CN106554410A - 一种重组人源胶原蛋白及其编码基因和制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种重组人源胶原蛋白。还提供制备所述的重组人胶原蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：(1)制备质粒：人工全基因合成序列表中的SEQ ID No:3的序列，然后对pPIC9K载体及人工全基因合成的SEQ ID No:3的人源胶原蛋白进行Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切，后提取质粒；(2)转化：将步骤(1)制备的质粒与毕赤酵母进行混合进行转化，获得转化后菌落；(3)多拷贝插入重组子的筛选；(4)发酵获得发酵液；(5)纯化得到产品。本发明还提供编码重组人源胶原蛋白的基因序列。本发明人源胶原蛋白，生物相容性良好，纯度在95％以上。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种基因重组人源胶原蛋白及其编码基因，本发明还涉及所述重组人源胶原蛋白的制备方法。
背景技术
胶原蛋白(collagen)是体内含量最多的一种蛋白质，约占蛋白质总量的25％-33％，广泛地存在于人体的骨、腱、软骨和皮肤及其它结缔组织中，是细胞外基质(ECM)的主要成分，其对维护细胞、组织、器官的正常生理功能和损伤修复有重要作用。在分子结构上，胶原蛋白是由平行线型链组成，每一线型链由三条扭曲左旋的α-肽链通过链间相互作用紧密结合而形成的一极强的右旋三重螺旋结构。每条α-肽链由多达300个以上的Gly-X-Y三联体重复构成,两端连接具有不同结构的其它小片段。组成胶原蛋白的氨基酸残基均为α-氨基酸,其中X、Y是Gly之外的任何氨基酸残基。
胶原蛋白作为天然的生物资源，具有合成高分子材料无法比拟的生物相容性和生物可降解性，可广泛应用于医药、保健品和化妆品行业中。在现有技术中，生产胶原蛋白传统的也是最主要的方法是利用酸、碱法处理动物来源的组织(猪皮、牛皮、驴皮、鱼等)，从中提取胶原蛋白；另外，还有酶法提取胶原蛋白；虽然这些方法具有较高的回收率，但是这些方法制取的胶原蛋白均为长度不等的混合胶原蛋白肽段，各肽段水溶性不一，难以分离到单独的肽段纯品，同时由于均为异源性胶原蛋白，在临床上表达出排异反应，使其作为生物医学材料或药物载体等方面的应用受到了很大限制。
随着现代生物技术的发展，利用转基因技术和基因重组技术，可以在动物、植物和微生物表达体系获得重组人胶原蛋白，解决了传统提取方法存在的病毒隐患等缺点，同时也改善了胶原蛋白的亲水性、免疫排异性等。国内外一些研究机构及生物公司相继投入研究开发重组胶原蛋白，杨霞等在2012年通过重复III型胶原肽段并与II型胶原肽段融合在大肠杆菌中获得高表达；我国西北大学的范代娣等利用大肠杆菌通过高密度发酵培养生产类人胶原蛋白，得到高表达的类人胶原，并以此为原材料开发组织工程材料和化妆品，但其设计的部分氨基酸序列并非人源胶原蛋白序列，同时，细菌表达产生的致热源使表达产物难以应用于临床，而且目的蛋白常以包涵体形式表达，致使产物纯化困难，另外原核表达系统的翻译后修饰加工体系不完善，表达产物的生物活性较低等缺点影响产品的品质。因此，在制备人源胶原蛋白的技术领域，亟需开发一种纯度高、安全性高、亲水性强、生物相容性好的人源胶原蛋白，并且可以实现不在细菌上进行表达的方法。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供一种基因重组的人源胶原蛋白及其编码基因。
本发明针对现有技术中的如下缺陷提出的解决技术方案：现有技术中胶原蛋白在临床上易出现排异反应，原因是其结构上均为异源性胶原蛋白，为长度不等的混合胶原蛋白肽段，各肽段水溶性不一，难以分离到单独的肽段纯品，最终使其在临床上的应用受到严重的限制。
具体来说，本发明所要解决的一个技术问题在于提供一种水溶性好、表达量高，纯度高的基因重组人源胶原蛋白。
本发明所要解决的另一个技术问题在于提供一种快速、简便的基因重组人源胶原蛋白的制备方法。
本发明所要解决的一个技术问题在于提供一种编码所述重组人源胶原蛋白的基因。
更具体来说，本发明通过如下技术方案解决上述技术问题的。
一种重组人源胶原蛋白，其中所述蛋白包含下列家族成员中的一种或几种：
1)具有序列表中SEQ ID No:1氨基酸残基序列的蛋白质；
2)与SEQ ID No:1氨基酸残基序列同源性在90％以上且具有与SEQ ID No:1相同活性的SEQ ID No:1衍生的蛋白质；
3)在SEQ ID No:1氨基酸残基序列的N-端增加或删除15个以内氨基酸残基得到的具有与SEQ ID No:1相同活性的SEQ ID No:1衍生的蛋白质；
4)在SEQ ID No:1氨基酸残基序列的C-端增加或删除15个以内氨基酸残基得到的具有与SEQ ID No:1相同活性的SEQ ID No:1衍生的蛋白质；
5)将SEQ ID No:1氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID No:1相同活性的SEQ ID No:1衍生的蛋白质。
其中，所述蛋白为序列表中的SEQ ID No:1。
其中，所述蛋白的等电点为9.5。
其中，用于表达所述蛋白的宿主细胞为毕赤酵母Pichia.Pastoris。
一种制备所述的重组人胶原蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)制备质粒：人工全基因合成序列表中的SEQ ID No:3的序列，然后对pPIC9K载体及人工全基因合成的SEQ ID No:3的人源胶原蛋白进行XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接，并转化大肠杆菌，提取质粒；
(2)转化：将步骤(1)制备的质粒与毕赤酵母进行混合进行转化，获得转化后菌落；
(3)多拷贝插入重组子的筛选：将步骤(2)转化后的菌落进行进一步培养，筛选转化子；
(4)发酵：将步骤(3)筛选的转化子接种后进行发酵培养获得发酵液；
(5)纯化：将步骤(4)得到的发酵液依次进行固液分离、过滤、浓缩和离子交换层析得到产品。
其中，所述步骤(5)的纯化的具体步骤为：将步骤(4)得到的发酵液经离心进行固液分离，取上清液，对发酵上清液用孔径为0.22μm中空纤维微滤系统进行微滤，收集滤液，再用截留分子量为10KD的中空纤维超滤系统进行超滤脱盐浓缩，收集浓缩液，然后用CMSepharose FF进行离子交换层析，即可得到产品。
其中，所述方法包括如下步骤：
(1)制备质粒
人工全基因合成序列表中的SEQ ID No:3的序列，然后对pPIC9K载体及人工全基因合成的SEQ ID No:3的序列人源胶原蛋白进行XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接，并转化大肠杆菌，提取质粒，命名为pPIC9K-NCOL；
(2)毕赤酵母电转化
将经SalⅠ内切酶线性化的pPIC9K-NCOL质粒，与毕赤酵母感受态细胞混匀，转至冰预冷的电转化杯中，电击4～10毫秒，加入冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，涂布MD培养基平板，倒置培养2～3天，在MD培养基平板上长出菌落；
(3)多拷贝插入重组子的筛选
将MD培养基平板上长出的菌落用无菌牙签对应接种到G418浓度分别为0.5g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L的YPD平板上培养，筛选获得转化子；
(4)基因重组人源胶原蛋白的发酵
将筛选到的转化子接种于BMGY培养基中，振荡培养24小时，作为一级种子转接于装有FBS培养基的发酵罐中，pH值为5.0培养16～20小时，作为二级种子转接入装有FBS培养基的大罐发酵，生长温度30℃，诱导温度低于生长温度，pH值为5.0，溶氧控制在20％～30％，诱导发酵36～42小时；
(5)基因重组人源胶原蛋白的纯化
将步骤(4)发酵液经离心进行固液分离，取上清液，对发酵上清液用孔径为0.1μm或0.22μm中空纤维微滤系统进行微滤，收集滤过液，再用截留分子量为10KD的中空纤维超滤系统进行超滤脱盐浓缩，收集浓缩液，然后用CM Sepharose FF进行离子交换层析，获得纯度为95％以上的基因重组人源胶原蛋白。
一种编码重组人源胶原蛋白的基因，其是下列核苷酸序列中的一种：
1)序列表中的SEQ ID No:2；
2)编码序列表中SEQ ID No:1蛋白质序列的多核苷酸；
3)与序列表中的SEQ ID No:2限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
4)编码由SEQ ID No:1衍生的蛋白质的DNA序列，所述由SEQ ID No:1衍生的蛋白质为在SEQ ID No:1氨基酸残基序列的N-端增加或删除15个以内氨基酸残基得到的具有与SEQ ID No:1相同活性的多肽；
5)编码由SEQ ID No:1衍生的蛋白质的DNA序列，所述由SEQ ID No:1衍生的蛋白质为在SEQ ID No:1氨基酸残基序列的C-端增加或删除15个以内氨基酸残基得到的具有与SEQ ID No:1相同活性的多肽；
6)编码由SEQ ID No:1衍生的蛋白质的DNA序列，所述由SEQ ID No:1衍生的蛋白质为将SEQ ID No:1氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID No:1相同活性的多肽。
其中，所述基因为序列表中的SEQ ID No:2。
一种含有所述基因的表达载体。
一种含有所述基因的细胞系。
一种用于组织工程、美容护肤的生物材料，其特征在于，所述生物材料包含所述人源胶原蛋白，所述基因编码的重组人源胶原蛋白。
本发明还提供所述重组人源胶原蛋白，所述制备方法制备得到的重组人源胶原蛋白，所述基因编码的重组人源胶原蛋白，其纯度为95％以上。
本发明的有益技术效果：
本发明获得的人源胶原蛋白，具有表达量高，水溶性好、纯度高的特性，为基因重组人源胶原蛋白应用奠定了基础。
本发明优选人胶原蛋白中亲水性的Gly-X-Y进行排列组合，具有与人胶原蛋白相同的Gly-X-Y序列，生物相容性良好，纯度在95％以上。
附图说明
图1是实施例1中重组表达载体pPIC9K-NCOL的质粒图谱。
图2是实施例1中基因重组人源胶原蛋白发酵上清液和纯化后样品
SDS-PAGE电泳图。
图3是实施例1中细胞增殖曲线图。
图4是实施例1中各组材料对细胞形态的影响图。
具体实施方式
为了充分说明本发明解决技术问题所实施使用的技术方案。下面结合实施例和附图对发明做详细说明,但本发明的技术方案、技术方案的实施方式以及保护范围并不仅仅限于此。
本发明提供一种重组的人源胶原蛋白，所述蛋白以人I型胶原蛋白Gly-X-Y重复序列作为最小重复单位组成的蛋白质，所述X,Y分别为氨基酸。人胶原蛋白结构是以Gly-X-Y重复序列作为最小重复单位，本发明根据人胶原蛋白的这一结构，优选人胶原蛋白中亲水性的Gly-X-Y进行排列组合。
在一种具体实施方式中，所述Gly-X-Y是亲水性的氨基酸链；所述蛋白包含下列家族成员中的一种或几种：
1)具有序列表中SEQ ID No:1氨基酸残基序列的蛋白质；
2)与SEQ ID No:1氨基酸残基序列同源性在90％以上且具有与SEQ ID No:1相同活性的SEQ ID No:1衍生的蛋白质；
3)在SEQ ID No:1氨基酸残基序列的N-端增加或删除15个以内氨基酸残基得到的具有与SEQ ID No:1相同活性的SEQ ID No:1衍生的蛋白质；
4)在SEQ ID No:1氨基酸残基序列的C-端增加或删除15个以内氨基酸残基得到的具有与SEQ ID No:1相同活性的SEQ ID No:1衍生的蛋白质；
5)将SEQ ID No:1氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID No:1相同活性的SEQ ID No:1衍生的蛋白质。
本领域技术人员可以知道在本发明所述的蛋白的基本结构的基础上适当增加或减少一定数量的氨基酸序列，得到的蛋白应当具有所述蛋白的活性，这些技术方案也是本发明所保护的范围；本发明将其定义为15个，一般少于15个氨基酸的序列很难能够形成具有特定活性的蛋白；即，凡是利用本发明技术构思通过亲水性Gly-X-Y重复序列作为最小重复单位得到的胶原蛋白都是本发明保护的范围。
在一种具体实施方式中，所述蛋白为序列表中的SEQ ID No:1；所述蛋白的等电点为9.5，以利于后期纯化；用于表达所述蛋白的宿主细胞为毕赤酵母Pichia.Pastoris。
在一种具体实施方式中，本发明还提供一种制备所述的重组人胶原蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)制备质粒：人工全基因合成序列表中的SEQ ID No:3的序列，然后对pPIC9K载体及人工全基因合成的SEQ ID No:3的人源胶原蛋白进行XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接，并转化大肠杆菌，提取质粒；
在步骤(1)中，所述人工全基因合成序列表中的SEQ ID No:3的序列是根据设计的基因重组人源胶原蛋白氨基酸序列，按照毕赤酵母密码子偏好性，设计并人工全基因合成人源胶原蛋白核苷酸序列，同时在5’端添加XhoⅠ内切酶切割位点CTCGAG和毕赤酵母信号肽切割位点序列AAAAGA，3’端添加EcoRⅠ内切酶切割位点GAATTC。
(2)转化：将步骤(1)制备的质粒与毕赤酵母进行混合进行转化，获得转化后菌落；
(3)多拷贝插入重组子的筛选：将步骤(2)转化后的菌落进行进一步培养，筛选转化子；
(4)发酵：将步骤(3)筛选的转化子接种后进行发酵培养获得发酵液；以及
(5)纯化：将步骤(4)得到的发酵液依次进行固液分离、过滤、浓缩和离子交换层析得到产品。
在一种优选的具体实施方式中，所述步骤(5)的纯化的具体步骤为：将步骤(4)得到的发酵液经离心进行固液分离，取上清液，对发酵上清液用孔径为0.22μm中空纤维微滤系统进行微滤，收集滤液，再用截留分子量为10KD的中空纤维超滤系统进行超滤脱盐浓缩，收集浓缩液，然后用CM Sepharose FF进行离子交换层析，即可得到产品。
在一种优选的具体实施方式中，所述方法包括如下步骤：
(1)制备质粒
人工全基因合成序列表中的SEQ ID No:3的序列，然后对pPIC9K载体及人工全基因合成的SEQ ID No:3的序列人源胶原蛋白进行XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接，并转化大肠杆菌，提取质粒，命名为pPIC9K-NCOL；
(2)毕赤酵母电转化
将经SalⅠ内切酶线性化的pPIC9K-NCOL质粒，与毕赤酵母感受态细胞混匀，转至冰预冷的电转化杯中，电击4～10毫秒，加入冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，涂布MD培养基平板，倒置培养2～3天，在MD培养基平板上长出菌落；
(3)多拷贝插入重组子的筛选
将MD培养基平板上长出的菌落用无菌牙签对应接种到G418浓度分别为0.5g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L的YPD平板上培养，筛选获得转化子；
(4)基因重组人源胶原蛋白的发酵
将筛选到的转化子接种于BMGY培养基中，振荡培养24小时，作为一级种子转接于装有FBS培养基的发酵罐中，pH值为5.0培养16～20小时，作为二级种子转接入装有FBS培养基的大罐发酵，生长温度30℃，诱导温度低于生长温度，pH值为5.0，溶氧控制在20％～30％，诱导发酵36～42小时；
(5)基因重组人源胶原蛋白的纯化
将步骤(4)发酵液经离心进行固液分离，取上清液，对发酵上清液用孔径为0.1μm或0.22μm中空纤维微滤系统进行微滤，收集滤过液，再用截留分子量为10KD的中空纤维超滤系统进行超滤脱盐浓缩，收集浓缩液，然后用CM Sepharose FF进行离子交换层析，获得纯度为95％以上的基因重组人源胶原蛋白。
在一种具体实施方式中，本发明还提供一种编码重组人源胶原蛋白的基因，其特征在于，其是下列核苷酸序列中的一种：
1)序列表中的SEQ ID No:2；
2)编码序列表中SEQ ID No:1蛋白质序列的多核苷酸；
3)与序列表中的SEQ ID No:2限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
4)编码由SEQ ID No:1衍生的蛋白质的DNA序列，所述由SEQ ID No:1衍生的蛋白质为在SEQ ID No:1氨基酸残基序列的N-端增加或删除15个以内氨基酸残基得到的具有与SEQ ID No:1相同活性的多肽；
5)编码由SEQ ID No:1衍生的蛋白质的DNA序列，所述由SEQ ID No:1衍生的蛋白质为在SEQ ID No:1氨基酸残基序列的C-端增加或删除15个以内氨基酸残基得到的具有与SEQ ID No:1相同活性的多肽；
6)编码由SEQ ID No:1衍生的蛋白质的DNA序列，所述由SEQ ID No:1衍生的蛋白质为将SEQ ID No:1氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID No:1相同活性的多肽。
对于上述编码蛋白的基因，同样地，能够编码具有所述蛋白类似序列并具有类似活性都是本发明的保护范围。
在一种优选的实施方式中，所述基因为序列表中的SEQ ID No:2。
在一种具体实施方式中，含有所述基因的表达载体；含有基因的细胞系。
在一种具体实施方式中，本发明通过如下具体方案实现的。
根据人I型胶原蛋白Gly-X-Y重复序列作为最小重复单位，优选亲水性的Gly-X-Y进行排列组合，同时，为了后期便于纯化，调节碱性氨基酸的比例，设计等电点约为9.5，蛋白包含399氨基酸，序列如下，见序列表SEQ ID No:1：
本发明分析上述设计的氨基酸序列，根据毕赤酵母密码子偏好性，设计对应的核苷酸序列，序列如下，见序列表SEQ ID No:2：
上述基因重组人源胶原蛋白的制备方法包括下述步骤：
1、基因重组人源胶原蛋白表达载体的构建
根据设计的基因重组人源胶原蛋白氨基酸序列，按照毕赤酵母密码子偏好性，设计并人工全基因合成人源胶原蛋白核苷酸序列，同时在5’端添加XhoⅠ内切酶切割位点CTCGAG和毕赤酵母信号肽切割位点序列AAAAGA，3’端添加EcoRⅠ内切酶切割位点GAATTC，设计序列由上海生工生物工程股份有限公司合成，命名为NCOL，序列如下，详见序列表中SEQID No:3：
对pPIC9K及人工全基因合成的人源胶原蛋白进行XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接，并转化大肠杆菌，提取质粒，命名为pPIC9K-NCOL。
2、毕赤酵母电转化
将10μg经SalⅠ内切酶线性化的pPIC9K-NCOL质粒，与80μL毕赤酵母感受态细胞混匀，转至0.2cm冰预冷的电转化杯中，电击4～10毫秒，加入1mL冰预冷的1mol/L的山梨醇溶液将菌体混匀，涂布MD培养基平板，30℃倒置培养2～3天，在MD培养基平板上长出菌落；
3、多拷贝插入重组子的筛选
将MD培养基平板上长出的菌落用无菌牙签对应接种到G418浓度分别为0.5g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L的YPD平板上，30℃培养，筛选获得转化子；
4、基因重组人源胶原蛋白的发酵
将筛选到的转化子接种于400ml BMGY培养基中，30℃振荡培养24小时，作为一级种子转接于装有4L FBS培养基的5L发酵罐中，温度设定为30℃，pH值为5.0，培养16～20小时，作为二级种子转接入装有FBS培养基的150L大罐发酵，生长温度30℃，诱导温度29℃，pH值为5.0，溶氧控制在20％～30％，诱导发酵36～42小时，发酵表达量达10g/L以上；
5、基因重组人源胶原蛋白的纯化
发酵液经离心进行固液分离，取上清液，对发酵上清液用孔径为0.1μm或0.22μm中空纤维微滤系统进行微滤，收集滤过液，再用截留分子量为10KD的中空纤维超滤系统进行超滤脱盐浓缩，收集浓缩液，然后用CM Sepharose FF进行离子交换层析，获得纯度为95％以上的基因重组人源胶原蛋白。
在本发明基因重组人源胶原蛋白的纯化步骤5中，发酵液经离心进行固液分离，取上清液，对发酵上清液用孔径为0.22μm中空纤维微滤系统进行微滤，收集滤过液，再用截留分子量为10KD的中空纤维超滤系统进行超滤脱盐浓缩，收集浓缩液，然后用CM SepharoseFF进行离子交换层析，即可获得纯度为95％以上的基因重组人源胶原蛋白。
本发明获得的人源胶原蛋白，具有表达量高，水溶性好、纯度高的特性，为基因重组人源胶原蛋白应用奠定了基础。
实施例
下面对本发明实施例中的测定方法以及材料来源进行说明。
pPIC9K购于Invitrogen公司
XhoⅠ和EcoRⅠ购于Thermo Fisher公司
实施例1
1、基因重组人源胶原蛋白表达载体的构建
1.1基因获得
根据设计的基因重组人源胶原蛋白氨基酸序列，按照毕赤酵母密码子偏好性，设计并人工全基因合成人源胶原蛋白核苷酸序列，同时在5’端添加XhoⅠ内切酶切割位点CTCGAG和毕赤酵母信号肽切割位点序列AAAAGA，3’端添加EcoRⅠ内切酶切割位点GAATTC，设计序列由上海生工生物工程股份有限公司合成，命名为NCOL，序列见序列表SEQ ID No:3：
1.2载体pPIC9K和NCOL双酶切
对pPIC9K及人工全基因合成的人源胶原蛋白进行XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切，pPIC9K购置于Invitrogen公司。双酶切体系如下：
上述试剂加好后，混匀，37℃水浴消化2小时，用DNA纯化试剂盒，按产品说明书，从质量百分浓度为1.5％琼脂糖凝胶上回收特异性条带。
1.3载体pPIC9K与NCOL的连接
用T4DNA连接酶对上述酶切回收的pPIC9K与NCOL连接，反应体系如下：
上述连接体系充分混匀后，于16℃连接12小时。
1.4连接产物的转化
取冷冻的DH5α感受态细胞一管100μL，放于冰上解冻，加入上述连接产物，手指轻弹使其混合，在冰中放置30分钟，42℃水浴热激90秒，快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2～3分钟，加入800μL无抗生素的LB液体培养基，混匀，37℃温育50分钟，吸取100-200μL菌液，涂于含有卡那霉素(50μg/mL)的固体LB平板上，将固体LB平板倒置于37℃培养箱中，培养12～18小时，挑选单菌落接种于含有氨苄青霉素(100μg/mL)的液体LB培养基中，摇床37℃过夜培养，用质粒提取试剂盒操作说明提取质粒，并测序，质粒命名为pPIC9K-NCOL，质粒图谱图1。
2、毕赤酵母电转化
首先对pPIC9K-NCOL质粒进行SalⅠ线性化，反应体系如下：
上述试剂加好后，混匀，37℃水浴反应5小时，终止反应前先取出5μL在质量百分浓度为1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测是否酶切完全。之后，用DNA纯化试剂盒对线性化质粒进行回收。
取10μg上述SalⅠ内切酶线性化的pPIC9K-NCOL质粒，与80μL毕赤酵母GS115感受态细胞混匀，转至0.2cm冰预冷的电转化杯中，电压1.5kV；电容25μF；电阻200Ω；电击4～10毫秒，加入1mL冰预冷的1mol/L的山梨醇溶液将菌体混匀，涂布MD培养基平板，30℃倒置培养2～3天，在MD培养基平板上长出菌落。
3、多拷贝插入重组子的筛选
将MD培养基平板上长出的菌落用无菌牙签对应接种到G418浓度分别为0.5g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L的YPD平板上，30℃培养，筛选获得转化子；
4、基因重组人源胶原蛋白的发酵
将筛选到的转化子接种于400ml BMGY培养基中，30℃振荡培养24小时，作为一级种子转接于装有4L FBS(1L中含甘油40g、K2SO4 18.2g、H3PO426.7ml、CaSO4.2H2O 0.93g、MgSO4 14.9g、KOH 4.13g混合制成)培养基的5L发酵罐中，温度设定为30℃，pH值为5.0，培养16～20小时，作为二级种子转接入装有80L FBS培养基的150L大罐发酵。发酵过程中，生长温度30℃，诱导温度29℃，pH值为5.5，溶氧控制在20％～30％，当溶氧陡然上升时，预示基础盐培养基中的甘油已耗尽，开始流加18.15mL/h/L质量百分浓度为50％的甘油，在质量百分浓度为50％甘油中含12mL/L微量元素PTM1(1L中含CuSO4.5H2O 6g、NaI 0.08g、MnSO4.H2O 3g、Na2MoO4.H2O 0.2g、H3BO3 0.02g、H2SO4 5ml、CoCl2.6H2O 0.5g、ZnCl220g、FeSO4.7H2O 75g、生物素0.2g，混合制成)，维持溶氧在20％～30％。发酵液的湿菌重达到180mg/mL时，停止补料，饥饿1小时，甘油耗尽，流加20L质量百分浓度为75％甲醇诱导发酵，在质量百分浓度为75％甲醇中含12mL/L PTM1微量元素，以速率为7.5ml/L/h流加2～3小时，然后提高速率至10.9ml/L/h流加进行发酵。通过调节转速、罐压和通气量使溶氧大于20％，诱导发酵36～42小时，发酵液上清电泳见图2，表达量达10g/L以上。
5、基因重组人源胶原蛋白的纯化
5.1发酵液的固液分离及脱色
发酵结束后，发酵液离心分离，取上清液80L，用孔径为0.1μm中空纤维微滤系统进行微滤，收集滤过液，再用截留分子量为10KD的中空纤维超滤系统进行超滤脱盐浓缩，收集浓缩液，通过上述两步超滤法即可去除毕赤酵母发酵产生的大量黄绿色物质。
5.2重组人生长激素的离子交换层析
将上述浓缩液进行阴离子交换层析，填料选用CM Sepharose FF，CM SepharoseFF购于美国GE公司，用3倍柱体积的pH为5.0的10mmol/L柠檬酸缓冲液平衡，上样，用10倍柱体积的含0.5mol/L NaCl的pH值为5.0的10mmol/L柠檬酸缓冲液洗脱，收集洗脱液，然后用分子量为10KD的卷式超滤膜超滤，脱盐，收集浓缩液，冷冻干燥机冻干，获得纯度为95％以上基因重组人源胶原蛋白，纯化结果见图2。
6、基因重组人源胶原蛋白细胞毒性及促细胞增殖实验
用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养液将培养的成纤维细胞L929稀释配成6×103/ml的单细胞悬液；取3块96孔培养板，每孔接种100μl的细胞悬浮液,每块接种40孔，置含体积分数5％CO2培养箱中，37℃培养24h；弃去原培养液,每孔加入100μl实验组(基因重组人源胶原蛋白、牛胶原蛋白)10mg/ml配制溶液及阴性对照液(单纯细胞培养液)，每组8孔；将3块培养板移入37℃、体积分数5％CO2培养箱中，分别于接种后2、4、7d各取出1块培养板，每孔再加入MTT(噻唑蓝)50μl，继续在37℃条件下培养2h，吸弃原培养液，立即加入二甲基亚砜，每孔150μl，室温放置并轻轻震荡10～15min；选择490nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收值(A)，并计算细胞相对增殖率RGR(％)＝(实验组吸收值/阴性对照组吸收值)×100％。从图3、图4的结果可看出，基因重组人源胶原蛋白组和牛胶原蛋白组细胞存活率均大于100％，并随着细胞培养天数的增加细胞相对增殖率逐渐增加，基因重组人源胶原蛋白组可有效促进成纤维细胞的增殖，且略高于牛胶原蛋白组，综合上述结果可知，基因重组人源胶原蛋白细胞毒性为0级，具有良好的生物相容性。
实施例2
在实施例1的基因重组人源胶原蛋白的纯化步骤5中，所用的孔径为0.1μm中空纤维微滤系统用孔径为0.22μm中空纤维微滤系统替换，该步骤中的其他步骤与实施1相同，得到的的产品也是95％以上基因重组人源胶原蛋白，其毒性为0级，具有良好的生物相容性。
实施例3
本实施例根据人胶原蛋白的亲水性Gly-X-Y，设计15个氨基酸添加到基因重组人源胶原蛋白氨基酸的N-端，15个氨基酸序列为：
GPAGSQGPPGEKGND，通过实施例1相同的方法制备得到重组的人源胶原蛋白样品，其纯度为95％以上，生物相容性良好。
实施例4
本实施例根据人胶原蛋白的亲水性Gly-X-Y，设计15个氨基酸添加到基因重组人源胶原蛋白氨基酸的C-端，15个氨基酸序列为：
GEPGQPGARGSPGSQ，通过实施例1相同的方法制备得到重组的人源胶原蛋白样品，其纯度为95％以上，生物相容性良好。
通过上述实施例的数据可以看出，本发明设计并制备得到的人源胶原蛋白的纯度在95％以上，生物相容性良好。
Claims (13)
1.一种重组人源胶原蛋白，其特征在于，所述蛋白包含下列家族成员中的一种或几种：
1)具有序列表中SEQ ID No:1氨基酸残基序列的蛋白质；
2)与SEQ ID No:1氨基酸残基序列同源性在90％以上且具有与SEQ ID No:1相同活性的SEQ ID No:1衍生的蛋白质；
3)在SEQ ID No:1氨基酸残基序列的N-端增加或删除15个以内氨基酸残基得到的具有与SEQ ID No:1相同活性的SEQ ID No:1衍生的蛋白质；
4)在SEQ ID No:1氨基酸残基序列的C-端增加或删除15个以内氨基酸残基得到的具有与SEQ ID No:1相同活性的SEQ ID No:1衍生的蛋白质；
5)将SEQ ID No:1氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID No:1相同活性的SEQ ID No:1衍生的蛋白质。
2.如权利要求1所述的重组人胶原蛋白，其特征在于，所述蛋白为序列表中的SEQ IDNo:1。
3.如权利要求1或2所述的重组人胶原蛋白，其特征在于，所述蛋白的等电点为9.5。
4.如权利要求1-3任一项所述的重组人胶原蛋白，其特征在于，用于表达所述蛋白的宿主细胞为毕赤酵母Pichia.Pastoris。
5.一种制备权利要求1-4任一项所述的重组人胶原蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)制备质粒：人工全基因合成序列表中的SEQ ID No:3的序列，然后对pPIC9K载体及人工全基因合成的SEQ ID No:3的人源胶原蛋白进行Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接，并转化大肠杆菌，提取质粒；
(2)转化：将步骤(1)制备的质粒与毕赤酵母进行混合进行转化，获得转化后菌落；
(3)多拷贝插入重组子的筛选：将步骤(2)转化后的菌落进行进一步培养，筛选转化子；
(4)发酵：将步骤(3)筛选的转化子接种后进行发酵培养获得发酵液；
(5)纯化：将步骤(4)得到的发酵液依次进行固液分离、过滤、浓缩和离子交换层析得到产品。
6.如权利要求5所述制备方法，其特征在于，所述步骤(5)的纯化的具体步骤为：将步骤(4)得到的发酵液经离心进行固液分离，取上清液，对发酵上清液用孔径为0.22μm中空纤维微滤系统进行微滤，收集滤液，再用截留分子量为10KD的中空纤维超滤系统进行超滤脱盐浓缩，收集浓缩液，然后用CM Sepharose FF进行离子交换层析，即可得到产品。
7.如权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)制备质粒
人工全基因合成序列表中的SEQ ID No:3的序列，然后对pPIC9K载体及人工全基因合成的SEQ ID No:3的序列人源胶原蛋白进行Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接，并转化大肠杆菌，提取质粒，命名为pPIC9K-NCOL；
(2)毕赤酵母电转化
将经SalⅠ内切酶线性化的pPIC9K-NCOL质粒，与毕赤酵母感受态细胞混匀，转至冰预冷的电转化杯中，电击4～10毫秒，加入冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，涂布MD培养基平板，倒置培养2～3天，在MD培养基平板上长出菌落；
(3)多拷贝插入重组子的筛选
将MD培养基平板上长出的菌落用无菌牙签对应接种到G418浓度分别为0.5g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L的YPD平板上培养，筛选获得转化子；
(4)基因重组人源胶原蛋白的发酵
将筛选到的转化子接种于BMGY培养基中，振荡培养24小时，作为一级种子转接于装有FBS培养基的发酵罐中，pH值为5.0培养16～20小时，作为二级种子转接入装有FBS培养基的大罐发酵，生长温度30℃，诱导温度低于生长温度，pH值为5.0，溶氧控制在20％～30％，诱导发酵36～42小时；
(5)基因重组人源胶原蛋白的纯化
将步骤(4)发酵液经离心进行固液分离，取上清液，对发酵上清液用孔径为0.1μm或0.22μm中空纤维微滤系统进行微滤，收集滤过液，再用截留分子量为10KD的中空纤维超滤系统进行超滤脱盐浓缩，收集浓缩液，然后用CM Sepharose FF进行离子交换层析，获得纯度为95％以上的基因重组人源胶原蛋白。
8.一种编码重组人源胶原蛋白的基因，其特征在于，其是下列核苷酸序列中的一种：
1)序列表中的SEQ ID No:2；
2)编码序列表中SEQ ID No:1蛋白质序列的多核苷酸；
3)与序列表中的SEQ ID No:2限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
4)编码由SEQ ID No:1衍生的蛋白质的DNA序列，所述由SEQ ID No:1衍生的蛋白质为在SEQ ID No:1氨基酸残基序列的N-端增加或删除15个以内氨基酸残基得到的具有与SEQID No:1相同活性的多肽；
5)编码由SEQ ID No:1衍生的蛋白质的DNA序列，所述由SEQ ID No:1衍生的蛋白质为在SEQ ID No:1氨基酸残基序列的C-端增加或删除15个以内氨基酸残基得到的具有与SEQID No:1相同活性的多肽；
6)编码由SEQ ID No:1衍生的蛋白质的DNA序列，所述由SEQ ID No:1衍生的蛋白质为将SEQ ID No:1氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID No:1相同活性的多肽。
9.如权利要求8所述的编码基因，其特征在于，所述基因为序列表中的SEQ ID No:2。
10.含有权利要求8或9所述基因的表达载体。
11.含有权利要求8或9所述基因的细胞系。
12.一种用于组织工程、美容护肤的生物材料，其特征在于，所述生物材料包含权利要求1-4所述人源胶原蛋白，权利要求8或9所述基因编码的重组人源胶原蛋白。
13.如权利要求1-4所述人源胶原蛋白，权利要求5-7制备方法制备得到的重组人源胶原蛋白，权利要求8或9所述基因编码的重组人源胶原蛋白，其纯度为95％以上。
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