CN102703460B - 制备重组LD78β蛋白的新工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及重组蛋白制备领域，具体公开了一种重组LD78β蛋白的制备工艺，利用基因工程的方法，人工合成表达重组LD78β蛋白的重组基因EK‑LD78β，将该重组基因序列插入载体，转化宿主细胞，通过发酵，分离、酶切、纯化等步骤获得重组LD78β蛋白。本发明的制备方法操作安全、简单、产品特异性高，有利于LD78β蛋白的大规模生产。
Description
技术领域
本发明涉及重组蛋白制备领域，具体公开了一种利用基因重组技术制备重组LD78β蛋白的新工艺。
背景技术
细胞因子（cytokine）是一类由免疫细胞合成和分泌的小分子多肽物质，它不仅能参与机体免疫调节、免疫细胞增殖、分化，同时也广泛存在于机体的整个系统中并发挥重要的生理作用。主要包括淋巴细胞产生的淋巴因子、单核巨噬细胞产生的单核因子、白细胞介素(interleukin,IL)、干扰素(interferon,IFN)、集落刺激因子(colony stimulating factor,CSF)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)、趋化因子(chemokine)、转化生长因子β（transforminggrowth factorβ,TGFβ）等。
趋化因子在正常的免疫系统中对淋巴细胞的迁移、归巢、激活、分化发育及炎症的发生、血管生成，肿瘤生长等过程起着非常重要的作用。它是一类控制免疫细胞做定向迁移的细胞因子，其功能的行使是由趋化因子受体介导而完成。趋化因子的相对分子质量在一般在8～12KDa之间，根据N端保守的半胱氨酸的数量及排列方式可分为4个亚家族：Cys-X-Cys（CXC）、Cys-Cys（CC）、Cys（C）、Cys-X3-Cys（CX3C）亚家族。
早在1986年Obaru等人在人类基因组中成功克隆出LD78β基因（Obaru,Fukuda et al.(1986).Journal 99:885-894），此基因位于人类17号染色体长臂，编码93个氨基酸残基的多肽，其中1-23个氨基酸残基为信号肽，在蛋白成熟过程中被切除；24-93个氨基酸残基为LD78β蛋白的功能序列。LD78β蛋白质属于趋化因子的CC亚家族，其系统名为CL3L1（chemokine(C-C motif)ligand 3-like 1），是CCR1、CCR3和CCR5的配体，对淋巴细胞和单核细胞有趋化作用。
人类免疫缺陷病毒（HIV）是能够感染人类免疫系统的慢病毒。自1981年首次发现至今，此病毒造成的获得性免疫缺陷综合症都是一种无法彻底治疗的高传染性、高破坏力的疾病。HIV主要分为HIV-1和HIV-2两种亚型，其中前者是主要的病原体。此病毒通过与免疫细胞的CD4受体结合而感染宿主细胞。随着研究发现，此病毒同时依赖辅助受体CCR5或CXCR4（Liu,Reid et al.(2007).Journal 9:120-130）。因此这些受体成为了新药研发的靶点，并且几种CCR5抑制剂正处于临床实验阶段。
利用何种趋化因子受体侵入细胞决定了HIV-1病毒株的嗜性。单核细胞/巨噬细胞嗜性的病毒株利用趋化因子受体CCR5侵入细胞，称为R5嗜性；T细胞嗜性的病毒株利用趋化因子受体CXCR4侵入细胞，称为X4嗜性；而既能利用CCR5，又能利用CXCR4侵入细胞的病毒株称为R5/X4嗜性。HIV-1gp120与何种辅助受体结合是随着HIV-1侵入靶细胞的不同阶段而有所变化的，通常在感染的初期是以CCR5为辅助受体；随着感染程度的加深，HIV-1由R5嗜性转化为R5/X4嗜性，而双嗜性的HIV-1是以CXCR4为主要辅助受体。
RANTES、MIP-1α是CCR5的天然受体，而LD78β（CCL3L1）是MIP-1α的同种型（即MIP-1β），两者的区别是仅有3个氨基酸残基不同，但是诱导细胞内Ca2+释放及增强细胞趋化作用的能力远强于RANTES和MIP-1α，它能特异性地与CCR5结合，并下调CCR5在人类单核细胞和巨噬细胞上的表达，抑制R5病毒株的感染（Meddows-Taylor,Donninger etal.(2006).Journal 87:2055-2065）。LD78β具有比RANTES高10倍的抑制病毒侵入活性，因此可能是最有效的治疗HIV的趋化因子类药物（Nibbs,Yang et al.(1999).Journal 274:17478-17483）。同时基因组中LD78β基因拷贝数的多少于HIV和乙肝感染发病几率呈负相关（Mamtani,Rovin et al.(2008).Journal 67:1076-1083）。
鉴于LD78β（CCL3L1）在临床和科学研究上的前景及应用，以及天然产品表达量极底，在分离纯化技术上存在很大难度，应用重组DNA技术即基因工程的方法制备重组人LD78β（CCL3L1）有着重要的意义。
目前国际上还没有一种高效生产LD78β的方法。实验室中常用病毒转染真核细胞或导入mRNA进行蛋白表达和功能研究，但是真核细胞表达蛋白成本高，操作难且不易放大。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种成本低、产量高，有利于大规模生产的利用基因重组技术制备重组人LD78β蛋白（CCL3L1）的新工艺。
本发明利用基因工程的方法，人工合成表达重组LD78β蛋白的重组基因EK-LD78β，将该重组基因序列插入表达载体，转化宿主细胞，通过发酵，分离纯化等步骤获得重组LD78β蛋白。
本发明的技术方案为：一种重组LD78β蛋白的制备工艺，具体步骤如下：
1)人工合成表达重组LD78β蛋白的重组基因EK-LD78β，所述重组基因EK-LD78β的序列包括左右两端的限制性酶切位点序列，以及两端限制性酶切位点序列之间的、5’至3’方向依次排列的肠激酶识别位点序列和重组LD78β蛋白基因序列；
2)重组质粒的构建：将上一步的重组基因EK-LD78β插入载体，获得含有重组LD78β蛋白基因序列的重组质粒；
3)基因工程菌的制备：将上一步获得的重组质粒转化宿主细胞制备基因工程菌；
4)外源基因的表达：基因工程菌发酵表达含有重组LD78β蛋白的融合蛋白；
5)目的蛋白的纯化：裂解菌体，收集融合蛋白，通过融合蛋白的酶切、纯化步骤获得重组LD78β蛋白产品。
所述肠激酶识别位点的氨基酸序列为：DDDDK（SEQ ID NO:1）；所述肠激酶识别位点的核苷酸序列为：GACGACGACGACAAG（SEQ ID NO:2）
所述重组LD78β蛋白基因序列为：
5’gcaccacttg ctgctgacac gccgaccgcc tgctgcttca gctacacctc ccggcagatt ccacagaatt tcatagctgactactttgag acgagcagcc agtgctccaa gcccagtgtc atcttcctaa ccaagcgagg ccggcaggtc tgtgctgaccccagtgagga gtgggtccag aaatatgtca gcgacctaga gctgagtgcc taa 3’（SEQ ID NO:3）
较优的，所述重组基因EK-LD78β序列左右两端的限制性酶切位点分别为Kpn I酶和Hind III酶的限制性酶切位点。
更优的，所述重组基因EK-LD78β序列5’至3’方向依次为Kpn I酶的限制性酶切位点序列、肠激酶识别位点序列、重组LD78β蛋白基因序列和Hind III酶的限制性酶切位点序列。
最优的，所述人工合成的表达重组LD78β蛋白的重组基因EK-LD78β的序列为：
5’ccagatctgg gtaccgacga cgacgacaag gcaccacttg ctgctgacac gccgaccgcc tgctgcttca gctacacctcccggcagatt ccacagaatt tcatagctga ctactttgag acgagcagcc agtgctccaa gcccagtgtc atcttcctaaccaagcgagg ccggcaggtc tgtgctgacc ccagtgagga gtgggtccag aaatatgtca gcgacctaga gctgagtgcctaaaagcttg cgg 3’（SEQ ID NO:4）
较优的，所述载体为含有T7强启动子的原核表达载体。使用含有T7强启动子的原核表达载体可以利用IPTG进行诱导，显著提高目的蛋白的表达水平。
最优的，所述载体为pET32a(+)。
pET32a(+)载体含有Trx-Tag以及多个酶切位点，可以将本发明所述重组基因EK-LD78β插入到pET32a(+)的Kpn I酶和Hind III酶的酶切位点之间，与硫氧还蛋白（TrxA）融合表达，表达包含标签蛋白、肠激酶识别位点和重组LD78β蛋白的融合蛋白，便于目的蛋白的分离纯化。
较优的，所述宿主细胞为大肠杆菌。
更优的，所述宿主细胞为大肠杆菌BL2l(DE3)。
BL21（DE3）能高效表达控制于T7启动子和核糖体结合位点的外源基因，它不表达ompT和lon（1）蛋白酶，因此表达产物比较稳定，不会被菌株内源性的蛋白酶所降解。
较优的，所述融合蛋白的酶切、纯化步骤采用四步纯化法，该四步纯化法依次为亲和层析、酶解融合蛋白、亲和层析和离子交换层析。
更优的，所述四步纯化法具体步骤为：
A.第一步亲和层析：Chelating Sepharose F.F.层析柱初步分离融合蛋白；
B.酶解融合蛋白：用肠激酶酶切步骤A分离的融合蛋白，获得酶解液；
C.第二步亲和层析：第二次采用Chelating Sepharose F.F.层析柱，纯化步骤B所得的酶解液，分离得到初步纯化的重组LD78β蛋白；
D.离子交换层析：离子交换柱进一步纯化步骤C获得的重组LD78β蛋白，得到进一步纯化的重组LD78β蛋白产品。
较佳的，所述步骤A第一步亲和层析具体为：用平衡液平衡填充有Chelating SepharoseF.F.的亲和柱；向菌体裂解处理后得到的上清液中加入咪唑、NaCI及磷酸盐配置含有10~70mM咪唑、300～700mM NaCl，10~50mM磷酸盐，pH值6.0～9.0的上样溶液；将上样溶液上柱，用平衡液清洗亲和柱，最后用洗脱液洗脱目的蛋白，收集活性蛋白峰流出液。
较优的，向菌体裂解处理后得到的上清液中加入咪唑、NaCI及磷酸盐配置含有10~30mM咪唑、400～500mM NaCl，10~20mM磷酸盐，pH值7.5±0.5的上样溶液。
更佳的，步骤A中所述平衡液为含l0~70mM咪唑、300～700mM NaCl，pH值6.0～9.0，10~50mM的磷酸盐缓冲液；洗脱液为含100~300mM咪唑、300～700mM NaCl，pH值6.0～9.0，10~50mM的磷酸盐缓冲液。上样溶液的流速为10mL/min，上样结束后用4~5倍柱床体积的平衡液清洗亲和柱。
最佳的，步骤A中所述平衡液为含10～30mM咪唑、400～500mM NaCl，pH值7.5±0.5，10～20mM的磷酸盐缓冲液；洗脱液为含250～300mM咪唑、400～500mM NaCl，pH值7.5±0.5，10～20mM的磷酸盐缓冲液。
较佳的，所述步骤B酶解融合蛋白具体为：将第一步收集的活性蛋白峰流出液稀释5～10倍后，用肠激酶进行处理，获得酶解液；加入的肠激酶与融合蛋白的质量比为1：500～2000，酶解反应温度为4～40℃，酶切5～20小时。
最佳的，所述步骤B酶解融合蛋白具体为：将第一步收集的活性蛋白峰流出液稀释5～10倍后，用肠激酶进行处理，获得酶解液；加入的肠激酶与融合蛋白的质量比为1：500～2000，酶解反应温度12～16℃，酶切16～20小时。
融合蛋白的重量可通过考马氏亮蓝染色法（Bradford法）测定流出液的浓度来进行换算。
较佳的，所述步骤C第二步亲和层析具体为：用平衡液Ⅰ平衡填充有ChelatingSepharose F．F．的亲和柱，将上一步得到的酶解液上柱后，用平衡液Ⅱ清洗亲和柱，收集流穿组分。
更佳的，步骤C中所述平衡液Ⅰ为pH值6.0～9.0，浓度10～50mM的磷酸盐缓冲液；平衡液Ⅱ为含l0~70mM咪唑、300～800mM NaCl，pH值6.0～9.0，10~50mM磷酸盐缓冲液。酶解液上柱的流速为10mL/min，上柱结束后用4~5倍柱床体积的平衡液淋洗亲和柱。
最佳的，步骤C中所述平衡液Ⅰ为pH值7.5±0.5，浓度10～20mM的磷酸盐缓冲液；平衡液Ⅱ为含10～30mM咪唑、400～500mM NaCl，pH值7.5±0.5，10～20mM磷酸盐缓冲液。
所述第二步亲和层析目的是将硫氧还蛋白与亲和柱结合，而使目的蛋白即酶切后获得的重组LD78β蛋白穿透Ni2+Chelating Sepharose F．F．亲和柱；
较佳的，所述步骤D离子交换层析具体为：用平衡液平衡填充有Q Sepharose F.F.或DEAE Sepharose F.F.的离子交换柱后，将上一步收集的流穿组分上柱，淋洗离子交换柱后，用洗脱液洗脱获得目的蛋白。
更佳的，步骤D中所述平衡液为pH值5.0～8.0，10~50mM的磷酸盐缓冲液；洗脱液为含有100～400mM NaCl，pH值5.0～8.0，l0~50mM的磷酸盐缓冲液。流穿组分上柱的流速为l0mL/min，上柱后用4~5倍柱床体积的平衡液淋洗离子交换柱。离子交换层析目的是进一步纯化目的蛋白。
最佳的，步骤D中所述平衡液为pH值7.5±0.2，10～20mM的磷酸盐缓冲液；洗脱液为含有300～400mM NaCl，pH值7.5±0.2，10～20mM的磷酸盐缓冲液。
最佳的，所述离子交换柱的填料为Q Sepharose F.F.。
对本发明构建获得的重组质粒，以T7 terminator primer为引物，对该重组质粒中的重组LD78β基因进行序列分析，测序结果如SEQ ID NO:5所示，结果表明：以此DNA序列推导的重组LD78β蛋白的氨基酸序列与文献报道及实验设计完全一致。
本发明基因工程的方法制备的重组LD78β蛋白配合本发明的四步纯化法，最终获得的重组人LD78β蛋白纯度可达98%，纯化后的重组蛋白产量可达35mg/L。
本发明的有益效果为：采用大肠杆菌作为宿主，表达Trx标签融合的LD78β蛋白，经肠激酶切除标签以及一系列纯化，最终得到HPLC纯度高达98%的重组人LD78β蛋白，并且制备获得的重组人LD78β蛋白活性好，产量高。本发明技术方案简单、安全，填补了LD78β蛋白生产工艺的欠缺，利于重组人LD78β蛋白的工业大规模生产。
附图说明
图1：pET-32a(+)载体物理图谱
图2：融合蛋白在工程菌E.coli内表达的SDS-PAGE电泳分析（M：标准蛋白质分子量；1：诱导前；2：诱导4小时）
图3：30升发酵罐发酵融合蛋白在工程菌内表达的SDS-PAGE电泳分析（M：标准蛋白质分子量；1：诱导前；2：诱导4小时）
图4：融合蛋白Trx-LD78β经肠激酶酶切后的SDS-PAGE电泳分析（M：标准蛋白质分子量；1：酶切前；2：肠激酶酶切16小时后；3：融合蛋白；4：Trx标签蛋白；5：重组LD78β蛋白）
图5：纯化后的重组LD78β蛋白的SDS-PAGE电泳分析（M：标准蛋白质分子量；1：纯化后的重组LD78β蛋白）
图6：纯化后的重组LD78β蛋白的HPLC的检测结果图谱
注：标准蛋白质分子量大小（从上至下）：99KDa，66KDa，45KDa，31KDa，20KDa，14.4KDa
具体实施方式
本发明利用基因工程的方法，人工合成表达重组LD78β蛋白的重组基因EK-LD78β，将该重组基因序列插入表达载体，转化宿主细胞，通过发酵，分离纯化等步骤获得重组LD78β蛋白。
具体可在重组基因EK-LD78β序列两端引入Kpn I酶和Hind III酶的限制性酶切位点，并通过酶切、连接的方法将重组基因EK-LD78β插入到pET32a(+)载体上Kpn I酶和Hind III酶的酶切位点之间，转化大肠杆菌，表达含有硫氧还蛋白、肠激酶识别位点和重组LD78β蛋白的融合蛋白。最后，通过四步纯化法分离纯化融合蛋白，获得重组LD78β蛋白。
以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明的保护范围。
实施例1 基因工程菌的制备
1.重组基因EK-LD78β的人工合成
重组基因EK-LD78β全序列由上海生工生物工程公司合成，所述重组基因EK-LD78β的基因序列包括靠近5’端的肠激酶（EK）识别位点序列（SEQ ID NO:2）、靠近3’端的重组LD78β蛋白基因序列（SEQ ID NO:3）以及重组基因EK-LD78β序列两端的Kpn I酶和Hind III酶的酶切位点序列。Kpn I和Hind III酶切位点用于重组质粒的构建；人工合成的重组基因EK-LD78β序列如SEQ ID NO：4所示。
2.重组质粒的构建
1）表达载体的构建：将人工合成的重组基因EK-LD78β片段经Kpn I/Hind III双酶切后克隆于经Kpn I/Hind III双酶切的pET32a(+)载体中，进行连接反应，连接反应条件为：T4 DNA连接酶（Promega公司），2～16℃，1～30小时，构建得到重组质粒pET32a(+)-LD78β。
2）表达载体的鉴定：将上一步获得的重组质粒通过CaCl2法（分子克隆实验指南，第二版，科学出版社）转化DH5α菌，Amp抗性筛选阳性克隆，再经Kpn I和Hind III双酶切鉴定得到重组质粒pET32a(+)-LD78β，结果表明已获得正确插入重组LD78β基因融合表达载体。然后，以T7 terminator primer为引物，以含有重组LD78β蛋白基因序列的重组质粒pET32a(+)-LD78β为模板，对该重组质粒中的基因进行序列分析，结果表明：以此DNA序列推导的人重组LD78β蛋白（CCL3L1）的氨基酸序列与文献报道及实验设计完全一致，证明重组质粒pET32a(+)-LD78β构建成功；重组质粒用T7 terminator引物测序的序列结果见SEQ ID NO:5。
3.基因工程菌的制备
1）构建基因工程菌：
将构建成功的重组质粒pET32a(+)-LD78β以CaCl2法（分子克隆实验指南，第二版，科学出版社）转化受体菌BL21(DE3)，筛选阳性克隆。选择表达相对最高的一株作为融合蛋白表达的工程菌{pET32a(+)-LD78β/BL21(DE3)}。
2）鉴定表达产物：
将经筛选的重组工程菌pET32a(+)-LD78β/BL21(DE3)划线在含100ul/ml氨苄青酶素的LB琼脂平板上，37℃培养16小时。挑选生长良好的单菌落，接种于LB培养液（含Ampl00ug/ml），37℃培养过夜。将过夜菌以1：50接种于20ml LB培养液中（含Amp l00ug/ml），37℃振荡培养。当OD600达0.6-0.8时，加IPTG至终浓度0.5mM，诱导4小时。菌液经5000rpm，5min离心，去培养基上清，沉淀菌体加入上样缓冲液，100℃水浴3min，离心后上SDS-PAGE电泳（积层胶5％，分离胶15％），染色，脱色，扫描分析，电泳结果见图2。
由于Trx-LD78β融合基因长609bp，融合蛋白含203个氨基酸，理论分子量约为22.1KD。SDS-PAGE结果表明：在22KD和30KD之间有明显表达条带，与预期相符，融合蛋白占菌体总蛋白的25％左右。
实施例2 发酵表达融合蛋白
种子活化：将斜面保存的本发明制备的大肠杆菌工程菌pET32a(+)-LD78β/BL21(DE3)取一环菌种接入30ml LB培养液中（含100ug/ml氨苄青酶素），37℃，200rpm摇瓶培养15小时。
种子液制备：取活化种子，按10％接种量接于2000ml M9+LB培养液中（含100ug/ml氨苄青酶素），37℃，250rpm摇瓶培养6小时。
30升发酵罐发酵：将种子液按6％接种量加入装有M9+LB培养基的发酵罐中，37℃，控制pH值在7.0左右，由通气及搅拌速度控制溶氧在30％以上。OD600为20～30时，加入IPTG至终浓度为0.5mM，诱导4.0小时收菌。
SDS-PAGE测蛋白表达量（积层胶3％，分离胶10％），电泳结果见图3，电泳结果显示：目的蛋白分子量约为22.1KD，约占菌体总蛋白的20％左右。
实施例3 目的蛋白的纯化
1.菌体处理
将发酵培养后的菌体4℃，9000rpm离心25分钟，弃上清液。用10倍菌体重量的磷酸盐缓冲液（pH6.0～9.0）悬浮菌体，然后APV-1000匀浆机（Invensys公司）循环破菌3次。4℃，9000rpm离心30分钟，取上清液，于4℃静止3小时后，再4℃，9000rpm离心30分钟，取上清液。
2.四步纯化法分离纯化
本纯化步骤所用设备为通用电气公司（GE）AKTA Purifier 100或者AKTA Primer，所有填料均为该公司产品。
方法一：
（1）Chelating Sepharose F.F.亲和层析法：先用含30mM咪唑、500mM NaCl，pH值7.5±0.5，20mM的磷酸盐缓冲液平衡填充有Chelating Sepharose F.F.的亲和柱；向菌体裂解处理后得到的上清液中加入1.0M咪唑、NaCI固体及磷酸盐缓冲溶液，配置含有30mM咪唑、500mM NaCl，20mM磷酸盐，pH值7.5±0.5的上样溶液；上柱：上样溶液流速为10mL/min（柱床体积200mL），用5倍柱床体积的平衡液清洗亲和柱，再用含250mM咪唑、500mMNaCl，pH值7.5±0.5，浓度为20mM的磷酸盐缓冲液洗脱目的蛋白，收集活性蛋白峰流出液。
（2）酶解融合蛋白：将第一步所收集活性蛋白峰流出液用考马氏亮蓝染色法（Bradford法）测定浓度后稀释5倍，以肠激酶：融合蛋白质量比为1：1000，向融合蛋白中加入肠激酶进行酶解酶切温度为16℃，酶切16小时获得酶解液；并对酶切16小时获得的酶解液进行SDS-PAGE，电泳结果见图4。
（3）Chelating Sepharose F.F.层析法：将Ni2+Chelating Sepharose F．F．柱用pH值7.5±0.5，浓度20mM的磷酸盐缓冲液平衡，将上一步得到的酶解液上柱，流速为10mL/min，用含30mM咪唑、500mM NaCl，pH值7.5±0.5，20mM的磷酸盐平衡缓冲液清洗，收集流穿组分。
（4）Q Sepharose F.F离子交换法进一步纯化目的蛋白，具体方法为：用pH值7.5±0.2，浓度20mM磷酸盐缓冲液平衡填充有Q Sepharose F.F的离子交换柱后，将上一步收集的流穿组分上柱，上柱的流速为l0mL/min（柱床体积200mL），清洗后以含有300mM NaCl，pH值7.5±0.2，20mM磷酸盐缓冲液洗脱，得到目的蛋白。经SDS-PAGE电泳和HPLC检测重组LD78β蛋白纯度达98％以上，SDS-PAGE结果见图5，HPLC结果见图6。
方法二：
（1）Chelating Sepharose F.F.亲和层析法：先用含70mM咪唑、300mM NaCl，pH值6.0，50mM的磷酸盐缓冲液平衡填充有Chelating Sepharose F.F.的亲和柱；向菌体裂解处理后得到的上清液中加入1.0M咪唑、NaCI固体及磷酸盐缓冲溶液，配置含有70mM咪唑、300mMNaCl，50mM磷酸盐，pH值6.0的上样溶液；上柱：上样溶液流速为10mL/min（柱床体积200mL），用5倍柱床体积的平衡液清洗亲和柱，再用含300mM咪唑、300mM NaCl，pH值6.0，浓度为50mM的磷酸盐缓冲液洗脱目的蛋白，收集活性蛋白峰流出液。
（2）酶解融合蛋白：将第一步所收集活性蛋白峰流出液用考马氏亮蓝染色法（Bradford法）测定浓度后稀释10倍，以肠激酶：融合蛋白质量比为1：2000，向融合蛋白中加入肠激酶进行酶解酶切温度为12℃，酶切20小时获得酶解液。
（3）Chelating Sepharose F.F.层析法：将Ni2+Chelating Sepharose F．F．柱用pH值6.0，浓度50mM的磷酸盐缓冲液平衡，将上一步得到的酶解液上柱，流速为10mL/min，用含70mM咪唑、300mM NaCl，pH值6.0，50mM的磷酸盐平衡缓冲液清洗，收集流穿组分。
（4）DEAE Sepharose F.F.离子交换法进一步纯化目的蛋白，具体方法为：用pH值5.0，浓度50mM磷酸盐缓冲液平衡填充有DEAE Sepharose F.F.的离子交换柱后，将上一步收集的流穿组分上柱，上柱的流速为l0mL/min（柱床体积200mL），清洗后以含有100mM NaCl，pH值5.0，50mM磷酸盐缓冲液洗脱，得到目的蛋白。经检测，纯化前融合蛋白的表达量为300-400mg/L，纯化后的重组蛋白产量可达35mg/L。
方法三：
（1）Chelating Sepharose F.F.亲和层析法：先用含10mM咪唑、700mM NaCl，pH值9.0，10mM的磷酸盐缓冲液平衡填充有Chelating Sepharose F.F.的亲和柱；向菌体裂解处理后得到的上清液中加入1.0M咪唑、NaCI固体及磷酸盐缓冲溶液，配置含有10mM咪唑、700mMNaCl，10mM磷酸盐，pH值9.0的上样溶液；上柱：上样溶液流速为10mL/min（柱床体积200mL），用5倍柱床体积的平衡液清洗亲和柱，再用含100mM咪唑、700mM NaCl，pH值9.0，浓度为10mM的磷酸盐缓冲液洗脱目的蛋白，收集活性蛋白峰流出液。
（2）酶解融合蛋白：将第一步所收集活性蛋白峰流出液用考马氏亮蓝染色法（Bradford法）测定浓度后稀释10倍，以肠激酶：融合蛋白质量比为1：500，向融合蛋白中加入肠激酶进行酶解酶切温度为40℃，酶切5小时获得酶解液。
（3）Chelating Sepharose F.F.层析法：将Ni2+Chelating Sepharose F．F．柱用pH值9.0，浓度10mM的磷酸盐缓冲液平衡，将上一步得到的酶解液上柱，流速为10mL/min，用含10mM咪唑、700mM NaCl，pH值9.0，10mM的磷酸盐平衡缓冲液清洗，收集流穿组分。
（4）Q Sepharose F.F离子交换法进一步纯化目的蛋白，具体方法为：用pH值8.0，浓度10mM磷酸盐缓冲液平衡填充有Q Sepharose F.F的离子交换柱后，将上一步收集的流穿组分上柱，上柱的流速为l0mL/min（柱床体积200mL），清洗后以含有400mMNaCl，pH值8.0，10mM磷酸盐缓冲液洗脱，得到目的蛋白。
方法四：
（1）Chelating Sepharose F.F.亲和层析法：先用含30mM咪唑、400mM NaCl，pH值7.5±0.5，20mM的磷酸盐缓冲液平衡填充有Chelating Sepharose F.F.的亲和柱；向菌体裂解处理后得到的上清液中加入1.0M咪唑、NaCI固体及磷酸盐缓冲溶液，配置含有30mM咪唑、400mM NaCl，20mM磷酸盐，pH值7.5±0.5的上样溶液；上柱：上样溶液流速为10mL/min（柱床体积200mL），用5倍柱床体积的平衡液清洗亲和柱，再用含250mM咪唑、400mMNaCl，pH值7.5±0.5，浓度为20mM的磷酸盐缓冲液洗脱目的蛋白，收集活性蛋白峰流出液。
（2）酶解融合蛋白：将第一步所收集活性蛋白峰流出液用考马氏亮蓝染色法（Bradford法）测定浓度后稀释5倍，以肠激酶：融合蛋白质量比为1：500，向融合蛋白中加入肠激酶进行酶解酶切温度为4℃，酶切20小时获得酶解液。
（3）Chelating Sepharose F.F.层析法：将Ni2+Chelating Sepharose F．F．柱用pH值7.5±0.5，浓度20mM的磷酸盐缓冲液平衡，将上一步得到的酶解液上柱，流速为10mL/min，用含30mM咪唑、400mM NaCl，pH值7.5±0.5，20mM的磷酸盐平衡缓冲液清洗，收集流穿组分。
（4）DEAE Sepharose F.F.离子交换法进一步纯化目的蛋白，具体方法为：用pH值7.5，浓度50mM磷酸盐缓冲液平衡填充有DEAE Sepharose F.F.的离子交换柱后，将上一步收集的流穿组分上柱，上柱的流速为l0mL/min（柱床体积200mL），清洗后以含有300mM NaCl，pH值7.5，20mM磷酸盐缓冲液洗脱，得到目的蛋白。
Claims (5)
1.一种重组LD78β蛋白的制备工艺，具体步骤如下：
1)人工合成表达重组LD78β蛋白的重组基因EK-LD78β，所述重组基因EK-LD78β的序列包括左右两端的限制性酶切位点序列，以及两端限制性酶切位点序列之间的、5’至3’方向依次排列的肠激酶识别位点序列和重组LD78β蛋白基因序列；其中，重组LD78β蛋白基因序列如SEQ ID NO:3所示，所述重组基因EK-LD78β序列左右两端的限制性酶切位点分别为Kpn I酶和Hind III酶的限制性酶切位点；
2)重组质粒的构建：将上一步的重组基因EK-LD78β插入载体，获得含有重组LD78β蛋白基因序列的重组质粒，其中，所述载体为pET32a(+)，所述重组基因EK-LD78β插入到所述pET32a(+)的Kpn I酶和Hind III酶的酶切位点之间；
3)基因工程菌的制备：将上一步获得的重组质粒转化宿主细胞制备基因工程菌，其中，所述宿主细胞为大肠杆菌；
4)外源基因的表达：基因工程菌发酵表达含有重组LD78β蛋白的融合蛋白；
5)目的蛋白的纯化：裂解菌体，收集融合蛋白，通过融合蛋白的酶切、纯化步骤获得重组LD78β蛋白产品，
并且，所述融合蛋白的酶切、纯化步骤采用四步纯化法，该四步纯化法依次为亲和层析、酶解融合蛋白、亲和层析和离子交换层析；所述四步纯化法具体步骤为：
A.第一步亲和层析：Chelating Sepharose F.F.层析柱初步分离融合蛋白；
B.酶解融合蛋白：用肠激酶酶切步骤A分离的融合蛋白，获得酶解液；
C.第二步亲和层析：第二次采用Chelating Sepharose F.F.层析柱，纯化步骤B所得的酶解液，分离得到初步纯化的重组LD78β蛋白；
D.离子交换层析：离子交换柱进一步纯化步骤C获得的重组LD78β蛋白，得到进一步纯化的重组LD78β蛋白产品。
2.如权利要求1所述的制备工艺，其特征在于，所述重组基因EK-LD78β序列5’至3’方向依次为Kpn I酶的限制性酶切位点序列、肠激酶识别位点序列、重组LD78β蛋白基因序列和Hind III酶的限制性酶切位点序列。
3.如权利要求2所述的制备工艺，其特征在于，所述重组基因EK-LD78β的序列如SEQ ID NO:4所示。
4.如权利要求1所述的制备工艺，其特征在于，
步骤A第一步亲和层析具体为：用平衡液平衡填充有Chelating Sepharose F.F.的亲和柱；向菌体裂解处理后得到的上清液中加入咪唑、NaCl及磷酸盐配制含有10～70mM咪唑、300～700mM NaCl，10～50mM磷酸盐，pH值6.0～9.0的上样溶液；将上样溶液上柱，用平衡液清洗亲和柱，最后用洗脱液洗脱目的蛋白，收集活性蛋白峰流出液；
所述步骤B酶解融合蛋白具体为：将第一步收集的活性蛋白峰流出液稀释5～10倍后，用肠激酶进行处理，获得酶解液；加入的肠激酶与融合蛋白的质量比为1：500～2000，酶解反应温度为4～40℃，酶切5～20小时；
所述步骤C第二步亲和层析具体为：用平衡液Ⅰ平衡填充有Chelating SepharoseF.F.的亲和柱，将上一步得到的酶解液上柱后，用平衡液Ⅱ清洗亲和柱，收集流穿组分，其中，所述平衡液Ⅰ为pH值6.0～9.0，浓度10～50mM的磷酸盐缓冲液；平衡液Ⅱ为含10～70mM咪唑、300～800mM NaCl，pH值6.0～9.0，10～50mM磷酸盐缓冲液；
所述步骤D离子交换层析具体为：用平衡液平衡填充有Q Sepharose F.F.或DEAESepharose F.F.的离子交换柱后，将上一步收集的流穿组分上柱，淋洗离子交换柱后，用洗脱液洗脱获得目的蛋白。
5.如权利要求4所述的制备工艺，其特征在于，
步骤D中所述平衡液为pH值5.0～8.0，10～50mM的磷酸盐缓冲液；洗脱液为含有100～400mM NaCl，pH值5.0～8.0，10～50mM的磷酸盐缓冲液；
并且，所述离子交换柱的填料为Q Sepharose F.F。
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| CCL3L1融合蛋白的表达纯化及其多克隆抗体的制备;张薇等;《中华实验和临床感染病杂志（电子版）》;20070831;第1卷(第3期);135-140 * |
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