CN114940710B

CN114940710B - 一种提高重组人psma蛋白表达的方法

Info

Publication number: CN114940710B
Application number: CN202210635084.0A
Authority: CN
Inventors: 杨佩; 林立
Original assignee: Kaikai Biotechnology Shanghai Co ltd
Current assignee: Kaikai Biotechnology Shanghai Co ltd
Priority date: 2022-06-07
Filing date: 2022-06-07
Publication date: 2023-09-26
Anticipated expiration: 2042-06-07
Also published as: CN114940710A

Abstract

本发明提供了一种提高重组人PSMA蛋白表达的方法，其特征在于：用ExpiCHO‑S细胞进行瞬时表达重组人PSMA蛋白。此方法表明，在不影响蛋白活性的前提下，能通过表达体系和方法的更改来提高重组人PSMA蛋白的表达量。此方法可以得到更大收率，节约培养基，物料，耗材，人力成本。

Description

一种提高重组人PSMA蛋白表达的方法

技术领域

本发明涉及生物技术，具体地，涉及一种提高重组人PSMA蛋白表达的方法。

背景技术

前列腺癌(PCa)是全球男性中最常见的与性相关的恶性肿瘤，死亡率很高。最初发现PSMA在正常前列腺分泌上皮中特异性表达，后来发现PSMA在前列腺癌(PCa)中的表达明显上调。PSMA在PCa细胞中的表达是正常细胞的100至1000倍，并且其表达水平与疾病的严重程度密切相关，被认为是前列腺癌的理想的诊断和治疗靶点。

前列腺特异性膜抗原(Prostate-specific membrane antigen，PSMA)是一种Ⅱ型跨膜蛋白，由胞外C末端、螺旋跨膜结构和胞质N末端构成。由于PSMA的胞外区可被抗体、肽、RNA适配体和小分子识别，使得它成为靶向治疗的理想靶分子。除了放射性疗法以外，如单克隆抗体(mAb)、抗体药物偶联物(ADC)、嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)、双特异性/多特异性抗体、癌症疫苗等PSMA治疗药物也越来越受到关注。

目前，多数生物公司为了得到少量且为人源的重组蛋白，一般会选择在哺乳动物细胞内表达，尤其是Expi293瞬时表达系统。

Expi293瞬时表达系统也毫无争议的成为目前瞬时表达的主要方式。不仅花费的时间短，所用的转染试剂PEI能实现产量化，而且蛋白修饰也更加全面。但是并不是所有蛋白均能在Expi293瞬时表达获得较好的收益。

例如：重组人PSMA蛋白，在本发明的研究中，采用传统Expi293细胞表达，将PSMA质粒通过PEI方法转染至Expi293细胞内培养6天，纯化获得重组人PSMA蛋白。结果表明其收率极低，仅为0.2mg/L。

发明内容

本发明旨在克服上述缺陷，用EBXP-F1流式电转仪(苏州壹达生物)电转PSMA质粒至ExpiCHO-S细胞内，培养一段时间后收样，纯化即可获得大量重组人PSMA蛋白。此方法表明，在不影响蛋白活性的前提下，能通过表达体系和方法的更改来提高PSMA蛋白的表达量。此方法可以得到更大收率，节约培养基，物料，耗材，人力成本。

具体地，在本发明中提供了一种提高重组人PSMA蛋白表达的方法，其特征在于：用ExpiCHO-S细胞进行瞬时表达重组人PSMA蛋白。

进一步地，本发明提供的一种提高重组人PSMA蛋白表达的方法，其特征还在于：

采用流式电转仪电转PSMA质粒至ExpiCHO-S细胞内，培养1-15天收样。

进一步地，本发明提供的一种提高重组人PSMA蛋白表达的方法，其特征还在于，具体步骤如下所示：

S1.将PSMA序列用EcoR I和Hind III连接至pTT5上，得到的质粒转化至DH5α感受态细胞中，挑菌扩大培养，获得大量高纯度的质粒；

S2.复苏好待转的ExpiCHO-S细胞，并进行放大传代；

S3.完成细胞和质粒的准备后，将其轻柔的充分混合；

S4.电转后进行孵育；

S5.接种培养；

S6.培养1-15天后，进行纯化。

上述复苏好待转的ExpiCHO-S细胞，细胞代次必须为复苏三代以后，传代时间在一个月以内；

上述复苏过程需要添加终浓度为4-6mM培养基添加剂(如：谷氨酰胺或者GlutaMAXSupplement等常用添加剂)；

上述放大传代，每次按照0.5-1*10^6进行传代，最大细胞密度不要超过6*10^6个细胞。

所述电转的工作参数如下：

电压设置为150-300V；

脉宽1000-3000μs；

电极次数3-6次；

时间间隔300-600ms；

流速3-6mL/min；

设置为摇摆。

上述电转的工作参数如下：

电压设置为200V±50；

脉宽2000μs±100；

电极次数4.5次±0.5；

时间间隔611ms±20；

流速4.71mL/min±1；

最优电转的工作参数如下：

电压设置为200V；

脉宽2000μs；

电极次数4.5次；

时间间隔611ms；

流速4.71mL/min；

设置为摇摆。

上述孵育为：37℃培养箱静置孵育10-30min。

上述接种培养的具体步骤如下：

S5-1.将孵育完成的细胞表面杀菌处理后，移除上层白色絮状物，将下层电转后的细胞小心转移至含有预热培养基的3000mL培养摇瓶内，于37℃恒温培养摇床中培养5-20min；

S5-2.以活细胞密度为4-6*10^6(优选：5*10^6)进行接种培养,于37℃恒温培养摇床中培养16-24h后进行补料，加入补料培养基(如：5％的Feed 03以及0.5％的Feed B02)，并且之后每隔一天需要补糖和补加补料培养基。

如权利要求1上述的一种提高重组人PSMA蛋白表达的方法，其特征在于：

上述纯化为：采用0.1-0.8μm滤器进行过滤，进行后续的纯化；

纯化包括但不限于镍柱亲和层析、阴离子柱层析、S200分子筛等常规的纯化方式。

附图说明

图1.Expi293用PEI瞬时转染PSMA质粒后收率、纯度和活性数据(批号：041104)；

图2.ExpiCHO-S电转PSMA质粒收率、纯度和活性数据1:(批号：030901)；

图3.ExpiCHO-S电转PSMA质粒收率、纯度和活性数据2:(批号：041203)；

图4.重组人PSMA蛋白批号：030901产品和批号：041203产品的ELISA结果对比图；

图5.重组人PSMA蛋白批号：041104、批号：030901产品与批号：041203产品的ELISA结果对比图；

图6.流式电转仪构造形态图；

图7.PSMA表达载体质粒图谱；

图8.PSMA质粒EcoRI和HindIII双酶切图；

图9.PSMA蛋白批号：030901产品的原液和干粉的ELISA结果对比图。

具体实施方式

一、重组人PSMA蛋白表达

1.1重组人PSMA全基因合成及质粒大抽

选择Uniprot Q04609氨基酸序列Lys44-Ala750，通过信号肽筛选，最终选择Luciferase SP为最终的信号肽。按照Expi293的优化原则，对核酸序列进行优化。在序列的5＇端添加EcoR I和Kozak序列(GCCGCCACC)，在信号肽后加入8*His作为标签，同时在序列3＇端添加终止子和Hind III序列。将核酸序列发送至基因合成公司进行全基因合成。最后通过EcoR I和Hind III连接至pTT5载体上，此时获得PSMA重组质粒(质粒编号：KT047，恺佧生物)。

将得到的质粒转化至DH5α感受态细胞中，次日挑单克隆菌株，逐步扩大培养，用碱裂解法和过柱纯化，获得大量高纯度低内毒素的质粒。将得到的质粒进行双酶切和测序验证。如图8所示，结果显示与预期的克隆片段一致。

质粒要求：质粒大抽后用灭菌超纯水溶解，质粒浓度要求大于1μg/μl(如果质粒浓度未到达1mg/mL，则需要冻干浓缩处理)且不含TE、EDTA等螯合剂；纯度要求在1％琼脂糖凝胶电泳胶图上无其他杂带，且A260/280在1.8-2.0范围内；将体积大于5mL的PSMA重组质粒用0.22μm的滤器进行过滤除菌待用。

核酸序列如下所示(SEQ ID No.1)：

ATGGGAGTCAAGGTGCTGTTTGCACTCATTTGTATTGCCGTGGCCGAGGCTCACCACCACCACCATCACCACCACAAGTCCTCCAACGAGGCCACAAATATCACACCTAAGCACAACATGAAGGCCTTTCTGGATGAGCTGAAGGCCGAGAATATCAAGAAGTTCCTGTACAATTTTACACAGATACCACATTTAGCAGGAACAGAACAAAACTTTCAGCTTGCAAAGCAAATTCAATCCCAGTGGAAAGAATTTGGCCTGGATTCTGTTGAGCTAGCTCATTATGATGTCCTGTTGTCCTACCCAAATAAGACTCATCCCAACTACATCTCAATAATTAATGAAGATGGAAATGAGATTTTCAACACATCATTATTTGAACCACCTCCTCCAGGATATGAAAATGTTTCGGATATTGTACCACCTTTCAGTGCTTTCTCTCCTCAAGGAATGCCAGAGGGCGATCTAGTGTATGTTAACTATGCACGAACTGAAGACTTCTTTAAATTGGAACGGGACATGAAAATCAATTGCTCTGGGAAAATTGTAATTGCCAGATATGGGAAAGTTTTCAGAGGAAATAAGGTTAAAAATGCCCAGCTGGCAGGGGCCAAAGGAGTCATTCTCTACTCCGACCCTGCTGACTACTTTGCTCCTGGGGTGAAGTCCTATCCAGACGGTTGGAATCTTCCTGGAGGTGGTGTCCAGCGTGGAAATATCCTAAATCTGAATGGTGCAGGAGACCCTCTCACACCAGGTTACCCAGCAAATGAATATGCTTATAGGCGTGGAATTGCAGAGGCTGTTGGTCTTCCAAGTATTCCTGTTCATCCAATTGGATACTATGATGCACAGAAGCTCCTAGAAAAAATGGGTGGCTCAGCACCACCAGATAGCAGCTGGAGAGGAAGTCTCAAAGTGCCCTACAATGTTGGACCTGGCTTTACTGGAAACTTTTCTACACAAAAAGTCAAGATGCACATCCACTCTACCAATGAAGTGACAAGAATTTACAATGTGATAGGTACTCTCAGAGGAGCAGTGGAACCAGACAGATATGTCATTCTGGGAGGTCACCGGGACTCATGGGTGTTTGGTGGTATTGACCCTCAGAGTGGAGCAGCTGTTGTTCATGAAATTGTGAGGAGCTTTGGAACACTGAAAAAGGAAGGGTGGAGACCTAGAAGAACAATTTTGTTTGCAAGCTGGGATGCAGAAGAATTTGGTCTTCTTGGTTCTACTGAGTGGGCAGAGGAGAATTCAAGACTCCTTCAAGAGCGTGGCGTGGCTTATATTAATGCTGACTCATCTATAGAAGGAAACTACACTCTGAGAGTTGATTGTACACCGCTGATGTACAGCTTGGTACACAACCTAACAAAAGAGCTGAAAAGCCCTGATGAAGGCTTTGAAGGCAAATCTCTTTATGAAAGTTGGACTAAAAAAAGTCCTTCCCCAGAGTTCAGTGGCATGCCCAGGATAAGCAAATTGGGATCTGGAAATGATTTTGAGGTGTTCTTCCAACGACTTGGAATTGCTTCAGGCAGAGCACGGTATACTAAAAATTGGGAAACAAACAAATTCAGCGGCTATCCACTGTATCACAGTGTCTATGAAACATATGAGTTGGTGGAAAAGTTTTATGATCCAATGTTTAAATATCACCTCACTGTGGCCCAGGTTCGAGGAGGGATGGTGTTTGAGCTAGCCAATTCCATAGTGCTCCCTTTTGATTGTCGAGATTATGCTGTAGTTTTAAGAAAGTATGCTGACAAAATCTACAGTATTTCTATGAAACATCCACAGGAAATGAAGACATACAGTGTATCATTTGATTCACTTTTTTCTGCAGTAAAGAATTTTACAGAAATTGCTTCCAAGTTCAGTGAGAGACTCCAGGACTTTGACAAAAGCAACCCAATAGTATTAAGAATGATGAATGATCAACTCATGTTTCTGGAAAGAGCATTTATTGATCCATTAGGGTTACCAGACAGGCCTTTTTATAGGCATGTCATCTATGCTCCAAGCAGCCACAACAAGTATGCAGGGGAGTCATTCCCAGGAATTTATGATGCTCTGTTTGATATTGAAAGCAAAGTGGACCCTTCCAAGGCCTGGGGAGAAGTGAAGAGACAGATTTATGTTGCAGCCTTCACAGTGCAGGCAGCTGCAGAGACTTTGAGTGAAGTAGCCTAA

1.2细胞扩大培养

提前复苏好待转的ExpiCHO-S细胞，细胞代次必须为复苏三代以后，传代时间在一个月以内；

1.2.1细胞复苏

取待转的细胞株ExpiCHO-S，按照复苏要求进行复苏，复苏过程需要添加终浓度为4-6mM谷氨酰胺；

采用常规方式进行复苏操作，在本实施例中，其具体过程如下所述；

从液氮罐种取出ExpiCHO-S细胞，在37℃的水浴锅中划“O”型，冻存管盖保持在水浴锅水位线上方，在2min内完成，直至只剩下少量的冰；

在50mL无菌离心管中加入已预热9mL的培养基，将冻存管内的细胞全部转移进去。200g室温离心5min，弃上清，轻轻在手背上敲打，使细胞团变得松散；

从125mL摇瓶内取出10mL已预热的培养基至敲散的离心管内，将离心管内所有的细胞全部转移至125mL摇瓶中，共20mL，再加入0.6mL母液浓度为200mM的谷氨酰胺，放置于37℃120rpm 8％CO₂的振荡培养箱中培养2-3天。

1.2.2细胞传代

将复苏2-3天的ExpiCHO-S细胞进行扩大培养，每次按照0.5-1*10^6cells/mL进行传代，最大细胞密度不要超过6*10^6cells/mL。谷氨酰胺按照终浓度为4-6mM加入进行添加，将细胞传代至5*10^6cells/mL，共1000mL。

具体过程如下：

第一次操作(复苏)：密度为0.5*10^6cells/mL，培养3天后，密度为4-6*10^6cells/mL，体积为20mL；

第二次操作(传代)：密度为0.5-1*10^6cells/mL，培养2-3天后，密度为4-6*10^6cells/mL，体积为100mL；

第三次操作(传代)：密度为0.5-1*10^6cells/mL，培养2-3天后，密度为4-6*10^6cells/mL，体积为400mL；

第四次操作(传代)：密度为0.5-1*10^6cells/mL，培养2-3天后，密度为4-6*10^6cells/mL，体积为1000mL；

第五次操作(直接使用)：此时生长的密度为4-6*10^6cells/mL，体积为1000mL；

1.3电转

本电转设备的工作参数如下：

参数名称	参数范围
		电压	30-600V
脉宽	10-100,000μs
		次数	1.00-99.00
间隔	100-1,000,000ms
		流速	1-50ml/min
摇动	(样品管±30°摇摆，75/min，不可调)

1.3.1电转前细胞准备

将待电转1000mL的ExpiCHO-S空白细胞取200ul用台盼蓝进行计数，电转前要求活率高于95％，并用显微镜观察确认，保证无杂菌污染。

取5*10^9 cells/mL细胞全部转移至无菌离心杯中，配平后300g离心5-10min，将原来培养基尽量去除干净，避免电导过高影响后面电转效率。收集细胞，轻轻敲打细胞让其松散后，用50mL EL buffer轻轻重悬细胞。尽可能将全部细胞从细胞离心杯中转移至尖底250mL离心管中，再用50mL的ELbuffer涮洗一遍离心杯，最后将剩余细胞全部转移至250mL离心管中，共100mL细胞悬液，做好标记备用。

1.3.2 PSMA质粒与细胞液轻柔的充分混合

取步骤1.1中PSMA质粒5mg的加入到1.3.1中100mL细胞悬液中，轻轻吹打数十次，避免产生气泡，标记为“电转管”。如若产生气泡，需静置2min后用1mL枪头小心吸取气泡。取另外一个无菌尖底250ml的离心管内加入120mL预热的表达培养基，标记为“收集管”备用。

1.3.3电转

打开流式电转仪电源键和开关键，仪器自检无误后，设置电转参数，电压设置为200V，脉宽2000μs，电极次数4.5次，时间间隔611ms，流速4.71mL/min，设置为摇摆。

确认好参数后取出250mL的电转一次性专用耗材，按照从左到右要求安装耗材至流式电转仪的相应位置。

从左到右安装顺序为标为“电转管”的250mL离心管——检测器——电转槽——蠕动泵——标为“收集管”的250mL离心管，具体详见图6。确认参数并开始电击。

电转完成后，将电转耗材从右向左依次取下，将耗材表面喷洒75％酒精消毒后，缓慢移至生物安全柜内，将标为“收集管”的250mL离心管用自身的管盖拧紧。封好封口膜转移至37℃培养箱静置孵育10-30min。

此时取表达培养基500mL加至3000mL的摇瓶内，做好标记，放入37℃8％CO₂120rpm恒温培养摇床内预热。

1.3.4接种及补料培养

将孵育完成的细胞表面喷洒75％酒精后转移至生物安全柜中，小心吸取上层白色絮状物。将下层电转后的细胞小心转移至含有预热培养基的3000mL培养摇瓶内，放入37℃8％CO₂120rpm恒温培养摇床培养5-20min后取样计数。电转后细胞活率约为90-98％范围内，收率约为70％-90％。

取200uL S5-1细胞计数，以活细胞密度为5*10^6cells/mL进行接种培养。将细胞置于37℃、8％CO₂120rpm恒温培养摇床中培养16-24h后进行补料，加入5％的Feed 03以及0.5％的Feed B02补料培养基，并且之后每隔一天需要补糖至6g/L和补加补料培养基。

1.3.5收样

培养7天或者细胞活率低至70％的细胞培养物，转移至细胞离心杯中配平。10,000rpm离心20min。用0.45um滤器进行过滤，进行后续的纯化。

二、对比结果

2.1.不同转染方法的收率结果

传统的化学转染，即将PSMA质粒与PEI混合，以复合物的形式转染Expi293细胞外，本发明针对PSMA蛋白的表达提供了一种通过物理转染的方式，即将质粒与待转细胞混合好后，采用流式电转仪电转的方法进行表达，结果如下所示。

上述多批次的实验结果也验证了PEI瞬时转染收率为0.2mg/L不是偶然现象。

如图1-5所示，在活性和纯度都不受影响的情况下，本发明方法制备的产品(批号：030901，批号：041203)，其产量较PEI(批号：041104)转染的方法上提高了70倍(PEI转染产量为0.2mg/L，电转产量为15mg/L)。

此外，从上表结果表明，PSMA换信号肽后的质粒PEI瞬时转染Expi293的结果不良。

2.2.重组人PSMA批次间稳定性结果

如图2-4所示，不同批次间生产所得的重组人PSMA，本发明方法获得的产品，其表达量显然更稳定。

2.3.重组人PSMA活性结果

图4和图5所示，电转得到的重组人PSMA蛋白(批号：030901，批号：041203)与PEI转染获得的重组人PSMA蛋白(批号：041104)活性无明显差别。

2.4重组人PSMA冻干稳定性结果

如图9所示，得到的重组人PSMA蛋白冻干后，其活性与原液一致。

综上所述，此方法表明，在不影响蛋白活性的前提下，能通过表达体系和方法的更改来提高重组人PSMA蛋白的表达量。此方法可以得到更大收率，节约培养基，物料，耗材，人力成本。

序列表

<110> 恺佧生物科技(上海)有限公司

<120> 一种提高PMSA蛋白表达的方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2199

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 1

atgggagtca aggtgctgtt tgcactcatt tgtattgccg tggccgaggc tcaccaccac 60

caccatcacc accacaagtc ctccaacgag gccacaaata tcacacctaa gcacaacatg 120

aaggcctttc tggatgagct gaaggccgag aatatcaaga agttcctgta caattttaca 180

cagataccac atttagcagg aacagaacaa aactttcagc ttgcaaagca aattcaatcc 240

cagtggaaag aatttggcct ggattctgtt gagctagctc attatgatgt cctgttgtcc 300

tacccaaata agactcatcc caactacatc tcaataatta atgaagatgg aaatgagatt 360

ttcaacacat cattatttga accacctcct ccaggatatg aaaatgtttc ggatattgta 420

ccacctttca gtgctttctc tcctcaagga atgccagagg gcgatctagt gtatgttaac 480

tatgcacgaa ctgaagactt ctttaaattg gaacgggaca tgaaaatcaa ttgctctggg 540

aaaattgtaa ttgccagata tgggaaagtt ttcagaggaa ataaggttaa aaatgcccag 600

ctggcagggg ccaaaggagt cattctctac tccgaccctg ctgactactt tgctcctggg 660

gtgaagtcct atccagacgg ttggaatctt cctggaggtg gtgtccagcg tggaaatatc 720

ctaaatctga atggtgcagg agaccctctc acaccaggtt acccagcaaa tgaatatgct 780

tataggcgtg gaattgcaga ggctgttggt cttccaagta ttcctgttca tccaattgga 840

tactatgatg cacagaagct cctagaaaaa atgggtggct cagcaccacc agatagcagc 900

tggagaggaa gtctcaaagt gccctacaat gttggacctg gctttactgg aaacttttct 960

acacaaaaag tcaagatgca catccactct accaatgaag tgacaagaat ttacaatgtg 1020

ataggtactc tcagaggagc agtggaacca gacagatatg tcattctggg aggtcaccgg 1080

gactcatggg tgtttggtgg tattgaccct cagagtggag cagctgttgt tcatgaaatt 1140

gtgaggagct ttggaacact gaaaaaggaa gggtggagac ctagaagaac aattttgttt 1200

gcaagctggg atgcagaaga atttggtctt cttggttcta ctgagtgggc agaggagaat 1260

tcaagactcc ttcaagagcg tggcgtggct tatattaatg ctgactcatc tatagaagga 1320

aactacactc tgagagttga ttgtacaccg ctgatgtaca gcttggtaca caacctaaca 1380

aaagagctga aaagccctga tgaaggcttt gaaggcaaat ctctttatga aagttggact 1440

aaaaaaagtc cttccccaga gttcagtggc atgcccagga taagcaaatt gggatctgga 1500

aatgattttg aggtgttctt ccaacgactt ggaattgctt caggcagagc acggtatact 1560

aaaaattggg aaacaaacaa attcagcggc tatccactgt atcacagtgt ctatgaaaca 1620

tatgagttgg tggaaaagtt ttatgatcca atgtttaaat atcacctcac tgtggcccag 1680

gttcgaggag ggatggtgtt tgagctagcc aattccatag tgctcccttt tgattgtcga 1740

gattatgctg tagttttaag aaagtatgct gacaaaatct acagtatttc tatgaaacat 1800

ccacaggaaa tgaagacata cagtgtatca tttgattcac ttttttctgc agtaaagaat 1860

tttacagaaa ttgcttccaa gttcagtgag agactccagg actttgacaa aagcaaccca 1920

atagtattaa gaatgatgaa tgatcaactc atgtttctgg aaagagcatt tattgatcca 1980

ttagggttac cagacaggcc tttttatagg catgtcatct atgctccaag cagccacaac 2040

aagtatgcag gggagtcatt cccaggaatt tatgatgctc tgtttgatat tgaaagcaaa 2100

gtggaccctt ccaaggcctg gggagaagtg aagagacaga tttatgttgc agccttcaca 2160

gtgcaggcag ctgcagagac tttgagtgaa gtagcctaa 2199

<210> 2

<211> 732

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 2

Met Gly Val Lys Val Leu Phe Ala Leu Ile Cys Ile Ala Val Ala Glu

1 5 10 15

Ala His His His His His His His His Lys Ser Ser Asn Glu Ala Thr

20 25 30

Asn Ile Thr Pro Lys His Asn Met Lys Ala Phe Leu Asp Glu Leu Lys

35 40 45

Ala Glu Asn Ile Lys Lys Phe Leu Tyr Asn Phe Thr Gln Ile Pro His

50 55 60

Leu Ala Gly Thr Glu Gln Asn Phe Gln Leu Ala Lys Gln Ile Gln Ser

65 70 75 80

Gln Trp Lys Glu Phe Gly Leu Asp Ser Val Glu Leu Ala His Tyr Asp

85 90 95

Val Leu Leu Ser Tyr Pro Asn Lys Thr His Pro Asn Tyr Ile Ser Ile

100 105 110

Ile Asn Glu Asp Gly Asn Glu Ile Phe Asn Thr Ser Leu Phe Glu Pro

115 120 125

Pro Pro Pro Gly Tyr Glu Asn Val Ser Asp Ile Val Pro Pro Phe Ser

130 135 140

Ala Phe Ser Pro Gln Gly Met Pro Glu Gly Asp Leu Val Tyr Val Asn

145 150 155 160

Tyr Ala Arg Thr Glu Asp Phe Phe Lys Leu Glu Arg Asp Met Lys Ile

165 170 175

Asn Cys Ser Gly Lys Ile Val Ile Ala Arg Tyr Gly Lys Val Phe Arg

180 185 190

Gly Asn Lys Val Lys Asn Ala Gln Leu Ala Gly Ala Lys Gly Val Ile

195 200 205

Leu Tyr Ser Asp Pro Ala Asp Tyr Phe Ala Pro Gly Val Lys Ser Tyr

210 215 220

Pro Asp Gly Trp Asn Leu Pro Gly Gly Gly Val Gln Arg Gly Asn Ile

225 230 235 240

Leu Asn Leu Asn Gly Ala Gly Asp Pro Leu Thr Pro Gly Tyr Pro Ala

245 250 255

Asn Glu Tyr Ala Tyr Arg Arg Gly Ile Ala Glu Ala Val Gly Leu Pro

260 265 270

Ser Ile Pro Val His Pro Ile Gly Tyr Tyr Asp Ala Gln Lys Leu Leu

275 280 285

Glu Lys Met Gly Gly Ser Ala Pro Pro Asp Ser Ser Trp Arg Gly Ser

290 295 300

Leu Lys Val Pro Tyr Asn Val Gly Pro Gly Phe Thr Gly Asn Phe Ser

305 310 315 320

Thr Gln Lys Val Lys Met His Ile His Ser Thr Asn Glu Val Thr Arg

325 330 335

Ile Tyr Asn Val Ile Gly Thr Leu Arg Gly Ala Val Glu Pro Asp Arg

340 345 350

Tyr Val Ile Leu Gly Gly His Arg Asp Ser Trp Val Phe Gly Gly Ile

355 360 365

Asp Pro Gln Ser Gly Ala Ala Val Val His Glu Ile Val Arg Ser Phe

370 375 380

Gly Thr Leu Lys Lys Glu Gly Trp Arg Pro Arg Arg Thr Ile Leu Phe

385 390 395 400

Ala Ser Trp Asp Ala Glu Glu Phe Gly Leu Leu Gly Ser Thr Glu Trp

405 410 415

Ala Glu Glu Asn Ser Arg Leu Leu Gln Glu Arg Gly Val Ala Tyr Ile

420 425 430

Asn Ala Asp Ser Ser Ile Glu Gly Asn Tyr Thr Leu Arg Val Asp Cys

435 440 445

Thr Pro Leu Met Tyr Ser Leu Val His Asn Leu Thr Lys Glu Leu Lys

450 455 460

Ser Pro Asp Glu Gly Phe Glu Gly Lys Ser Leu Tyr Glu Ser Trp Thr

465 470 475 480

Lys Lys Ser Pro Ser Pro Glu Phe Ser Gly Met Pro Arg Ile Ser Lys

485 490 495

Leu Gly Ser Gly Asn Asp Phe Glu Val Phe Phe Gln Arg Leu Gly Ile

500 505 510

Ala Ser Gly Arg Ala Arg Tyr Thr Lys Asn Trp Glu Thr Asn Lys Phe

515 520 525

Ser Gly Tyr Pro Leu Tyr His Ser Val Tyr Glu Thr Tyr Glu Leu Val

530 535 540

Glu Lys Phe Tyr Asp Pro Met Phe Lys Tyr His Leu Thr Val Ala Gln

545 550 555 560

Val Arg Gly Gly Met Val Phe Glu Leu Ala Asn Ser Ile Val Leu Pro

565 570 575

Phe Asp Cys Arg Asp Tyr Ala Val Val Leu Arg Lys Tyr Ala Asp Lys

580 585 590

Ile Tyr Ser Ile Ser Met Lys His Pro Gln Glu Met Lys Thr Tyr Ser

595 600 605

Val Ser Phe Asp Ser Leu Phe Ser Ala Val Lys Asn Phe Thr Glu Ile

610 615 620

Ala Ser Lys Phe Ser Glu Arg Leu Gln Asp Phe Asp Lys Ser Asn Pro

625 630 635 640

Ile Val Leu Arg Met Met Asn Asp Gln Leu Met Phe Leu Glu Arg Ala

645 650 655

Phe Ile Asp Pro Leu Gly Leu Pro Asp Arg Pro Phe Tyr Arg His Val

660 665 670

Ile Tyr Ala Pro Ser Ser His Asn Lys Tyr Ala Gly Glu Ser Phe Pro

675 680 685

Gly Ile Tyr Asp Ala Leu Phe Asp Ile Glu Ser Lys Val Asp Pro Ser

690 695 700

Lys Ala Trp Gly Glu Val Lys Arg Gln Ile Tyr Val Ala Ala Phe Thr

705 710 715 720

Val Gln Ala Ala Ala Glu Thr Leu Ser Glu Val Ala

725 730

Claims

1.一种提高重组人PSMA蛋白表达的方法，其特征在于：用ExpiCHO-S细胞进行瞬时表达重组人PSMA蛋白；

具体步骤如下所示：

S2.复苏好待转的ExpiCHO-S细胞，并进行放大传代；

S3.完成细胞和质粒的准备后，将其轻柔的充分混合；

S4.电转后进行孵育；

S5.接种培养；

S6.培养1-15天后，进行纯化；

所述S1中质粒的具体制备方法为：选择Uniprot Q04609氨基酸序列Lys44-Ala750，通过信号肽筛选，最终选择Luciferase SP为最终的信号肽，按照Expi 293的优化原则，对核酸序列进行优化，优化后的核酸序列如SEQ ID No.1所示，在序列的5＇端添加EcoR I和Kozak序列GCCGCCACC，在信号肽后加入8*His作为标签，同时在序列3＇端添加终止子和HindIII序列，将核酸序列发送至基因合成公司进行全基因合成，最后通过EcoR I和Hind III连接至pTT5载体上，此时获得PSMA重组质粒。

2.如权利要求1所述的一种提高重组人PSMA蛋白表达的方法，其特征在于：采用流式电转仪电转PSMA质粒至ExpiCHO-S细胞内，培养1-15天收样。

3.如权利要求1所述的一种提高重组人PSMA蛋白表达的方法，其特征在于：所述复苏好待转的ExpiCHO-S细胞，细胞代次必须为复苏三代以后，传代时间在一个月以内；

所述复苏过程需要添加终浓度为4-6mM培养基添加剂；

所述放大传代，每次按照0.5-1*10^6cells/mL进行传代，最大细胞密度不要超过6*10^6cells/mL。

4.如权利要求1所述的一种提高重组人PSMA蛋白表达的方法，其特征在于：所述电转的工作参数如下：

电压设置为150-300V；

脉宽1000-3000μs；

电极次数3-6次；

时间间隔300-600ms；

流速3-6mL/min；

设置为摇摆。

5.如权利要求1所述的一种提高重组人PSMA蛋白表达的方法，其特征在于：所述电转的工作参数如下：

电压设置为200V±50；

脉宽2000μs±100；

电极次数4.5次±0.5；

时间间隔611ms±20；

流速4.71mL/min±1；

设置为摇摆。

6.如权利要求1所述的一种提高重组人PSMA蛋白表达的方法，其特征在于：所述孵育为：37℃培养箱静置孵育10-30min。

7.如权利要求1所述的一种提高重组人PSMA蛋白表达的方法，其特征在于：所述接种培养的具体步骤如下：

S5-2.以活细胞密度为4-6*10^6进行接种培养,于37℃恒温培养摇床中培养16-24h后进行补料，加入补料培养基，并且之后每隔一天需要补糖和补加补料培养基。

8.如权利要求1所述的一种提高重组人PSMA蛋白表达的方法，其特征在于：所述纯化为：采用0.1-0.8um滤器进行过滤，进行后续的纯化。