CN105061589A

CN105061589A - 一种重组人ⅰ型胶原蛋白及其固定化发酵生产的方法

Info

Publication number: CN105061589A
Application number: CN201510535383.7A
Authority: CN
Inventors: 王菊芳; 马毅; 杨晶; 李杉
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: Guangzhou Jiyuan Bio-technology Co., Ltd.
Priority date: 2015-08-26
Filing date: 2015-08-26
Publication date: 2015-11-18
Anticipated expiration: 2035-08-26
Also published as: CN105061589B

Abstract

本发明公开了一种重组类人Ⅰ型胶原蛋白及其固定化发酵生产的方法，它的全长为344个氨基酸，以人Ⅰ型胶原蛋白α1链660-964位肽段为基本构架，在其N端添加680-694位的15个氨基酸、在C端添加950-964位的15个氨基酸以及3组GER氨基酸三联体。本发明类人Ⅰ型胶原蛋白由毕赤酵母分泌表达，无需破碎细胞，经过凝胶过滤一步纯化，可以得到纯度>95％的重组蛋白。同时，利用纤维床生物反应器系统，固定化发酵重组工程菌。具有不需反复接种、细胞密度高、传质效率好、制作简单等优点，可以显著地提高重组类人Ⅰ型胶原蛋白的产量。该蛋白可以应用于化妆品行业，也可以应用于组织工程领域。

Description

一种重组人Ⅰ型胶原蛋白及其固定化发酵生产的方法

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及重组人Ⅰ型胶原蛋白在毕赤酵母中的表达、固定化发酵以及生物活性鉴定。

背景技术

胶原蛋白是一种非常关键的结构蛋白，主要存在于哺乳动物结缔组织的细胞外基质中，占全身蛋白总量的25％～35％(LiuD,NikooM,BoranGetal.CollagenandGelatin.AnnualReviewofFoodScienceandTechnology,2015,6:527-557)。胶原蛋白由三条α链相互缠绕形成的右手螺旋结构，α链是由G-X-Y氨基酸三联体的重复序列构成，G是甘氨酸，X和Y通常是脯氨酸和羟脯氨酸(HeL,MuC,ShiJetal.Modificationofcollagenwithanaturalcross-linker,procyanidin.Internationaljournalofbiologicalmacromolecules,2011,48(2):354-359)。到目前为止，已发现29种胶原蛋白，其中I型胶原蛋白含量最高，约占总量的90％(JridiM,BardaaS,MoallaDetal.Microstructure,rheologicalandwoundhealingpropertiesofcollagen-basedgelfromcuttlefishskin.Internationaljournalofbiologicalmacromolecules,2015,77:369-374)。在新组织的形态发生和细胞代谢中，它赋予新组织机械强度和特殊的生化特性(FerreiraAM,GentileP,ChionoV,etal.Collagenforbonetissueregeneration.Actabiomaterialia,2012,8(9):3191-3200)。

胶原蛋白具有生物可降解性、良好的生物相容性、低抗原性、低细胞毒性、亲水性好等功能，并且能促进细胞增殖(LiuD,NikooM,BoranGetal.CollagenandGelatin.AnnualReviewofFoodScienceandTechnology,2015,6:527-557)。它能被加工形成各种形式，例如交联的膜、薄片、珠粒、纤维和海绵(LeeC,LeeY.Biomedicalapplicationsandtissueengineeringofcollagen.AdvancedDrugDelivery,2013:445)。基于以上特性，胶原蛋白被广泛地应用于临床医学，例如注射型胶原蛋白可以用于止血、烧伤、绷带、血管移植等(PrajapatiVD,JaniGK,KapadiaJR.Currentknowledgeonbiodegradablemicrospheresindrugdelivery.Expertopinionondrugdelivery,2015,17:1-17)。

胶原蛋白目前主要通过酸、碱水解的方式从动物结缔组织中提取，在提取过程中无法避免会丧失部分生物活性，作用于人体会产生异种排斥反应，而且存在感染病毒的隐患(OlsenD,JiangJ,ChangRetal.Expressionandcharacterizationofalowmolecularweightrecombinanthumangelatin:developmentofasubstituteforanimal-derivedgelatinwithsuperiorfeatures.Proteinexpressionandpurification,2005,40(2):346-357)。由于胶原蛋白在医用材料等领域有广阔的应用前景，所以迫切需要新的手段制备胶原蛋白，利用基因工程技术生产重组人胶原蛋白成为热门的研究领域(OlsenD,YangC,BodoM,etal.Recombinantcollagenandgelatinfordrugdelivery.AdvancedDrugDeliveryReviews,2003,55(12):1547-1567)。Li等将人Ⅰ型胶原蛋白α1链的氨基酸序列进行拼接和重复，经毕赤酵母表达和纯化，证明其能促进乳仓鼠肾细胞的增殖(LiL,FanD,MaX,etal.High-levelsecretoryexpressionandpurificationofunhydroxylatedhumancollagenα1(III)chaininPichiapastorisGS115.Biotechnologyandappliedbiochemistry,2015,doi:10.1002/bab.1297)。Yao等重复构建类人Ⅰ型胶原蛋白α1链的特定肽段，在大肠杆菌中表达、纯化，证明该序列可以促进小鼠成纤维细胞3T3粘附和自身交联(YaoJ,YanagisawaS,AsakuraT.Design,expressionandcharacterizationofcollagen-likeproteinsbasedonthecelladhesiveandcrosslinkingsequencesderivedfromnativecollagens.Journalofbiochemistry,2004,136(5):643-649)。

纤维床生物反应器(fibrousbedbioreactor，简称FBB)，是一种以丝网为支持物填装纤维材料作为固定化载体的反应器。与传统的固定化反应器相比，FBB采用具有高孔隙率和高比表面积的纤维材料作为载体，传质效率高；FBB固定化的细胞可以不断更新，活细胞比例高；同时FBB还有具有成本低、制作简单、底物耐受性高、稳定性好等优点(ZhuH,YangST.Long-termcontinuousproductionofmonoclonalantibodybyhybridomacellsimmobilizedinafibrous-bedbioreactor.Cytotechnology,2004,44(1-2):1-14)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种以毕赤酵母为表达体系的重组类人Ⅰ型胶原蛋白制备方法。毕赤酵母分泌表达生产的重组类人Ⅰ型胶原蛋白既避免了动物来源胶原蛋白带来的病毒隐患，又能够降低人体的免疫排斥反应，并明显地促进哺乳动物细胞的增值。本发明同时利用纤维床生物反应器系统，固定化发酵重组工程菌，与传统游离细胞发酵相比，具有不需反复接种、细胞密度高、传质效率好、制作简单等优点。

本发明技术方案如下：

一种重组人Ⅰ型胶原蛋白，它的全长为344个氨基酸，以人Ⅰ型胶原蛋白α1链660-964位肽段为基本构架，在其N端添加680-694位的15个氨基酸、在C端添加950-964位的15个氨基酸以及3组GER氨基酸三联体。添加的680-694位肽段和950-964位已被证明可以支持细胞粘附和细胞增殖。本发明成功得到了能够促进细胞增殖的重组类I型人胶原蛋白。

上述重组人Ⅰ型胶原蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNo:1所示。

编码上述蛋白的基因，其序列如SEQIDNo:2所示。

表达重组人Ⅰ型胶原蛋白的毕赤酵母重组工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

a.PCR扩增目的基因

以上述编码上述重组人Ⅰ型胶原蛋白的基因为模版，设计引物扩增目的基因，扩增引物如下：

上游引物：GCCTACGTAGAACAAGGCGTTCCAGGT

下游引物：GAATGCGGCCGCAGGCAGGCCAACAACACCACG

b.构建重组质粒pPIC9K-rhCⅠ

纯化回收PCR产物，然后对载体pPIC9K和纯化后的PCR产物进行SnabⅠ和NotⅠ双酶切，T4连接酶体系连接回收目的片段和pPIC9K载体，转化至大肠杆菌DH5α，涂布于含有氨苄青霉素的LB平板，菌落PCR筛选鉴定阳性转化子；

c.构建重组表达人Ⅰ型胶原蛋白的毕赤酵母重组工程菌

使用SalⅠ单酶切线性化重组质粒pPIC9K-rhCⅠ，电击转化至感受态毕赤酵母GS115，用抗生素G418梯度筛选得到高拷贝工程菌株。

用BMGY培养基，30～32℃，200～250rpm/min震荡培养上述毕赤酵母重组工程菌，当OD₆₀₀达到5.0以上时，5000×g离心10～15min收集菌体，将菌体转移至BMMY培养基中进行培养，加入0.5％(v/v)甲醇诱导，每隔24h补充0.5％(v/v)甲醇，发酵结束后，离心收集发酵液上清，浓缩后，利用凝胶过滤层析法纯化，即得到重组人Ⅰ型胶原蛋白。

所述BMGY培养基的配方为：胰蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，YNB13.4g/L，500×生物素2.0mL，甘油10mL,1M磷酸钾100mL；

所述BMMY培养基的配方为：胰蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，YNB13.4g/L，500×生物素2.0mL，1M磷酸钾100mL。

一种连续生产重组人Ⅰ型胶原蛋白的方法，包括以下步骤：

(1)搭建固定化反应系统：由管路串联的普通发酵罐和固定化反应器组成，所述固定化反应器为纤维床反应器，其中固定化介质主要为棉纤维；

(2)将上述毕赤酵母重组工程菌的种子液以10～15％(v/v)的接种量接种至普通发酵罐中，加入氨水调节pH达到5.0～5.5，温度控制在30～32℃，溶氧率为20％～30％，通气量为2vvm，转速为800rpm/min；当普通发酵罐中OD₆₀₀达到10及以上时，联通两个反应器之间的管道，从纤维床反应器将培养基泵入纤维床反应器，使酵母菌细胞固定在纤维床反应器中的棉纤维上；

(3)当发酵罐中游离菌体浓度恒定且底物不再消耗，收获培养基进行蛋白纯化，同时添加新鲜培养基重新开始发酵。

当发酵罐中溶氧突然上升时，开始流加50％v/v的甘油，流速为6.0～6.4mL/(L·h)，时间约为24h，停止流加甘油后，溶氧上升，培养0.5h～1h后，开始流加甲醇，流速为6.4mL/(L·h)；反应温度控制为24～26℃，pH调节至6.5，溶氧率维持在20％～30％，甲醇诱导时间为84h；更换新鲜培养基，进行下一轮固定化发酵培养。

所述普通发酵罐中培养基成分为：PTM14.35mL，H₃PO₄26.7mL，丙三醇40g/L，MgSO₄14.9g/L，K₂SO₄18.2g/L，CaSO₄0.93g/L，KOH4.13g/L，(NH₄)₂SO₄10g/L。

重组类人Ⅰ型胶原蛋白肽的活性检测：纯化的目的蛋白置于真空干燥机冻机制成胶原蛋白冻干粉，加入完全培养基配制成不同蛋白浓度的培养基。以每孔10000个细胞的密度接种小鼠胚胎成纤维细胞于96孔板中，加入含有不同浓度的类人Ⅰ型胶原蛋白的完全培养基，置于37℃，5％CO₂(V/V)培养，分别处理24h后，加入10μL的MTT(5mg/mL)，置于37℃反应4h后，除去培养基，每个孔加入100μL的DMSO，低速振荡混匀。置于多功能酶标仪检测490nm反应液的吸光值。

本发明与传统大肠杆菌表达系统相比，具有如下优点：

(1)本发明的重组质粒线性化后整合至毕赤酵母的基因组，外源基因不容易丢失，重组菌株稳定性高。

(2)本发明类人Ⅰ型胶原蛋白由毕赤酵母分泌表达，无需破碎细胞，经过凝胶过滤一步纯化，可以得到纯度>95％的重组蛋白。

(3)本发明的重组类人Ⅰ型胶原蛋白的氨基酸序列在天然的Ⅰ型胶原蛋白基础上，分别在N端和C端增加了部分氨基酸序列，该序列能促进细胞增殖和细胞黏附。本发明的重组类人Ⅰ型胶原蛋白具有良好的生物活性，经噻唑蓝(MTT)实验证明，重组类人Ⅰ型胶原蛋白能明显促进哺乳细胞的增殖，为后续广泛应用于生物医药行业和化妆品行业奠定了基础。

(4)本发明利用纤维床生物反应器系统，固定化发酵重组工程菌。与传统游离细胞发酵相比，具有不需反复接种、细胞密度高、传质效率好、制作简单等优点，可以显著地提高重组类人Ⅰ型胶原蛋白的产量。

附图说明

图1为pPIC9K-rhCⅠ重组质粒的构建图；

图2为重组质粒双酶切的鉴定图；其中：泳道M:DNAMarker，泳道1：pPIC9K-rhCⅠ重组质粒双酶切；

图3为重组类人Ⅰ型胶原蛋白凝胶过滤纯化SDS-PAGE鉴定，其中：泳道M：proteinMarker，泳道1：发酵液上清，泳道2-3：穿过峰，泳道4：纯化后的重组类人Ⅰ型胶原蛋白；

图4为重组类人Ⅰ型胶原蛋白生物的活性检测，其中：1：BSA，2：重组类人Ⅰ型胶原蛋白，3：商品化胶原蛋白。

图5为连续生产重组人Ⅰ型胶原蛋白的纤维床固定化反应系统构造图。

其中，1：氨水补料瓶；2：甲醇补料瓶；3：甘油补料瓶；4：普通机械式搅拌发酵罐；5：纤维床生物反应器。

图6为固定化重组毕赤酵母补料流加发酵的动力学图。

具体实施方式

以下将参照附图和具体实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1

产重组类人Ⅰ型胶原蛋白工程菌的构建

PCR产物和表达载体pPIC9K分别经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后置于T4DNA连接酶体系连接，构建重组质粒pPIC9K-rhCⅠ，其具体构建过程如图1所示。

1.目的基因片段、引物的设计与合成

正向引物为F1:5’-GCCTACGTAGAACAAGGCGTTCCAGGT-3’，含有下划线为SnabⅠ酶切位点(下划线标记部分)

反向引物为R1:5’-GAATGCGGCCGCAGGCAGGCCAACAACACCACG-3’，含有酶切位点NotⅠ(下划线标记部分)。

2.PCR扩增及重组质粒构建

上海生工生物工程技术服务有限公司基于序列SEQIDNo:2合成质粒pUC57-rhCⅠ，以质粒pUC57-rhCⅠ为模板，以F1、R1所示的核苷酸序列为上、下游引物进行PCR扩增rhCⅠ，其反应体系如下：

PCR扩增程序如下：

所得PCR产物于4℃保存备用，1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，得到大小为1035bp的包含酶切位点的基因片段，对此片段切胶回收。

所得PCR产物和载体pPIC9K分别置于37℃双酶切(SnabⅠ和NotⅠ)2h。双酶切体系如下：

切胶回收双酶切产物，置于T4DNA连接酶体系16℃连接12h,连接体系如下：

所得连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α。

3.重组质粒鉴定

方法：上述连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取10个单克隆扩大培养，进行菌液PCR鉴定阳性克隆，PCR条件同步骤2，选取经菌液PCR鉴定为阳性的克隆提取质粒，置于双酶切体系(NotⅠ和SnabⅠ)37℃反应2h，双酶切的产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。选择阳性克隆送样至华大基因进行测序鉴定。

结果：重组质粒双酶切后得到与pPIC9K大小一致的大片段和与rhCⅠ基因大小一致的小片段，其双酶切图谱如图2所示，证明此克隆为阳性克隆。测序结果与预期核苷酸序列完全一致。

结论：pPIC9K-rhCⅠ重组质粒成功构建。

实施例2

重组类人I型胶原蛋白的表达及纯化

1.重组质粒pPIC9K-rhCⅠ线性化

将重组质粒pPIC9K-rhCⅠ进行单酶切，37℃单酶切2h，酶切体系如下：

酶切产物使用PCR纯化试剂盒纯化回收。

方法：上述实施例2中得到的线性化的重组质粒电击转化质至的感受态细胞毕赤酵母GS115中，挑取单克隆经菌落PCR鉴定的阳性克隆接种至3mL含有的YPD液体培养基中置于30℃,250rpm震荡培养过夜，转接于含有25mL的BMGY培养基中，置于30℃,250rpm震荡培养。直至OD₆₀₀＝5～10，将菌液转移至50mL无菌离心管中，5000rpm离心2min。将菌体利用BMMY培养基重悬后，转移至50mL的BMMY培养基中，加入0.5％(v/v)的甲醇，30℃250rpm震荡培养。每隔24h补充0.5％(v/v)的甲醇。12000rpm离心10min，超滤浓缩发酵液上清后，4℃冰箱中透析24h，透析液为20mMPB(390mL0.2mol/LNaH₂PO₄与610mL0.2mol/LNa₂HPO₄混合)。凝胶过滤层析纯化重组类人Ⅰ型胶原蛋白，得到纯度为95.2％的目的蛋白。纯化产物加入SDS-PAGE上样缓冲液置于沸水中煮10min。浓缩胶80V，分离胶120V进行SDS-PAGE电泳，电泳完毕用考马斯亮蓝染色液染色，脱色液脱色。

结果：如图3所示，重组类人Ⅰ型胶原蛋白在毕赤酵母GS115得到成功诱导表达。经凝胶过滤层析法纯化重组类人Ⅰ型胶原蛋白，得到纯度为95.2％的目的重组蛋白。

结论：重组类人Ⅰ型胶原蛋白成功进行表达纯化。

实施例3

重组类人Ⅰ型胶原蛋白促进小鼠成纤维细胞增殖实验

方法：按实施例2的方式得到的重组蛋白置于真空干燥机冻机制成胶原蛋白冻干粉，加入完全培养基配制成不同蛋白浓度的培养基。将小鼠胚胎成纤维细胞以每孔10000个细胞的密度接种于96孔板中，加入含有不同蛋白浓度的完全培养基，置于37℃，5％CO₂(v/v)培养，分别处理24h。用不同浓度的蛋白处理后，加入10μL的MTT(5mg/mL)，置于37℃反应4h后去除培养基，每个孔加入100μL的DMSO，低速振荡混匀。使用多功能酶标仪检测反应液的490nm的吸光值。

本实验共设4组，1组为空白对照(仅有完全培养基)，2组为牛血清白蛋白，3组为重组类人Ⅰ型胶原蛋白，4组为商品化胶原蛋白，蛋白促增殖能力＝样品OD_490nm吸光值/空白对照组OD_490nm吸光值×100％。

结果：如图4所示,与BSA和商品化胶原蛋白相比，经过统计学分析，具有显著性差异。

结论：重组类人Ⅰ型胶原蛋白能明显的促进小鼠成纤维细胞增殖，其促进效应优于市场上现有的重组类人Ⅰ型胶原蛋白。

实施例4

纤维床固定化发酵

连续生产重组人Ⅰ型胶原蛋白的方法：

将棉纤维附着于钢丝网，装入玻璃柱反应器中，搭建纤维床生物反应器。

按图5搭建固定化反应系统，普通机械式搅拌发酵罐4和纤维床生物反应器5之间由管路构成回路，其中固定化介质主要为棉纤维。将实施例2中的重组甘油菌在YPD平板上划线分离，挑单克隆接种至5mL的YPD液体培养基，置于30℃250rpm震荡培养24h，制备一级种子液。将一级种子液按10％(v/v)的接种量接种至250mL的YPD液体培养基，置于30℃250rpm震荡培养20h，制备二级种子液。将二级种子液接种至5L发酵罐，加入氨水调节pH达到5.5，温度为30℃，溶氧率控制在20％～30％，通气量为2vvm，转速为800rpm/min。当OD₆₀₀＝10左右，将培养基经管道从玻璃柱底部泵入纤维床生物反应器5，泵的转速为30mL/min，当发酵罐中游离菌体浓度恒定时，更换新鲜培养基，泵的转速设定为80mL/min，开始固定化发酵生产重组Ⅰ型类人胶原蛋白。当发酵罐中溶氧突然上升时，开始流加50％(v/v)的甘油，流速为6.4mL/(L·h)，时间约为24h，停止流加甘油后，溶氧上升，培养0.5h～1h后，开始流加甲醇，流速为6.4mL/(L·h)。反应温度控制为25℃，pH调节至6.5，溶氧率维持在20％～30％，甲醇诱导时间为84h；更换新鲜培养基，进行下一轮固定化发酵培养。结果：如图6所示。

结论：采用纤维床生物反应器，建立固定化细胞补料流加发酵模式，重组类人Ⅰ型胶原蛋白产量为3.43g/L。

Claims

1.一种重组类人Ⅰ型胶原蛋白，其特征在于，它的全长为344个氨基酸，以人Ⅰ型胶原蛋白α1链660-964位肽段为基本构架，在其N端添加680-694位的15个氨基酸、在C端添加950-964位的15个氨基酸以及3组GER氨基酸三联体。

2.根据权利要求1所述的重组类人Ⅰ型胶原蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNo:1所示。

3.一种编码权利要求1或2所述蛋白的基因。

4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于，其序列如SEQIDNo:2所示。

5.表达重组类人Ⅰ型胶原蛋白的毕赤酵母重组工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

a.PCR扩增目的基因

以权利要求3或4所述基因为模版，设计引物扩增目的基因，扩增引物如下：

上游引物：GCCTACGTAGAACAAGGCGTTCCAGGT

下游引物：GAATGCGGCCGCAGGCAGGCCAACAACACCACG

b.构建重组质粒pPIC9K-rhCⅠ

c.构建重组表达类人Ⅰ型胶原蛋白的毕赤酵母工程菌

6.权利要求1或2所述蛋白固定化发酵生产的方法，其特征在于，用BMGY培养基，30～32℃，200～250rpm/min震荡培养权利要求5所述的毕赤酵母重组工程菌，当OD₆₀₀达到5.0以上时，5000×g离心10～15min收集菌体，将菌体转移至BMMY培养基中进行培养，加入0.5％(v/v)甲醇诱导，每隔24h补充0.5％(v/v)甲醇，发酵结束后，离心收集发酵液上清，浓缩后，利用凝胶过滤层析法纯化，即得到重组类人Ⅰ型胶原蛋白。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述BMGY培养基的配方为：胰蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，YNB13.4g/L，500×生物素2.0mL，甘油10mL,1M磷酸钾100mL；

8.一种连续生产重组类人Ⅰ型胶原蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(2)将权利要求5所述毕赤酵母重组工程菌的种子液以10～15％(v/v)的接种量接种至普通发酵罐中，加入氨水调节pH达到5.0～5.5，温度控制在30～32℃，溶氧率为20％～30％，通气量为2vvm，转速为800rpm/min；当普通发酵罐中OD₆₀₀达到10及以上时，联通两个反应器之间的管道，从普通发酵罐中将培养基泵入纤维床反应器，使酵母菌细胞固定在纤维床反应器中的棉纤维上；

(3)当普通发酵罐中游离菌体浓度恒定且底物不再消耗，收获培养基进行蛋白纯化，同时添加新鲜培养基重新开始发酵。

9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，当发酵罐中溶氧突然上升时，开始流加50％v/v的甘油，流速为6.0～6.4mL/(L·h)，时间约为24h，停止流加甘油后，溶氧上升，培养0.5h～1h后，开始流加甲醇，流速为6.4mL/(L·h)；反应温度控制为24～26℃，pH调节至6.5，溶氧率维持在20％～30％，甲醇诱导时间为84h；更换新鲜培养基，进行下一轮固定化发酵培养。

10.根据权利要求8或9所述方法，其特征在于，所述普通发酵罐中培养基成分为：PTM14.35mL，H₃PO₄26.7mL，丙三醇40g/L，MgSO₄14.9g/L，K₂SO₄18.2g/L，CaSO₄0.93g/L，KOH4.13g/L，(NH₄)₂SO₄10g/L。