてアディポネクチン受容体の下位信号伝達タンパク質のリン酸化に及ぼす影響

アディポネクチンペプチドが実際にアディポネクチン受容体を通じて作用するのか調べるために、一次培養したヒト毛嚢由来の外毛根鞘細胞にアディポネクチン受容体阻害剤を処理した群と処理していない群に分離し、それぞれに前記実施例１で製造したアディポネクチン由来ペプチドを、Ｐ５とＰ１０を組み合わせて０、０．０５、０．１、０．５、１、５、１０μｇ／ｍｌの濃度で処理し、陽性対照群にはＡｄｉｐｏＲ１、ＡｄｉｐｏＲ２などのアディポネクチン受容体の選択的作用剤であるアディポロン（ａｄｉｐｏｒｏｎ）（ＡｄｉｐｏＲａｇｏｎｉｓ）を処理した。１０分後、前記細胞からタンパク質のみを抽出し、これを精製した後にタンパク質の量を全て一定に定量した。その後、ウェスタンブロット法を利用してそれぞれのタンパク質を大きさ別に分離し、標的タンパク質に特異的な抗体を利用して検出した後、これをペルオキシダーゼ（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）法を利用して発色した。これを介し、ＡｄｉｐｏＲ１、ＡｄｉｐｏＲ２などのアディポネクチン受容体の下位信号伝達タンパク質であるアセチル－ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）及びＡＭＰ－活性化タンパク質キナーゼ（ＡＭＰＫ）のリン酸化に及ぼす影響を確認した。

その結果、本発明のアディポネクチン由来ペプチドは、アディポネクチン受容体の下位信号伝達タンパク質であるＡＣＣ及びＡＭＰＫのリン酸化を、陽性対照群として用いられたアディポロンと同じ水準に著しく増加させたことを確認した（図６）。

実施例７．アディポネクチン由来ペプチドが毛髪の生長期の誘導に及ぼす影響

マウスは、生後７から８週齢に全ての毛が休止期に進入してから、その後、毛は再度生長期に転換される過程を経るものと知られている。よって、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを利用して、本発明のアディポネクチン由来ペプチドが前記生長期誘導の過程に及ぼす影響を確認した。マウスの下側背中の皮膚に、従来に脱毛防止及び毛髪成長の治療剤として用いられていたミノキシジル３％と、前記実施例１で製造したアディポネクチン由来ペプチドＰ５とＰ１０を組み合わせたものとを０．１ｍＭの濃度で毎日１回ずつ塗布した後、毛髪の生長を確認した。

その結果、約３週後、最初に毛を除去した部位のうち生長期毛髪が育った部位の割合が、本発明のアディポネクチン由来ペプチドを処理した群で有意に増加し、その後、当該部位の組織検査を施行して生長期毛嚢の形成可否を評価したとき、アディポネクチン由来ペプチドを塗布した群でも、陽性対照群として用いられたミノキシジルを処理した群と類似な程度に毛嚢の形成が促進されたことを確認した（図７）。

実施例８．アディポネクチンタンパク質内のアディポネクチンペプチドの構造及び生体内重合体の形成による作用可能性の確認

人間に存在するアディポネクチンタンパク質の３次元的構造を分析し、本発明で製造したアディポネクチンペプチドの構造的な位置と生体内アディポネクチン受容体の作用可能性を分析した。

その結果、アディポネクチンペプチドの場合、アディポネクチンタンパク質の作用部位として知られている球形ドメインに計３回繰り返してトリマー（ｔｒｉｍｅｒ）の形態で存在していることが分かり、特に、作用部位の球形ドメインの球形構造の最外側に分布しているため、実際にアディポネクチン受容体に作用し得る可能性が高かった。特に、Ｐ５ペプチドの場合は、アディポネクチンタンパク質で３回繰り返すペプチド配列が、３次元タンパク質構造を検討してみたとき、重合体を形成していることを確認することができ、重合体の内部に親油性アミノ酸、重合体の外部に親水性アミノ酸の構成を有するので、実際に親水性物質が多い人体内に透過された場合に再度重合体を形成する様相となり、アディポネクチン受容体に作用する可能性を確認することができた（図８）。

実施例９．アディポネクチンペプチド配列の他のタンパク質との重複有無の検索

本発明で製造したアディポネクチンペプチドの場合、５－ｍｅｒで構成された短いアミノ酸配列であるため、実際的に人体内に存在する他のタンパク質に含まれているアミノ酸配列と重複される可能性がある。このような場合にアディポネクチンにだけ特異的に存在する配列と見がたく、よって、アディポネクチン受容体に特異的に作用する可能性が低下するという問題がある。そのため、米ＮＣＢＩで提供するＵｎｉＰｒｏｔデータベースを利用して、人体内に存在する全てのタンパク質配列の中でアディポネクチンペプチド配列と重複される配列を検索した。

その結果、特に、本発明のＰ５ペプチドの場合、アディポネクチンタンパク質が属しているＣ１ｑ補体タンパク質スーパーファミリーにだけ存在することが確認され、アディポネクチンタンパク質に非常に特異的なペプチド配列と確認された。

製造例１．化粧料の製造

＜１－１＞柔軟化粧水の製造

本発明のアディポネクチン由来ペプチドを有効成分として含有する柔軟化粧水は、下記表２のように製造した。

＜１－２＞栄養クリームの製造
本発明のアディポネクチン由来ペプチドを有効成分として含有する栄養クリームは、下記表３の組成のように製造した。

＜１－３＞ローションの製造
本発明のアディポネクチン由来ペプチドを有効成分として含有するローションは、下記表４の組成のように製造した。

＜１－４＞ヘアトニックの製造
下記表５のような組成のヘアトニックを、一般的なヘアトニックの製造方法と同一の方法を用いて製造した。

＜１－５＞ヘアシャンプーの製造
下記表６のような組成のヘアシャンプーを、一般的なヘアシャンプーの製造方法と同一の方法を用いて製造した。

＜１－６＞ヘアコンディショナーの製造
下記表７のような組成のヘアコンディショナーを、一般的なヘアコンディショナーの製造方法と同一の方法を用いて製造した。

製造例２．薬学的製剤の製造

＜２－１＞散剤の製造
本発明のアディポネクチン由来ペプチド・・・・・・・・・２ｇ

乳糖・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・１ｇ

前記成分を混合して気密袋に充填して散剤を製造した。

＜２－２＞錠剤の製造

本発明のアディポネクチン由来ペプチド・・・・・・・・・１００ｍｇ

とうもろこし澱粉・・・・・・・・・・・・・・・・・・１００ｍｇ

乳糖・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・１００ｍｇ

ステアリン酸マグネシウム・・・・・・・・・・・・・・・・２ｍｇ

前記成分を混合した後、通常の錠剤の製造方法に従って打錠して錠剤を製造した。

＜２－３＞カプセル剤の製造

乳糖・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・１００ｍｇ

前記成分を混合した後、通常のカプセル剤の製造方法に従ってゼラチンカプセルに充填してカプセル剤を製造した。

＜２－４＞丸薬の製造

本発明のアディポネクチン由来ペプチド・・・・・・・・・・１ｇ

乳糖・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・１．５ｇ

グリセリン・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・１ｇ

キシリトール・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・０．５ｇ

前記成分を混合した後、通常の方法によって１丸薬当り４ｇとなるように製造した。

＜２－５＞顆粒の製造

本発明のアディポネクチン由来ペプチド・・・・・・・・１５０ｍｇ

大豆抽出物・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・５０ｍｇ

葡萄糖・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・２００ｍｇ

澱粉・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・６００ｍｇ

前記成分を混合した後、３０％のエタノール１００ｍｇを添加し、攝氏６０℃で乾燥して顆粒を形成した後、袋に充填した。

＜２－６＞注射液剤の製造

本発明のアディポネクチン由来ペプチド・・・・・・・１０μｇ／ｍｌ

薄い塩酸ＢＰ・・・・・・・・・・・・・・・・・・ｐＨ３．５になるまで

注射用塩化ナトリウムＢＰ・・・・・・・・・・・・・最大１ｍｌ

適当な容積の注射用塩化ナトリウムＢＰの中に本発明のＴＲＰＶ１抑制ペプチドを溶解させ、生成された溶液のｐＨを薄い塩酸ＢＰを使ってｐＨ３．５に調節した後、注射用塩化ナトリウムＢＰを使って容積を調節し十分混合した。溶液を透明硝子でなる５ｍｌタイプのＩアンプルの中に充填させ、硝子を溶解させることで空気の上部格子の下に封入させ、１２０℃で１５分以上オートクレーブさせて殺菌することで注射液剤を製造した。

Claims

配列番号１から配列番号２１のアミノ酸配列からなる群より選択されるアディポネクチン由来ペプチド中の一つ以上を有効成分として含有する、発毛促進用化粧料組成物。
配列番号１６及び配列番号２１からなる群より選択されるアディポネクチン由来ペプチド中の一つ以上を有効成分として含有する、請求項１に記載の化粧料組成物。
前記アディポネクチン由来ペプチドを０．００１から２０ｍＭの濃度で含有する、請求項１に記載の化粧料組成物。
前記化粧料組成物は、頭皮トリートメント剤、せっけん、ヘアトニック、シャンプー、リンス、ヘアパック、ヘアジェル、ローション、コンディショナー、ヘアオイル、ムース、クリーム、固形剤、溶液剤、乳剤、分散剤、ミセル、リポソーム、軟膏剤、化粧水、エッセンス、パッチ及び噴霧剤の剤形からなる群より選択されるいずれか一つの剤形を有する、請求項１に記載の化粧料組成物。
配列番号１から配列番号２１のアミノ酸配列からなる群より選択されるアディポネクチン由来ペプチド中の一つ以上を有効成分として含有する、発毛促進用薬学的組成物。
配列番号１６及び配列番号２１からなる群より選択されるアディポネクチン由来ペプチド中の一つ以上を有効成分として含有する、請求項５に記載の薬学的組成物。
前記アディポネクチン由来ペプチドを０．００１から２０ｍＭの濃度で含有する、請求項５に記載の薬学的組成物。
化粧品学的に有効な量の配列番号１から配列番号２１のアミノ酸配列からなる群より選択されるアディポネクチン由来ペプチド中の一つ以上を個体に処理または投与するステップを含む、発毛促進方法。
前記個体は人間である、請求項８に記載の発毛促進方法。