CN116640231B - 一种重组人源化17型胶原多肽及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组人源化17型胶原多肽及其制备方法。所述胶原多肽rhC17ICD的氨基酸序列由人17型胶原的胞内区（ICD）氨基酸序列组成或包含ICD区氨基酸序列，包括与人17型胶原98%序列同源性，并且同人17型胶原单链全长占比达30.73%。本发明通过大肠杆菌系统实现了人17型胶原ICD区的高效稳定表达，并且通过提供的纯化方法可获得纯度达到90%以上的目的蛋白，克服了对人17型胶原ICD区重组高效表达的局限性和产物稳定性差、易降解等问题。所述胶原多肽富含脯氨酸和赖氨酸，有利于形成三螺旋结构和天然胶原蛋白构象。本发明制备的胶原多肽rhC17ICD具有促细胞集落形成、油脂分泌以及促细胞黏附和迁移等生物学活性。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程领域，具体地说，涉及一种重组人源化17型胶原多肽及其制备方法。
背景技术
胶原（collagen）是机体组织基质和支架的重要组成成分，起着保护并连结各种组织的重要作用。人XVII型胶原（Col17a1）由三条相同的α1链构成的均相三聚体，其中包含有50 kDa的球状胞内结构域（intracellular domain, ICD），一个跨膜域和120 kDa的胞外结构域。研究表明Col17a1是表皮干细胞半桥粒的重要组成成分，是毛囊干细胞以及皮肤干细胞稳态调节的重要成分，对基底膜粘附、皮肤衰老机制及毛囊干细胞维持具有重要作用，是未来抗衰和防脱类护肤品研究的一个有潜力的关注点。
胶原蛋白因其优异的生物学功能、生物相容性和生物可降解等特性，成为生物材料和再生医学等领域广泛使用的蛋白质材料之一。但由于人胶原结构的复杂性和现有研究的局限性，限制了人胶原的生产制备。目前市面上广泛使用的胶原材料主要是来源于动物组织提取获得的各种不同类型胶原，但存在人体吸收利用率低，免疫和病毒感染等生物安全性问题。
重组胶原可避免潜在的提取自异源机体胶原带来的疾病感染风险，同时可通过氨基酸序列优化提高胶原多肽的亲水性、稳定性，优化胶原分子量，提高胶原产品同源性、透皮吸收性和安全性。Col17a1属于跨膜类胶原，蛋白分子量大，结构高度复杂，难以分泌于胞外且容易降解。现有专利主要以Col17a1胞外区序列为主，通过序列选取、串联和氨基酸优化实现重组胶原的异源表达。而相对于胞外区，关于ICD的功能研究则很少。
重组单链结构胶原具有更多的活性结合位点，即便是三螺旋结构的重组胶原蛋白也会比天然人组织胶原结构更为松散，暴露出更多生物活性区域，易于与细胞或其他生物活性分子间发生相互作用，在许多方面可能表现出更强的生物活性。ICD序列具有特异性，可与整合素β4、网蛋白以及BP230相互作用。胞外域包括15个胶原蛋白区域，此区域由 Gly-X-Y 重复序列组成，胞外域主要通过与配体蛋白整合素α6和层粘连蛋白332相互作用。由于胞外域活性位点多且分布广、可溶性强，且易于表达和分泌，成为目前重组人17型胶原研发的主要对象，而鲜有对ICD的重组表达。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术对人17型胶原异源重组表达技术存在的不足，主要是克服重组人17型胶原长序列选取及胞内区即ICD区序列异源高效表达的问题。为此，本发明提供一种重组人源化17型胶原多肽（rhC17ICD）、编码该多肽的核苷酸序列和氨基酸序列、含有编码该多肽的重组表达质粒、工程菌、生产该胶原多肽的方法。基于本发明方法可实现rhC17ICD在大肠杆菌中高效表达，并具有促细胞集落形成、油脂分泌、黏附和迁移活性等生物学活性。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种重组人源化17型胶原多肽，选自：
（1）人17型胶原的胞内区氨基酸，胞内区氨基酸序列如SEQ ID NO.2部分所示；
（2）包含有人17型胶原的胞内区氨基酸的序列；
（3））对SEQ ID NO.2进行氨基酸序列优化，选择序列中脯氨酸含量为5.4%，赖氨酸含量为6.3%，富含(G-X-Y)n的结构，其中G为Gly，X代表Pro，Y代表Lys，n代表多次重复。
本发明的重组人源化17型胶原多肽包含四个串联重复序列（aa 324-428），一个甘氨酸束（aa 447-456）和一个半胱氨酸簇（Cys458, 180）。
作为优选的，在上述的重组人源化17型胶原多肽中，还包括用于蛋白鉴定和纯化的组氨酸标签、硫氧还蛋白标签或类泛素蛋白修饰分子标签。
作为优选的，在上述的重组人源化17型胶原多肽中，所述胶原多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
含有上述重组人源化17型胶原多肽的重组载体，所述重组载体的基础载体为pET28a。
含有上述重组载体的工程菌，所述宿主菌为 BL21（DE3）、Origami（DE3）或BL21Star Plyss（DE3）。
上述重组人源化17型胶原多肽的制备方法，包括以下步骤：
（1）人源化17型胶原多肽氨基酸序列参照SEQ ID NO.1进行选取，选择其1-460氨基酸；
（2）根据大肠杆菌密码子偏好对编码该人源化17型胶原多肽的DNA序列进行优化并基因合成；
（3）将步骤（2）合成的基因序列连入限制性内切酶酶切后的pET28a线性化载体，构建重组表达质粒pET28a-rhC17ICD；
（4）将步骤（3）构建的重组质粒pET28a-rhC17ICD导入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，进一步提取重组质粒pET28a-rhC17ICD多克隆拷贝；
（5）通过步骤（4）获得重组质粒多克隆拷贝并导入大肠杆菌BL21感受态细胞，构建能表达和生产重组人源化17型胶原多肽的工程菌；
（6）对步骤（5）构建的工程菌进行诱导表达；然后利用Ni 柱亲和层析（NiSepharose 6 Fast Flow ）和分子筛(Sephadex G-25)联用分离纯化目的蛋白；
（7）纯化后的人源化17型胶原多肽经微孔滤膜过滤。
本发明的重组人源化17型胶原多肽同人17型胶原单链全长占比高达30.73%，与人17型胶原氨基酸序列相应部分的同源率达98%以上。根据本发明方法制备的重组人源化17型胶原多肽富含(G-X-Y)n结构，其中G为Gly，X代表Pro，Y代表Lys，n代表多次重复。换言之，本发明方法制备的重组人源化17型胶原多肽具有天然人胶原蛋白构象和活性。
利用本发明方法制备的重组人源化17型胶原多肽该胶原多肽具有促干细胞集落形成、皮脂腺细胞油脂分泌以及促角质细胞迁移和黏附的生物学活性。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
（1）现有对人17型胶原的重组表达技术主要为对包外域结构的可溶性部分进行短片段的选取或加以重复串联或氨基酸优化，序列占比低，同源性差。本发明中所述rhC17ICD多肽序列基于对人Col17a1结构分析，序列覆盖率达30.73%，同源率达98%以上，并富含赖氨酸和脯氨酸，促进目的多肽形成螺旋结构而发挥生物学功能。
（2）本发明所述rhC17ICD多肽，选择pET28a为载体质粒，优先以BL21（DE3）为载体工程菌，目的蛋白表达后，其背景蛋白种类和含量显著减少。此外，在其C端加入小分子六聚组氨酸标签，可方便目的蛋白的表达鉴定和纯化，且不影响目的蛋白生物活性。通过本发明提供的纯化方法可获得纯度在90%以上的目的蛋白。
（3）Col17a1相对于其他胶原蛋白其胞内域分子量高达50 kDa，且精氨酸高度极化分布，导致该结构域难表达、稳定性差、易降解。本发明提供的表达方法可对其高效表达，降解或截短产物显著减少，并纯化得到稳定的目的蛋白。
（4）采用背景简单的大肠杆菌表达系统，一轮发酵用时仅需数小时，目的蛋白表达水平高，适于大规模发酵生产，成本可控。
（5）本发明重组人源化17型胶原多肽具有较优的促干细胞集落形成、油脂分泌、黏附和迁移等生物学活性，具备产品实用性，可开发为一种新的功能性生物原料。
附图说明
图1为重组表达质粒图谱示意图；
图2为目的蛋白表达的SDS-PAGE检测结果，表观分子量约为50 kDa；
图3为目的蛋白可溶性分析的SDS-PAGE检测结果；
图4为目的蛋白诱导表达温度和诱导剂浓度筛选的SDS-PAGE检测结果；
图5为目的蛋白纯化产物的SDS-PAGE检测结果；
图6为目的蛋白纯化产物的Western Blot检测结果；
图7为重组人胶原多肽的细胞黏附活性检测结果；
图8为重组人胶原多肽的细胞迁移活性检测结果；
图9为重组人胶原多肽的促油脂分泌相关基因表达水平检测结果；
图10为重组人胶原多肽的促细胞集落形成检测结果。
具体实施方式
本发明中，所述Col17a1具体氨基酸序列参考：NCBI参照序列Q9UMD9.3 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/Q9UMD9.3)，具体如SEQ ID NO.1所示。其单链全长1497个氨基酸，包括胞内域（1-467）、跨膜区（468-489）和胞外域（490-1497）。编码SEQ ID NO.1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
针对背景技术所示的对Col17a1重组表达的研究现状，本发明提供了一种重组人源化17型胶原多肽rhC17ICD。所述胶原多肽，由ICD的氨基酸序列组成或包含其氨基酸序列，其中Col17a1单链氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；ICD氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。在本发明中，为实现所述重组胶原多肽与Col17a1的高度覆盖比，优选地，选择1-460连续长片段氨基酸序列。本领域技术人员通过对SEQ ID NO.2序列进行氨基酸取代、添加、敲除实现本发明的效果具有限制性。
下文提供具体的实施例来进一步阐述本发明。
实施例1. 重组人源化17型胶原多肽rhC17ICD的构建与表达
(1) 重组人胶原多肽序列优化：对rhC17ICD的DNA序列进行修饰，并在C端添加六聚组氨酸标签，便于进行免疫学抗体检测与特异性亲和层析纯化。优化后的rhC17ICD共包含466个氨基酸，其序列如SEQ ID NO.4所示。针对大肠杆菌表达系统密码子偏好，对编码SEQ ID NO.4的DNA序列进行密码子优化，优化后的rhC17ICD的DNA序列如SEQ ID NO.5所示。
（2） 基因合成与重组表达质粒的构建：委托上海捷瑞生物工程有限公司合成INTRA基因序列，以pET-28a为载体质粒，选择BamH I和Hind III酶切位点，将基因合成序列通过T4 DNA连接酶（TaKaRa公司，货号2011A）连入pET-28a载体（方法参照产品说明书），将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞（购自北京擎科生物技术有限公司）。在含有卡纳霉素（50 μg/mL）的LB抗性平板筛选阳性克隆菌并进行菌落PCR扩增和测序验证（深圳华大基因科技有限公司）。
（3）重组工程菌的制备与表达：将验证后的重组载体质粒转化到BL21(DE3)感受态细胞（购自北京擎科生物科技股份有限公司），在含有卡纳霉素（50 μg/mL）的LB抗性平板筛选阳性克隆菌并进行菌落PCR验证，继而进行试管表达鉴定。具体操作为：挑取阳性菌落接种到含5 mL LB（50 μg/mL卡纳霉素）培养基中，37 ℃培养至培养12-16 h。按照1：100比例转接于5 mL新鲜的含LB培养基中，37 ℃，220 rpm培养至OD600值为0.7-0.8，加入终浓度为1mM IPTG，于37℃，220 rpm诱导培养3.5 h。取样未诱导菌液和诱导菌液各0.5 mL，离心收集菌体，将菌体重悬于裂解缓冲液，加入上样缓冲液沸水浴加热10 min，取10 μL进行 SDS-PAGE表达鉴定。
目的蛋白的可溶性分析操作为：取样诱导后菌液4mL离心收集菌体，将菌体重悬于0.2 M PBS（pH7.4）中，采用超声破碎仪破碎细胞，离心分离上清和沉淀并通过SDS-PAGE检测可溶性。
诱导表达鉴定结果如图2所示，目的蛋白在诱导后成功表达，其表观分子量为50kDa，可溶性分析结果如图3所示，目的蛋白主要表达在沉淀中，说明目的蛋白为包涵体形式。
实施例2. 表达条件优化
甘油菌按千分之一比例接种于5 mL LB（50 μg/mL卡纳霉素）培养基中，37 ℃ 200rpm过夜培养后按千分之五转接至5 mL LB-Amp培养基中，37 ℃ 220 rpm培养至OD600为0.7-0.8时，加入终浓度0.2 mM、0.4 mM、0.8 mM IPTG进行诱导表达。20℃、30℃和37℃，200rpm分别诱导18 h、6 h和3h，收菌体进行SDS-PAGE电泳，结果如图4所示，目的蛋白在37 ℃诱导条件下表达水平最高。
实施例3. rhC17ICD多肽的纯化
将重组工程菌接种于50 mL LB（50 μg/mL卡纳霉素）培养基中，37 ℃培养约16 h，按照1%转接至3 L新的LB培养基（50 μg/mL卡纳霉素）中培养至OD600达到0.8~1.0，加入终浓度为1.0 mM的IPTG继续诱导培养3.5 h，4 ℃，5000 rpm离心10 min，收集菌体。
因重组胶原多肽含有His标签，故本发明表达出的重组融合蛋白可利用Ni 柱亲和层析（Ni Sepharose 6 Fast Flow ）和分子筛(Sephadex G-25)联用分离纯化。为降低或消除ICD的自降解或截短次级产物含量，提高目的蛋白纯度，纯化试剂含有蛋白保护剂。优选的，蛋白保护剂可以为含0.5% - 1%的精氨酸或5% - 10%的海藻糖。具体操作为：将菌体重悬于含8 M脲的变性液（pH7.4）中，利用均质机破碎细胞，4 ℃，18000 rpm离心20 min，收集上清。使用变性液预平衡Ni层析柱2-3个柱体积，上清液过Ni柱后继续用变性液流穿除杂，
使用含4 M脲的复性液（pH7.4）进行充分复性，30-100 mM咪唑梯度洗杂液（pH7.4）洗除杂蛋白，150-300 mM咪唑（pH7.4）洗脱目的蛋白。洗脱样品经G25分子筛脱盐。纯化产物通过SDS-PAGE和Western Blot进行检测，采用BCA蛋白定量试剂盒（购自赛默飞世尔科技有限公司）测定纯化产物浓度。
纯化结果如图5所示，泳道1和2分别为均质上清和沉淀，泳道3为流穿液，泳道4为洗杂液，泳道5-7为目的蛋白洗脱液。Western Blot结果如图6所示，免疫印迹条带单一，且大小与SDS-PAGE中表观分子量大小一致。说明本发明提供的纯化方法可有效避免，通过本纯化方法可得到高纯度的重组人源化胶原多肽。
实施例4. rhC17ICD多肽的细胞黏附活性
使用DMEM培养基（GIBCO，货号12800017）稀释重组人源化胶原多肽至250 ng/mL浓度。向24孔板中分别加入400 μL 不同处理样品，空白对照为DMEM培养基，阳性对照为EGF，置于4 ℃条件下包被过夜；次日每孔加入4x104个生长状态良好的Hacat细胞，置于37 ℃、5％CO2培养箱培养正常培养3 h；4%多聚甲醛固定细胞20 min，加入1%结晶紫染色20 min，使用PBS清洗细胞，通过显微镜进行检测分析。
相同视野范围内细胞贴壁数量越多说明蛋白黏附活性越高。结果如图7所示，本发明所获得的重组人源化胶原多肽可刺激角质细胞显著的加速粘附基质，表明其具有较好的细胞粘附活性。
实施例5. rhC17ICD多肽的细胞迁移活性
将生长状态良好的Hacat细胞按2x104个/孔加入6孔板中，置于37 ℃、5％CO2培养箱培养至细胞铺满底部。取200 μL枪头进行划痕，使用PBS清洗漂浮细胞。使用DMEM培养基（GIBCO，货号12800017）稀释重组人源化胶原多肽至250 ng/mL。每孔加入2 mL不同样品，空白对照为DMEM培养基，阳性对照为EGF标准品。置于37 ℃、5％CO2培养箱继续培养，分别于0h、24 h、48 h取样观察记录。
体外细胞迁移实验在一定程度上模拟了体内细胞迁移的过程，直接反映了细胞与胞外基质及基质影响下细胞之间的相互作用。细胞迁移活性是更有效表征胶原蛋白生物学活性的指标，迁移速度越快说明胶原蛋白的生物学活性越佳。结果如图8所示，本发明所获得的人源化胶原多肽具有较好的促细胞迁移活性。
实施例6. rhC17ICD多肽对SZ95细胞油脂分泌的影响
将生长状态良好的人永生化皮脂腺细胞SZ95细胞接入12孔板中，置于37 ℃、5％CO2培养箱培养24h。使用Sebomed培养基（Merck）稀释重组人胶原多肽至250 ng/mL，空白对照为Sebomed培养基。给药48h后，使用离心柱法抽提总RNA检测浓度和纯度后使用 PrimeScript RT Master Mix（日本TaKaRA公司）cDNA，使用PowerUP SYBR Green Master（美国ABI公司）通过实时荧光定量 PCR系统检测油脂分泌相关基因（fasn、scd1和srebp1）表达水平，mRNA相对表达量采用２-ΔΔCt表示，以 GAPDH作为内参基因。结果如图9 所示，相对于空白对照组，rhFEB刺激后的SZ95细胞中油脂分泌相关基因fasn和scd1的转录水平明显升高，表明rhFEB调控细胞油脂分泌。
实施例7. rhC17ICD多肽对rADSCs细胞形成集落的影响
将生长状态良好的rADSCs细胞以1×103个/孔的密度铺6孔板或6 cm塑料培养皿,分组：空白对照组、阳性对照组（EGF-20 ng/mL）、rhC17ICD（250 ng/mL），每组设3个平行，每3天换液，拍照记录细胞形态变化。当肉眼可见集落形成时，取出6孔板，弃除培养液，每孔加入1mL 4%多聚甲醛固定10-20 min，PBS清洗2-3次，每孔加入500 µL 过滤的0.1%结晶紫染色10 min，然后清洗掉结晶紫，数码相机拍照，显微镜下计数集落，比较实验组与对照组的集落形成单位。
Claims (4)
1.一种重组人源化17型胶原多肽，其特征在于所述胶原多肽的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。
2.含有权利要求1所述的重组人源化17型胶原多肽的重组载体，其特征在于，所述重组载体的基础载体为pET28a。
3.含有权利要求2所述重组载体的工程菌，其特征在于宿主菌为 BL21-DE3、Origami-DE3或BL21 Star Plyss-DE3。
4.权利要求1所述重组人源化17型胶原多肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）人源化17型胶原多肽氨基酸序列参照SEQ ID NO.1进行选取，选择其1-460氨基酸；
（2）根据大肠杆菌密码子偏好对编码该人源化17型胶原多肽的DNA序列进行优化并基因合成；
（3）将步骤（2）合成的基因序列连入限制性内切酶酶切后的pET28a线性化载体，构建重组表达质粒pET28a-rhC17ICD；
（4）将步骤（3）构建的重组质粒pET28a-rhC17ICD导入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，进一步提取重组质粒pET28a-rhC17ICD多克隆拷贝；
（5）通过步骤（4）获得重组质粒多克隆拷贝并导入大肠杆菌BL21感受态细胞，构建能表达和生产重组人源化17型胶原多肽的工程菌；
（6）对步骤（5）构建的工程菌进行诱导表达；然后利用Ni 柱亲和层析和分子筛联用分离纯化目的蛋白；
（7）纯化后的人源化17型胶原多肽经微孔滤膜过滤。
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