CN1320117C

CN1320117C - 脂联素－胰升糖素样肽－1类似肽融合蛋白表达载体及构建

Info

Publication number: CN1320117C
Application number: CNB2005100508448A
Authority: CN
Inventors: 赵同峰; 谷卫; 詹宇红; 赵江佩
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2005-07-22
Filing date: 2005-07-22
Publication date: 2007-06-06
Anticipated expiration: 2025-07-22
Also published as: CN1737150A

Abstract

本发明公开了人脂联素-胰升糖素样肽-1类似肽融合蛋白表达载体及构建方法。本发明运用PCR技术获得人脂联素和GLP-1-A编码基因，脂联素基因通过扩增脂联素球状域基因获得，通过将人GLP-1(7-37)编码基因中编码第8位氨基酸丙氨酸的密码子突变为甘氨酸密码子获得GLP-1-A编码基因，运用酶切技术，将GLP-1-A和脂联素编码基因定向克隆到表达载体，获得人脂联素-胰升糖素样肽-1类似肽融合蛋白表达载体，经转化蛋白表达细菌表达出了含肠激酶识别序列的人Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白，本发明为进一步研究其活性，测定融合蛋白上GLP-1-A半衰期，得到能促进胰岛β细胞分泌胰岛素、能改善胰岛素抵抗、副作用小的新蛋白提供良好的前期研究。

Description

脂联素-胰升糖素样肽-1类似肽融合蛋白表达载体及构建

技术领域

本发明涉及生物领域，尤其涉及脂联素-胰升糖素样肽-1类似肽融合蛋白表达载体及构建方法。

背景技术

2型糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)是严重危害人类健康的疾病，患病人数正随着生活水平的提高、人口老龄化，以及诊断技术的进步而迅速增加。近年的研究表明胰岛素抵抗和胰岛素分泌不足是2型糖尿病特征性的病理生理改变，二者相互作用，最终导致2型糖尿病的发生。不仅如此，胰岛素抵抗还参与了糖尿病慢性并发症如心血管并发症、糖尿病肾病等的发生、发展，是联系糖尿病、高血压、高脂血症、冠心病的一个重要枢纽。因此针对2型糖尿病的发病机制，采用有效的药物减轻胰岛素抵抗、增加胰岛素分泌对于2型糖尿病及其并发症的治疗具有重要的意义。在目前尚无有效的药物能同时针对2型糖尿病发病机制的两个方面既胰岛素抵抗和胰岛素分泌不足进行治疗。尽管已经有胰岛素增敏剂如噻唑烷二酮类药物和许多种类的口服降糖药物在临床上应用，但这些药物主要是针对2型糖尿病发病机制的某一方面(单纯针对胰岛素抵抗或胰岛素分泌不足或作用于糖吸收或代谢的某一环节)进行治疗，而且它们分别改善胰岛素抵抗、促进胰岛素分泌、降低血糖的能力并不尽如人意，长期应用作用会逐渐降低，同时这些药物所具有的副作用，也极大地限制了它们在临床上的应用。即使是胰岛素，也因为胰岛素抵抗的存在降糖作用大大降低，大剂量应用胰岛素还可能加重糖尿病慢性并发症的发展。鉴于此，国际上正在积极地寻找新的改善胰岛素抵抗、促进胰岛素分泌的药物，以期能更有效、安全地治疗2型糖尿病。

脂联素(Adiponectin)是近年发现的脂肪细胞分泌的特异性蛋白，其分泌异常在胰岛素抵抗和2型糖尿病的发生、发展中起着重要作用，血清脂联素浓度可以预测个体将来发生的胰岛素抵抗的风险。2型糖尿病患者血浆脂联素水平明显下降，前瞻性纵向研究表明，基础血浆脂联素浓度是2型糖尿病发病的独立危险因子，高浓度的血浆脂联素提示有较小的2型糖尿病发病风险，在以后要发展为2型糖尿病的个体，其血浆脂联素浓度显著低于对照组，2型糖尿病发病后仍持续下降，并与胰岛素的敏感性下降相平行。脂联素基因可能是2型糖尿病的易感基因，脂联素基因缺乏的纯合子小鼠(Adipo-/-小鼠)表现出中度的胰岛素抵抗和糖耐量异常。这些研究表明脂联素产生的异常参与了胰岛素抵抗和2型糖尿病的发生、发展，而用重组脂联素对糖尿病和胰岛素抵抗动物治疗后可显著改善胰岛素抵抗，降低血糖。脂联素不刺激胰岛素分泌，但增强胰岛素对肝细胞葡萄糖生成的抑制，使亚生理浓度的胰岛素同样能抑制肝糖输出。脂联素还可降低高脂高蔗糖喂养的小鼠循环游离脂肪酸和甘油三酯水平，减轻小鼠体重，增加骨骼肌细胞对游离脂肪酸的摄取、氧化和能量消耗，使骨骼肌甘油三酯含量降低，从而增强骨骼肌细胞胰岛素信号传导，增加胰岛素敏感性。脂联素除了可改善胰岛素抵抗，参与调节糖、脂代谢外，还拮抗动脉粥样硬化的形成。低水平的血浆脂联素是糖尿病患者发生心血管疾病的独立危险因子。此外，伴糖尿病性视网膜病变的2型糖尿病患者的血浆脂联素浓度显著低于不伴视网膜病变的2型糖尿病患者，提示脂联素产生的减少也可能参与了糖尿病微血管病变的发生、发展。

总之，脂联素具有降糖、降脂，增加胰岛素敏感性的作用，同时可拮抗动脉粥样硬化的形成，不会使体重增加，在人体内未发现脂联素抵抗的存在，而且脂联素是机体自身产生的蛋白，对人体几乎没有副作用，因此脂联素有可能成为治疗糖尿病的一类新药，国际上正在积极地对其进行研究和开发。人脂联素共244个氨基酸，从N-端到C-端依次为信号序列(1-18aa)，非螺旋区(19-41aa)，22个胶原重复序列(42-107aa)，C-端球状域(即脂联素球状域，108-244aa)，脂联素球状域为其功能域。有研究者用胰蛋白酶裂解全长的脂联素得到含脂联素球状域的片断，其活性远大于全长的脂联素。研究表明，细菌表达的脂联素球状域具有很好的生物活性，这为进一步研究和开发脂联素提供了有利的条件。

胰升糖素样肽-1(Glucagons-like Peptide-1，GLP-1)是胰岛α细胞和肠粘膜L细胞分泌的一种激素，胰岛α细胞和肠粘膜L细胞先产生胰升糖素原，进一步经过水解成为具有生物活性的GLP-1(7-37)，其中一部分分子C-端的一个氨基酸被分解，余端被酰胺化为具有生物活性的GLP-1(7-36)酰胺。在体内80％的GLP-1以GLP-1(7-36)酰胺的形式存在，少量以GLP-1(7-37)的形式存在，但两者的生理活性相同。GLP-1的活性域位于N-端，可与胰岛β细胞上的GLP-1受体结合，增加胰岛细胞内腺甘酸环化酶的活性，促进胰岛素的释放，其作用是依赖葡萄糖的，在血糖升高时，静脉输注GLP-1能明显增加胰岛素分泌，随着血糖水平的下降，葡萄糖刺激的消失，GLP-1促进胰岛素分泌的作用变小，继续输注GLP-1血糖不会继续下降。在2型糖尿病患者，饮食诱导的GLP-1分泌受损，引起胰岛β细胞分泌胰岛素的恶化，从而导致2型糖尿病的发生。GLP-1还具有增加肝糖原及肌糖原的合成，促进脂肪酸合成，抑制胰升糖素的分泌，抑制胃肠动力，延缓食物的吸收，抑制胰岛细胞凋亡，促进胰岛细胞增生，抑制食欲，减轻体重，延缓糖尿病的发生等作用。

由于GLP-1具有多种药理作用，正在试用于2型糖尿病的治疗。研究表明输入外源性GLP-1能明显改善2型糖尿病患者空腹及餐后血糖，从而减少胰岛素的用量，甚至停用胰岛素，而且不会发生低血糖，长期输注GLP-1可显著增加2型糖尿病患者胰岛素的1相分泌。GLP-1还可降低甘油三酯水平，增大低密度脂蛋白颗粒体积，改善2型糖尿病伴冠心病患者的内皮功能紊乱，延缓2型糖尿病心血管并发症的发生、发展。尽管GLP-1在治疗2型糖尿病方面具有很多优点，但尚存在难以克服的缺点，GLP-1的体内半衰期很短，静脉输注的半衰期约为5分钟，从而使得GLP-1难以在临床上应用，因此，积极寻找有效的方法延长GLP-1的半衰期具有非常重要的意义。在体内GLP-1主要以两种形式进行清除：酶清除与器官清除。GLP-1在二肽肽酶IV的作用下失去N-端的两个氨基酸残基成为无活性的GLP-1(9～36)酰胺。由于二肽肽酶IV具有高度的底物特异性，改变GLP-1的N-端氨基酸组成可增加GLP-1对二肽肽酶IV的抵抗力。Deacon等以甘氨酸代替GLP-1(7～37)第8位氨基酸丙氨酸后获得的GLP-1类似肽(Glucagons-like Peptide-1 Analogues，GLP-1-A)，对二肽肽酶IV的抵抗力显著增加，其体外半衰期延长到159分钟，而且和GLP-1(7～37)具有相近的生物活性。但仅有二肽肽酶IV的参与不能解释GLP-1在体内的所有清除机制，GLP-1在体外血浆中的半衰期为20分钟，远远超过许多研究所得出3～11分的体内半衰期。Deacon等以甘氨酸代替GLP-1(7～37)第8位氨基酸丙氨酸后获得的GLP-1-A的体外半衰期显著延长，但体内半衰期并没有得到相应的改善，提示尚有别的机制参与了GLP-1的体内清除。肾脏在这一过程中起着重要的作用，GLP-1是小分子肽，易从肾脏滤过，在肾小管上皮细胞刷状缘有DPP-IV，GLP-1被肾脏滤过后，可被肾小管上皮细胞摄取而分解。大鼠肾脏切除后GLP-1的清除率下降，离体研究表明，肾脏一次可将灌注液中超过80％的GLP-1滤过而清除。因此，寻找有效的方法延缓GLP-1从肾脏的清除对于延长GLP-1的体内半衰期具有重要的意义。

在自然界中，许多多结构域(或多功能域)的蛋白质是由数个多肽链片段拼接在一起形成的，由相对较小的结构域拼装成较大的多功能蛋白是自然进化的一个重要因素。基因重组技术的发展使得人类能把不同基因或基因片段相融合，通过蛋白表达得到不同功能的蛋白拼接在一起形成的新型多结构域的人工融合蛋白，目前这种方法已被应用于许多领域的研究中，并显示出较高的价值。在蛋白融合的过程中，为了最大限度地保持融合蛋白上各个蛋白的空间构象及生物活性，常把不同的蛋白通过空间活动性较大的接头相连，结构简单、不易形成折叠的富含甘氨酸的短肽常用来作为接头。由于脂联素的功能域位于C-端，GLP-1的功能域位于N-端，从而可应用基因重组技术将脂联素的N-端和GLP-1的C-端通过一个空间活动性较大的接头相连，产生一种新的蛋白，该蛋白同时具有脂联素的C-端和GLP-1的N-端，故可具有脂联素和GLP-1的两种功能，新的蛋白由于分子体积增大，不易从肾脏滤过而清除，可克服单一的GLP-1多肽易从肾脏清除、半衰期短的缺点，同时如将GLP-1的第8位氨基酸丙氨酸以甘氨酸代替，则新蛋白的N-端还具有抵抗二肽肽酶IV的能力，可同时消除GLP-1在体内易被清除的两种因素，显著延长GLP-1的体内半衰期。由于脂联素球状域的活性大于全长的脂联素，而且细菌表达的脂联素球状域具有活性，在该融合蛋白中如进一步以脂联素球状域代替全长的脂联素，则可使该融合蛋白中的脂联素具有更大的活性。

本发明在国内、外首次运用基因重组技术，构建含人脂联素-胰升糖素样肽-1类似肽融合基因(Adiponectin-GLP-1-A融合基因)的原核表达载体PET28a-Adiponectin-GLP-1-A(该载体即为脂联素-胰升糖素样肽-1类似肽融合蛋白表达载体)，其中脂联素编码基因通过扩增脂联素球状域编码基因而获得，GLP-1-A编码基因通过将GLP-1(7-37)编码基因第8位氨基酸丙氨酸密码子突变为甘氨酸密码子而获得，Adiponectin-GLP-1-A融合基因通过接头序列将脂联素编码基因和GLP-1-A编码基因连接而成，该接头序列编码产物为富含甘氨酸的短肽。本发明为进一步用原核表达载体PET28a-Adiponectin-GLP-1-A转化蛋白表达细菌，经蛋白纯化获得人脂联素-胰升糖素样肽-1类似肽融合蛋白(Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白)，研究Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白的活性，测定融合蛋白上GLP-1-A的半衰期，获得能促进胰岛β细胞分泌胰岛素，又能改善胰岛素抵抗，可显著纠正2型糖尿病体内代谢紊乱，副作用小的新蛋白，建立表达具有生物活性的Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白的方法，提供前期研究。本研究进一步所获得的新蛋白将有可能取代相当部分的口服降糖药物，且降糖作用会更好、更安全、更符合人体的生理需要，具有极大的社会意义和经济意义。

发明内容

本发明的目的之一是提供人Adiponectin-GLP-1-A融合基因的cDNA序列，全长共567个bp，1-15bp编码肠激酶识别序列，16-108bp编码人GLP-1-A，序列长93bp(其中19-21bp将人GLP-1(7-37)编码基因中编码第8位氨基酸丙氨酸的密码子GCT突变为甘氨酸密码子GGT)，109-153bp编码接头肽DNA序列，序列长45bp，154-564bp编码脂联素，序列长411bp，565-567bp为终止密码子，该融合基因cDNA序列见SEQ ID NO 1。

本发明的目的之二是提供人Adiponectin-GLP-1-A融合基因的构建方法，通过以下步骤实现：脂联素编码基因通过扩增脂联素球状域编码基因而获得，通过将人GLP-1(7-37)编码基因中编码第8位氨基酸丙氨酸的密码子GCT

突变为甘氨酸密码子GGT获得人GLP-1-A基因，在设计人GLP-1-A基因引物时，在人GLP-1-A的上游引物P1上分别设计添加编码一个限制性酶切位点的核苷酸序列、肠激酶识别序列的核苷酸序列及人GLP-1-A基因的编码序列，下游引物P2分别设计添加人GLP-1-A基因互补序列、接头肽编码序列及编码一个限制性酶切位点的核苷酸序列；设计脂联素基因引物时，在上游引物P3上分别设计添加接头肽编码序列、编码一个限制性酶切位点的核苷酸序列及脂联素球状域基因的编码序列，其中P2与P3的限制性酶切位点相同，下游引物P4分别设计脂联素球状域基因的互补序列及编码一个限制性酶切位点的核苷酸序列。通过PCR分别扩增两个基因，其中引物P1、P2的扩增产物为含有接头肽序列的GLP-1-A基因。运用酶切技术，依次将含有接头肽序列的GLP-1-A基因和脂联素基因重组到原核表达载体中，利用限制性酶切位点将两个基因融合获得人Adiponectin-GLP-1-A融合基因，在该融合基因中，GLP-1-A的编码基因与脂联素编码基因通过编码一柔性接头肽的核苷酸序列相连接。GLP-1-A编码基因引物P1、P2序列见SEQ.ID NO2，SEQ.ID NO3，脂联素编码基因引物P3、P4序列见SEQ.ID NO4，SEQ.ID NO5；脂联素编码基因序列见SEQ.ID NO6，含有接头肽序列的GLP-1-A基因序列见SEQ.ID NO7，柔性接头肽的核苷酸序列见SEQ.ID NO8。

本发明的目的之三是提供含Adiponectin-GLP-1-A融合基因的表达载体(该载体即为脂联素-胰升糖素样肽-1类似肽融合蛋白表达载体)。

本发明的目的之四是提供含Adiponectin-GLP-1-A融合基因的表达载体的构建方法，通过以下步骤实现：

(1)提取人脂肪组织总RNA，RT-PCR获取脂联素编码基因，序列见SEQ.ID NO6。

(2)提取人类基因组DNA，PCR获取含有接头肽序列的GLP-1-A基因，序列见SEQ.ID NO7。

(3)运用酶切技术，依次将含有接头肽序列的GLP-1-A基因和脂联素编码基因重组到原核表达载体PET28a中获得含Adiponectin-GLP-1-A融合基因的原核表达载体PET28a-Adiponectin-GLP-1-A(该载体即为脂联素-胰升糖素样肽-1类似肽融合蛋白表达载体)。

(4)用PET28a-Adiponectin-GLP-1-A转化蛋白表达细菌，证实此载体能很好地表达含肠激酶识别序列的Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白，含肠激酶识别序列的Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白的序列见SEQ.ID NO9。

本发明的优点在于：

1.在世界上首次将脂联素和GLP-1-A的编码基因进行融合构建获得Adiponectin-GLP-1-A融合基因。

2.在世界上首次运用酶切技术，构建含Adiponectin-GLP-1-A融合基因的原核表达载体PET28a-Adiponectin-GLP-1-A。

3.Adiponectin-GLP-1-A融合基因由一接头序列连接而成，使得由该融合基因表达的Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白中的脂联素和GLP-1-A通过一接头肽相连接，有利于最大限度地保持融合蛋白上各个蛋白的空间构象及生物活性。

4.Adiponectin-GLP-1-A融合基因中的脂联素编码基因通过扩增脂联素球状域编码基因而获得，使得由该融合基因表达获得Adiponectin-GLP-1-A融合中的脂联素具有更大的生物活性。

5.在Adiponectin-GLP-1-A融合基因中还引入了肠激酶识别序列，使得该融合基因首先表达获得的是含肠激酶识别序列的Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白，即在Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白的N-端包括一个肠激酶识别序列Asp-Asp-Asp-Asp-Lys，可在以后的研究中通过肠激酶作用将其切割去除，使GLP-1-A的N-端游离出来，获得Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白。

6.本发明通过两种机制保证将来获得的Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白上的GLP-1-A有长的体内半衰期。一方面Adiponectin-GLP-1-A融合基因中的GLP-1-A基因是将GLP-1(7-37)编码基因第8位氨基酸丙氨酸密码子突变为甘氨酸密码子而获得，该突变可以使其表达产物具有显著的抵抗二肽肽酶IV降解的能力；另一方面融合蛋白本身分子量增大，不易从肾脏滤过而清除，可克服单一的GLP-1多肽易从肾脏清除、半衰期短的缺点。通过构建融合蛋白的方法延长GLP-1的体内半衰期在世界上属于首创。

7.用PET28a-Adiponectin-GLP-1-A原核表达载体转化蛋白表达细菌，发现此载体能很好地表达含肠激酶识别序列的Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白，此融合蛋白为世界上首次获得，为进一步经过蛋白纯化、肠激酶切割获得Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白，研究Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白的活性，测定融合蛋白上GLP-1-A的半衰期提供了良好的前期研究。

8.本发明的后续研究如能获得成功，获得具有生物活性的Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白，将在国内、外首次建立表达具有生物活性的Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白的方法，获得既能促进胰岛β细胞分泌胰岛素，又能改善胰岛素抵抗，可显著纠正2型糖尿病体内代谢紊乱，副作用小的新蛋白，具有极大的经济意义和社会意义。

附图说明

图1含有接头肽序列的GLP-1-A基因、脂联素编码基因琼脂糖凝胶电泳。

图2PET28a-Adiponectin-GLP-1-A酶切结果琼脂糖凝胶电泳。

图3含肠激酶识别序列的人Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白表达结果12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。

图4含肠激酶识别序列的人Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白Western Blot分析。

具体实施方式

以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围。

实施例一

1.材料和仪器

1.1材料

大肠杆菌菌株E.coli DH5α，BL21(DE3)由浙江大学附属第二医院肿瘤研究所提供，原核表达质粒PET28a购自德国novagen公司，RNA抽提液(Trizol)购自美国Gibcol BRL公司，焦碳酸二乙酯、Oligo(dT)₁₅、UNIQ-10柱式基因组DNA抽提试剂盒均购自上海生工生物工程公司，M-MLV Reverse Transcriptase、RNasin、dNTPs、Taq DNA polymerase、琼脂糖、T₄DNA连接酶、限制性内切酶Nhe I、BamH I、HindIII、Xba I均购自美国Promega公司，淋巴细胞提取液购自上海恒信化学试剂有限公司，GeneRuler^TM DNA Ladder Mix购自德国Fermentas公司，DNA Marker DL2000、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)购自日本TaKaRa公司，SDS聚丙稀酰胺凝胶电泳低分子量标准蛋白质购自上海博亚生物技术有限公司，6×His Monoclonal Antibody(抗组氨酸单克隆抗体)购自美国BD Biosciences公司，辣根酶标记的山羊抗小鼠IgG购自北京中山生物技术有限公司，质粒提取试剂盒购自上海申能博彩生物技术有限公司，Western Blotting LuminolReagent购自美国Santa Cruz公司，聚偏二氟乙烯膜购自美国Bio-Rad公司，QIA quick Gel Extraction kit购自德国QIAGEN公司。

1.2主要仪器

高速低温离心机(Biofuge 28RS)为德国Heraeus公司产品，细菌恒温摇床(Orbital Shaker)为美国Forma Scientific公司产品，紫外分光光度仪(8453型)购自美国Hewlett Packard公司，GeneAmp PCR system 2400购自美国PerkinElmer公司，垂直电泳仪(Mini Protean 3cell)和电转移仪均为美国Bio-Rad公司产品，真空冷冻干燥仪(UVS400A)购自美国Savant Instruments公司，超声波细胞粉碎机(JY88-2型)购自宁波新芝科器研究所，ABI377DNA测序仪购自美国PIERCE公司。

2.引物的设计

根据原核表达载体PET28a和GenBank中公布的人GLP-1(7-37)与脂联素的基因序列，设计GLP-1-A与脂联素编码基因(通过扩增脂联素球状域获得)的引物及插入载体的位置。GLP-1-A编码基因引物：P1：5’-cgcgctagcgacgatgacgataagcatggtgaaggggaccttt-3’，P2：5’-cgcggatccagaaccagaaccagaaccagaaccagaaccagaaccagatcctcggcctttcacca-3’；脂联素编码基因引物：P3：5’-cccggatccgcctatgtataccgctca-3’，P4：5’-cccaagctttcagttggtgtcatggta-3。P1将GLP-1(7-37)编码基因第8位氨基酸丙氨酸密码子GCT突变为甘氨酸密码子GGT(加粗斜体表示)，还包括N端肠激酶识别序列(下划线表示，PET28a表达的蛋白N端含有组氨酸标签，所以引物上设计了肠激酶识别序列，用来去除融合蛋白N端的组氨酸标签)、Nhe I酶切位点(GCTAGC，加粗表示)，P2，P3含接头序列(斜体表示)及BamH I酶切位点(GGATCC，加粗表示)，P4含HindIII酶切位点(AAGCTT，加粗表示)。接头序列为45个碱基的核苷酸序列5’-tctggttctggttctggttctggttctggttctggttctggatcc-3’，连接GLP-1-A与脂联素两个基因，编码15个氨基酸，序列为：N-(丝氨酸-甘氨酸)₇-丝氨酸-C。引物由上海生工生物工程公司合成。GLP-1-A编码基因引物序列见SEQ.ID NO2，SEQ.ID NO3，脂联素编码基因引物序列见SEQ.ID NO4，SEQ.ID NO5，编码柔性接头肽的核苷酸序列见SEQ.ID NO8。

3.脂联素编码基因的RT-PCR扩增

3.1脂肪组织总RNA的抽提

取-80℃保存的人脂肪组织约100mg，在液氮中研成粉末，参考Trizol试剂说明书抽提脂肪组织的总RNA，用紫外分光光度仪测定分析RNA纯度，所有RNAA₂₆₀/A₂₈₀比值在1.80以上。

3.2逆转录

以mRNA为模板，Oligo(dT)₁₅为引物，经逆转录合成cDNA，反应条件为：取2μg总RNA，1.0μl 10pmol/μl ligo(dT)₁₅，加0.1％DEPC水9μl，总体积10μl，混匀，65℃，变性10min，立即置于冰上，冷却后加入4μl 5×M-MLV Buffer，1μl 25mM dNTPs，0.5μl RNasin，0.5μl M-MLV Reverse Transcriptase，加0.1％DEPC水至20μl，37℃反应1h，所得cDNA用于PCR扩增。

3.3扩增

反应体系：10×PCR Buffer 5μl，25mM MgCl₂ 3μl，10mM dNTPs 1μl，10μM P₃ 1μl，10μM P₄ 1μl，cDNA 2μl，Taq DNA polymerase(5u/μl)0.5μl，ddH₂O 36.5μl，总体积50μl。PCR扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火1min，68℃延伸2min，40个循环后68℃延伸7min。扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定(电压80V，电泳30min)。用QIA quick GelExtraction kit回收目的基因。扩增结果见图1，其中1.DNA mark；2.GLP-1-A；3.脂联素，脂联素编码基因序列见SEQ.ID NO6。

4.GLP-1-A编码基因的PCR扩增

4.1人类基因组DNA的提取

取人外周静脉5ml抗凝血，分离人外周血有核细胞，用UNIQ-10柱式基因组抽提试剂盒提取人类基因组DNA。

4.2PCR扩增

反应体系为：10×PCR Buffer 5μl，25mM MgCl₂ 3μl，10mM dNTPs 1μl，10μM P₁ 1μl，10μM P₂ 1μl，cDNA 2μl，Taq DNA polymerase(5u/μl)0.5μl，ddH₂O 36.5μl，反应总体积50μl。PCR扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环后72℃延伸5min。扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定(电压80V，电泳30min)。用QIA quickGel Extraction kit回收目的基因。扩增结果见图1，GLP-1-A编码基因序列见SEQ.ID NO7。

5.Adiponectin-GLP-1-A融合基因及含该融合基因的原核表达载体PET28a-Adiponectin-GLP-1-A的构建

5.1PET28a-GLP-1-A重组质粒的构建

①酶切与连接：分别将割胶回收的GLP-1-A编码基因及PET28a质粒用Nhe I和BamH I在37℃的条件下进行酶切反应，酶切体系为：ddH₂O 10μl，10×buffer MC 2μl，BSA(10μg/μl)0.5μl，GLP-1-A编码基因或PET28a质粒6.5μl，Nhe I 0.5μl，BamH I 0.5μl，反应总体积20μl，反应3h。然后将酶切产物分别进行1.5％琼脂糖凝胶电泳(电压80V，电泳30min)后，用QIA quick Gel Extraction kit割胶回收酶切后的目的片段，将回收产物用T4 DNA连接酶4℃连接过夜，连接体系为：ddH₂O 4.5μl，10×buffer 1μl，PET28a酶切回收产物3μl，GLP-1-A编码基因酶切回收产物1μl，T4 DNA连接酶0.5μl，总体积10μl。次日将连接产物转化感受态细菌DH5α，以扩增连接质粒。

②鉴定：挑取儿个平板上已经长出的单菌落，分别在含7ml LB液体培养基(含卡那霉素80μg/ml)的扩增管中37℃，300rpm振摇过夜，用质粒提取试剂盒提取质粒，用Xba I和BamH I在37℃的条件下双酶切质粒，酶切体系为：ddH₂O 10μl，10×buffer MC 2μl，BSA(10μg/μl)0.5μl，连接质粒6.5μl，Xba I 0.5μl，BamH I 0.5μl，总体积20μl，反应3h，酶切产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳(电压80V，电泳30min)后，观察酶切结果，留取阳性克隆的菌液和质粒，获得PET28a-GLP-1-A重组质粒。

5.2Adiponectin-GLP-1-A融合基因及含该融合基因的原核表达载体PET28a-Adiponectin-GLP-1-A的构建

①酶切与连接：分别将构建好的PET28a-GLP-1-A质粒及割胶回收的脂联素目的基因用BamH I、HindIII在37℃的条件下进行酶切反应，酶切体系为：ddH₂O 10μl，10×buffer E 2μl，BSA(10μg/μl)0.5μl，PET28a-GLP-1-A或脂联素目的基因6.5μl，BamH I 0.5μl，HindIII 0.5μl，总体积20μl，反应3h。然后将酶切产物分别进行1.5％琼脂糖凝胶电泳(电压80V，电泳30min)，割胶回收酶切后目的片段，回收产物用T4 DNA连接酶4℃连接过夜，连接体系为：ddH₂O 14.5μl，10×buffer 2μl，PET28a-GLP-1-A酶切回收产物2μl，脂联素目的基因酶切回收产物1μl，T4 DNA连接酶0.5μl，总体积20μl。次日将连接产物转化感受态细菌DH5α，以扩增连接质粒。

②鉴定：挑取几个平板上已经长出的单菌落，在7ml LB液体培养基(含卡那霉素80μg/ml)的扩增管中37℃，300rpm振摇过夜，用质粒提取试剂盒提取质粒，分别用BamH I、HindIII(酶切体系为：ddH₂O 10μl，10×buffer E 2μl，BSA(10μg/μl)0.5μl，连接质粒6.5μl，BamH I 0.5μl，HindIII 0.5μl，总体积20μl，37℃反应3h)及Xba I、HindIII(酶切体系为：ddH₂O 10μl，10×bufferB 2μl，BSA(10μg/μl)0.5μl，连接质粒6.5μl，Xba I 0.5μl，HindIII 0.5μl，总体积20μl，37℃反应3h)双酶切质粒，酶切产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳(电压80V，电泳30min)后，出现426bp及683bp的小片断，酶切产物符合预期值，说明Adiponectin-GLP-1-A融合基因已成功插入PET28a的预期酶切位点，获得了Adiponectin-GLP-1-A融合基因及含该融合基因的原核表达载体PET28a-Adiponectin-GLP-1-A(该载体即为脂联素-胰升糖素样肽-1类似肽融合蛋白表达载体)。见图2，其中M.DNAmarker；1.PET28a-Adiponectin-GLP-1-A未酶切；2.BamH I/HindIII酶切结果；3.Xba I/HindIII酶切结果。经PET通用引物通过ABI377DNA测序仪对PET28a-Adiponectin-GLP-1-A进行测序鉴定，表明各基因的插入方向及顺序完全正确，所测序列和预期完全一致。Adiponectin-GLP-1-A融合基因序列见SEQ.ID NO1，全长共567个bp，1-15bp编码肠激酶识别序列，16-108bp编码人GLP-1-A，序列长93bp，109-153bp编码接头肽DNA序列，序列长45bp，154-564bp编码脂联素，序列长411bp，565-567bp为终止密码子，见SEQ.ID NO1。

6.原核表达载体PET28a-Adiponectin-GLP-1-A表达含肠激酶识别序列的Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白的初步研究

取测序正确的PET28a-Adiponectin-GLP-1-A转化感受态表达细菌BL21(DE3)，次日挑取单菌落于7ml LB液体培养基(含卡那霉素80μg/ml)中，37℃振摇过夜，吸取70μl到7ml LB液体培养基(含卡那霉素80μg/ml)中，37℃振摇2h，使菌液在600nm处吸光度(A₆₀₀)为0.4～0.6，留取诱导前菌液1ml作为对照，剩下菌液中加异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导，37℃分别振摇1～6h，分别收集1～6h各时段细菌，将每管细菌量进行调整，直至A₆₀₀基本一致，将收集的菌液以5,000rpm离心10min，弃上清，沉淀用PBS洗涤3次后，以适量PBS重悬，将菌液取10μl加等量的2×SDS凝胶加样缓冲液，100℃煮沸5min，13,000rpm，离心1min后上样，行12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后确定目的蛋白是否表达及表达量最大时间段。结果显示，与诱导前的菌液相比，IPTG诱导后在25KD处有较浓的蛋白条带，与预期的融合蛋白大小一致，且IPTG诱导5～6h的蛋白条带最浓，较诱导前均明显增多。取诱导后5h菌液1ml冰浴上超声破碎细菌，分别留上清及沉淀，将沉淀用与上清等体积的PBS混匀，分别取10μl，加等量的2×SDS凝胶加样缓冲液，100℃煮沸5min，13,000rpm，离心1min后上样，用12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析目的蛋白在上清和沉淀中的表达情况，结果发现，在25KD处有较浓的蛋白条带，以沉淀的电泳条带为浓，与预期的融合蛋白大小一致。见图3，其中M：蛋白marker，1.IPTG诱导后5h沉淀蛋白，2.IPTG诱导后5h上清蛋白，3.IPTG诱导前菌液，4-9.IPTG诱导后1h～6h总蛋白；用抗组氨酸单克隆抗体对产物行Western Blot分析显示上清及沉淀中均有特异性的蛋白表达。见4，其中1.IPTG诱导后5h沉淀蛋白，2.IPTG诱导后5h上清蛋白。由PET28a-Adiponectin-GLP-1-A原核表达载体表达首先获得的是含肠激酶识别序列的人Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白，共188个氨基酸，包括1-5aa编码肠激酶识别序列，6-36aa编码GLP-1-A(其中第7位氨基酸为突变的氨基酸甘氨酸)，37-51aa编码连接肽，52-188aa编码脂联素。序列见SEQ.IDNO9。可在以后的研究中进一步用肠激酶对该融合蛋白进行切割获得Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白。

本发明涉及的序列

SEQ.ID NO1(Adiponectin-GLP-1-A融合基因cDNA序列)：

SEQ.ID NO1的信息：

(i)序列特征

(A)长度：567个碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：双链

(D)拓扑：线性

(ii)分子型：cDNA

(iii)序列描述：

5’-gacgatgacgataagcatggtgaagggacctttaccagtgatgtaagttcttatttggaaggccaagctgccaaggaattcattgcttggctggtgaaaggccgaggatctggttctggttctggttctggttctggttctggttctggatccgcctatgtataccgctcagcattcagtgtgggattggagacttacgttactatccccaacatgcccattcgctttaccaagatcttctacaatcagcaaaaccactatgatggctccactggtaaattccactgcaacattcctgggctgtactactttgcctaccacatcacagtctatatgaaggatgtgaaggtcagcctcttcaagaaggacaaggctatgctcttcacctatgatcagtaccaggaaaataatgtggaccaggcctccggctctgtgctcctgcatctggaggtgggcgaccaagtctggctccaggtgtatggggaaggagagcgtaatggactctatgctgataatgacaatgactccaccttcacaggctttcttctctaccatgacaccaactga-3’

SEQ.ID NO2(GLP-1-A编码基因引物P1序列)：

SEQ.ID NO2的信息：

(i)序列特征

(A)长度：42个碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子型：DNA

(iii)序列描述：

5’-cgcgctagc gacgatgacgataagcatggtgaagggaccttt-3’

SEQ.ID NO3(GLP-1-A编码基因引物P2序列)：

SEQ.ID NO3的信息：

(i)序列特征

(A)长度：65个碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子型：DNA

(iii)序列描述：

5’-cgcggatccagaaccagaaccagaaccagaaccagaaccagaaccagatcctcggcctttcacca-3’

SEQ.ID NO4(脂联素编码基因引物P3序列)：

SEQ.ID NO4的信息：

(i)序列特征

(A)长度：27个碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子型：DNA

(iii)序列描述：

5’-cccggatccgcctatgtataccgctca-3’

SEQ.ID NO5(脂联素编码基因引物P4序列)：

SEQ.ID NO5的信息：

(i)序列特征

(A)长度：27个碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子型：DNA

(iii)序列描述：

5’-cccaagctttcagttggtgtcatggta-3

SEQ.ID NO6(脂联素编码基因序列)：

SEQ.ID NO6的信息：

(i)序列特征

(A)长度：426个碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：双链

(D)拓扑：线性

(ii)分子型：cDNA

(iii)序列描述：5’端引入BamH I酶切位点(6bp，方框表示)，3’端引入HindIII酶切位点(6bp，方框表示)。

5’-

gcctatgtataccgctcagcattcagtgtgggattggagacttacgttactatccccaacatgcccattcgctttaccaagatcttctacaatcagcaaaaccactatgatggctccactggtaaattccactgcaacattcctgggctgtactactttgcctaccacatcacagtctatatgaaggatgtgaaggtcagcctcttcaagaaggacaaggctatgctcttcacctatgatcagtaccaggaaaataatgtggaccaggcctccggctctgtgctcctgcatctggaggtgggcgaccaagtctggctccaggtgtatggggaaggagagcgtaatggactctatgctgataatgacaatgactccaccttcacaggctttcttctctaccatgacaccaactga

-3’

SEQ.ID NO7(GLP-1-A编码基因序列)：

SEQ.ID NO7的信息：

(i)序列特征

(E)长度：159个碱基

(F)类型：核酸

(G)链性：双链

(H)拓扑：线性

(ii)分子型：cDNA

(iii)序列描述：5’端引入Nhe I酶切位点(6bp，方框表示)、肠激酶识别序列(15bp，加粗表示)，3’端引入接头序列(45bp，加粗表示)，BamH I酶切位点(6bp，方框表示，位于接头序列内)，总长度159bp，其中25-27bp将人GLP-1(7-37)编码基因中编码第8位氨基酸丙氨酸的密码子GCT突变为甘氨酸密码子GGT(加粗斜体表示)。

5’ gacgatgacgataagcat

gaagggacctttaccagtgatgtaagttcttatttggaaggccaagctgccaaggaattcattgcttggctggtgaaaggccgaggatctggttctggttctggttctggttctggttctggttct

-3’

SEQ.ID NO8(Adiponectin-GLP-1-A融合基因柔性接头核苷酸序列)：

SEQ.ID NO8的信息：

(i)序列特征

(I)长度：45个碱基

(J)类型：核酸

(K)链性：双链

(L)拓扑：线性

(ii)分子型：DNA

(iii)序列描述：

5’-tctggttctggttctggttctggttctggttctggttctggatcc-3’

SEQ.ID NO9(含肠激酶识别序列的Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白序列)：

SEQ.ID NO9的信息：

(i)序列特征

(A)长度：188个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链性：单链

(ii)分子型：多肽

(iii)序列描述：

Asp Asp Asp Asp Lys His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu

Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Ser Gly Ser

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Ala Tyr Val Tyr Arg Ser Ala Phe

Ser Val Gly Leu Glu Thr Tyr Val Thr Ile Pro Asn Met Pro Ile Arg Phe Thr Lys Ile

Phe Tyr Asn Gln Gln Asn His Tyr Asp Gly Ser Thr Gly Lys Phe His Cys Asn Ile

Pro Gly Leu Tyr Tyr Phe Ala Tyr His Ile Thr Val Tyr Met Lys Asp Val Lys Val Ser

Leu Phe Lys Lys Asp Lys Ala Met Leu Phe Thr Tyr Asp Gln Tyr Gln Glu Asn Asn

Val Asp Gln Ala Ser Gly Ser Val Leu Leu His Leu Glu Val Gly Asp Gln Val Trp

Leu Gln Val Tyr Gly Glu Gly Glu Arg Asn Gly Leu Tyr Ala Asp Asn Asp Asn Asp

Ser Thr Phe Thr Gly Phe Leu Leu Tyr His Asp Thr Asn

Claims

1.人脂联素-胰升糖素样肽-1类似肽融合基因的cDNA序列，其特征是：全长共567个bp，1-15bp编码肠激酶识别序列，16-108bp编码人胰升糖素样肽-1类似肽(Glucagons-like Peptide-1Analogues，GLP-1-A)，序列长93bp，其中19-21bp将人胰升糖素样肽-1(7-37)[Glucagons-like Peptide-1(7-37)，GLP-1(7-37)]编码基因中编码第8位氨基酸丙氨酸的密码子GCT突变为甘氨酸密码子GGT，109-153bp编码接头肽DNA序列，序列长45bp，154-564bp编码脂联素，序列长411bp，565-567bp为终止密码子，该融合基因cDNA序列见SEQ ID NO 1。

2.人脂联素-胰升糖素样肽-1类似肽融合基因的构建方法，其特征是通过以下步骤实现：脂联素编码基因通过扩增脂联素球状域编码基因而获得，通过将人GLP-1(7-37)编码基因中编码第8位氨基酸丙氨酸的密码子GCT突变为甘氨酸密码子GGT获得人GLP-1-A基因，在设计人GLP-1-A基因引物时，在人GLP-1-A的上游引物P1上分别设计添加编码一个限制性酶切位点的核苷酸序列、肠激酶识别序列的核苷酸序列及人GLP-1-A基因的编码序列，下游引物P2分别设计添加人GLP-1-A基因互补序列、接头肽编码序列及编码一个限制性酶切位点的核苷酸序列；设计脂联素基因引物时，在上游引物P3上分别设计添加接头肽编码序列、编码一个限制性酶切位点的核苷酸序列及脂联素球状域基因的编码序列，其中P2与P3的限制性酶切位点相同，下游引物P4分别设计脂联素球状域基因的互补序列及编码一个限制性酶切位点的核苷酸序列，通过PCR分别扩增两个基因，其中引物P1、P2的扩增产物为含有接头肽序列的GLP-1-A基因，运用酶切技术，依次将含有接头肽序列的GLP-1-A基因和脂联素基因重组到原核表达载体中，利用限制性酶切位点将两个基因融合获得人脂联素-胰升糖素样肽-1类似肽融合基因，在该融合基因中，GLP-1-A的编码基因与脂联素编码基因通过编码一柔性接头肽的核苷酸序列相连接。

3.根据权利要求2所述的人脂联素-胰升糖素样肽-1类似肽融合基因的构建方法，其特征是：GLP-1-A编码基因引物P1、P2序列为SEQ.ID NO 2，SEQ.IDNO 3，脂联素编码基因引物P3、P4序列为SEQ.ID NO 4，SEQ.ID NO 5，脂联素编码基因序列为SEQ.ID NO 6，含有接头肽序列的GLP-1-A基因序列为SEQ.ID NO 7，柔性接头肽的核苷酸序列为SEQ.ID NO 8。

4.根据权利要求2所述的人脂联素-胰升糖素样肽-1类似肽融合基因的构建方法，其特征是：该融合基因是根据权利要求2所述的方法重组在原核表达载体中，该重组的原核表达载体为含人脂联素-胰升糖素样肽-1类似肽融合基因的表达载体。

5.根据权利要求4所述的含人脂联素-胰升糖素样肽-1类似肽融合基因的表达载体的构建方法，其特征是所述的原核表达载体的构建通过以下步骤实现：

(1)提取人脂肪组织总RNA，RT-PCR获取脂联素编码基因，序列见SEQ.ID NO 6；

(2)提取人类基因组DNA，PCR获取含有接头肽序列的GLP-1-A基因，序列见SEQ.ID NO 7；

(3)运用酶切技术，依次将含有接头肽序列的GLP-1-A基因和脂联素编码基因重组到原核表达载体PET28a中获得含脂联素-胰升糖素样肽-1类似肽融合基因的原核表达载体PET28a-Adiponectin-GLP-1-A；

(4)用PET28a-Adiponectin-GLP-1-A转化蛋白表达细菌，证实此载体能很好地表达含肠激酶识别序列的脂联素-胰升糖素样肽-1类似肽融合蛋白，含肠激酶识别序列的脂联素-胰升糖素样肽-1类似肽融合蛋白的序列见SEQ.ID NO 9。