CN110305805A - 一种重组毕赤酵母工程菌及其在合成左旋多巴中的应用 - Google Patents

一种重组毕赤酵母工程菌及其在合成左旋多巴中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组毕赤酵母工程菌及其在合成左旋多巴中的应用。本发明的重组毕赤酵母工程菌通过如下方法获得：将SEQ ID NO.1所示的酪氨酸酚裂解酶(TPL)的DNA序列进行密码子优化后，转入到毕赤酵母GS115，构建重组毕赤酵母YZ001，随后将SEQ ID NO.4所示的HAC1在毕赤酵母YZ001中过量表达，构建获得重组毕赤酵母工程菌YZ002。本发明重组毕赤酵母工程菌发酵离心后的上清液可有效用于合成左旋多巴，离心后的菌体可以用于下一批次的发酵，这不仅提高了左旋多巴的合成效率和使用率、节约生产成本，并为左旋多巴的生产加工开辟新的工业化途径。

Description

一种重组毕赤酵母工程菌及其在合成左旋多巴中的应用
技术领域
本发明涉及一种重组毕赤酵母工程菌及其在合成左旋多巴中的应用，属于生物工程领域。
背景技术
左旋多巴是一种应用于治疗帕金森病，肝性脑病，神经痛，高泌乳素血症等疾病的常见药物，在医药市场具有巨大的应用价值。目前制备左旋多巴的方法主要有植物提取法，化学合成法和生物酶转化法。但是植物提取法和化学合成法均存在工艺繁琐，成本高，污染环境等缺点。而生物酶催化方法合成左旋多巴绿色环保，集约高效，目前已成为左旋多巴工业化的主要方法。
生物酶转化法主要是以酪氨酸酚裂解酶(TPL)为催化剂，以邻苯二酚、丙酮酸和醋酸氨为底物，催化合成左旋多巴。目前报道的来源于具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum)、氟式柠檬酸杆菌(Citrobacter frenudii)、草生欧文氏菌(Erwiniaherbicola)、嗜热菌(Symbiobacterium SP.)，克吕沃尔氏菌(Kluyvera intermedia)等的TPL，已经成功在细菌中表达，并应用于生产。
虽然利用细菌表达TPL在工业上已经开始得到了应用，但是仍然受到多方面限制。首先，细菌如大肠杆菌表达TPL之后需要经破壁处理释放胞内的TPL，增加了工艺步骤和能耗，且破壁过程中易造成酶活的降低。其次，细菌容易受到噬菌体感染，容易使得发酵失败。
毕赤酵母作为一类能够利用甲醇为唯一碳源和能源的酵母菌，具有如下优点：1.具有目前最强的启动子，醇氧化酶基因启动子(PAOX1)；2.表达效率高，其外源蛋白的表达量可占总表达蛋白的90％以上；3.可实现外源蛋白的分泌表达，减少细胞破壁的后处理工序；4.在简单合成培养基中即可实现高密度发酵；5.表达的质粒能整合在基因组中特定位点，遗传特性稳定。6.毕赤酵母表达酪氨酸酚裂解酶不会受到噬菌体感染，避免了倒罐带来的损失。7.以甲醇作为唯一碳源和能源，价格低廉，有利于工业化生产。此外，转录因子Hac1作为内质网响应蛋白，在毕赤酵母中参与转录调控，有研究表明，过量表达Hac1能显著提高外源蛋白在毕赤酵母中的表达量。
基于毕赤酵母的以上优势，开发用毕赤酵母分泌表达TPL来实现工业化生产左旋多巴就显得十分必要。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组毕赤酵母工程菌及其在合成左旋多巴中的应用。
为了达到上述的目的，本发明采取以下技术方案：
一种重组毕赤酵母工程菌，所述重组毕赤酵母工程菌通过如下方法获得：将SEQID NO.1所示的酪氨酸酚裂解酶(TPL)的DNA序列进行密码子优化后，转入到毕赤酵母GS115，构建重组毕赤酵母YZ001，随后将SEQ ID NO.4所示的HAC1在毕赤酵母YZ001中过量表达，构建获得重组毕赤酵母工程菌YZ002。
进一步地，所述重组毕赤酵母工程菌的制备方法具体为：
(1)将SEQ ID NO.1所示的酪氨酸酚裂解酶(TPL)的DNA序列进行密码子优化后克隆至毕赤酵母表达载体pPIC9K而获得的表达载体pPIC9K-TPL，将pPIC9K-TPL线性化后，转入毕赤酵母GS115获得重组毕赤酵母YZ001；
(2)将SEQ ID NO.4所示的HAC1与pPICZαA载体连接，构建pPICZαA-HAC1质粒，将pPICZαA-HAC1线性化后转入到毕赤酵母YZ001，构建获得重组毕赤酵母工程菌YZ002。
本发明还提供上述重组毕赤酵母工程菌作为催化剂的用途。
进一步地，所述重组毕赤酵母工程菌作为催化剂合成左旋多巴的用途。
进一步地，所述重组毕赤酵母工程菌经过发酵离心后的上清液用于催化合成左旋多巴。
进一步地，所述发酵和离心后收集的菌体可重新添加培养基，进行下一批的发酵。
进一步地，所述发酵步骤为：将重组酵母工程菌接种于YPD培养基过夜培养，随后以10％的接种量接种于含有无机盐培养基的20L发酵罐中，流加甲醇诱导72小时。
本发明还提供一种左旋多巴的合成方法，该方法以邻苯二酚，丙酮酸和醋酸铵为底物，以上述的上清液作为催化剂合成左旋多巴。
本发明具有如下特点：
本发明所获得的重组毕赤酵母YZ002经甲醇诱导后，可以实行高密度发酵，发酵后直接离心，上清液可以用于下一步的催化合成左旋多巴，合成左旋多巴的能力可达到120.3g/L，满足工业化需求。此外，发酵结束后不需要进行细胞破壁处理，减少了后期的工艺处理程度。发酵离心后的菌体可重新添加培养基，进行下一批的发酵，从而实现了连续化培养，节约生产成本。
附图说明
图1为本发明所构建的重组表达质粒pPIC9K-TPL。
图2为本发明所构建的重组表达质粒pPICZαA-HAC1。
图3重组毕赤酵母工程菌YZ002用于合成左旋多巴的浓度随反应时间变化图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
除非另作定义，本公开所使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内有一般技能的人士所理解的通常意义。
实施例1毕赤酵母重组菌YZ001的构建
本实施例以SEQ ID NO.2所示的克吕沃尔氏菌(Kluyvera intermedia)酪氨酸酚裂解酶的氨基酸序列为基础。将SEQ ID NO.1所示的酪氨酸酚裂解酶(TPL)的DNA序列按照毕赤酵母密码子偏爱性进行优化，得到密码子优化后的TPL基因，其优化后的序列如SEQ IDNO.3所示。通过生物技术公司(金唯智生物科技公司)进行全基因合成，合成的基因克隆在pETDuet-1载体上得到质粒pETDuet-TPL。通过设计引物YW500与YW504，以质粒pETDuet-TPL为模板，进行PCR扩增TPL。扩增体系为50μL(2x PrimeSTAR Max DNA聚合酶(购自北京宝日医生物有限公司)25μL，1μL YW500+1μL YW504，0.5μL pETDuet-TPL质粒，蒸馏水至22.5μL)，95℃预变性3分钟，98℃变性10秒，58℃退火15秒，72℃延伸2分钟(30个循环)，72℃再次延伸10分钟。
将上述获得的TPL片段利用胶回收试剂盒(购自北京宝日医生物有限公司)回收后，用限制性内切酶EcoR I和Not I酶切，与同样EcoR I和Not I酶切的pPIC9K载体混合后，采用T4DNA Ligase试剂盒(购自北京宝日医生物有限公司)连接，构建pPIC9K-TPL质粒，如图1所示。克隆体系为20μL(2μL10×T4连接酶缓冲液，6μL酶切后的TPL片段，2μL酶切后的pPIC9K片段，1μLT4连接酶，9μL蒸馏水)，16℃反应半小时后取10μL加入到100μLDH5α感受态细胞中冰浴30分钟。42℃热激30秒，立即置于冰上2分钟，随后加入1mL LB培养基，200rpm，37℃孵育1小时。离心收集菌体涂在含有氨苄的LB平板上，过夜培养后待长出转化子后用引物YW505与YW506进行鉴定，PCR筛选6个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在载体pPIC9K-TPL构建成功。
用Bpu1102I线性化质粒pPIC9K-TPL，PCR纯化后，用电转方法转入毕赤酵母GS115感受态细胞中，得到转化后的毕赤酵母重组菌YZ001。其具体步骤如下：接种毕赤酵母GS115于YPD培养基中，30℃过夜培养，转接于50mL新鲜YPD培养基中使得初始OD600为0.1，培养4-6小时待OD600达到1～2。离心去掉上清液，菌体用1M山梨醇洗三次。去除上清后，用150mL山梨醇悬浮细胞。取80μL感受态细胞与50ng DNA片段混合，设置电转参数1.5kV(E＝12.4kV/cm)，200Ω，and 25μF进行电转，电转后迅速添加1mL 1M的山梨醇，涂平板于YND固体培养基中倒置培养2-3天，转化子用引物YW502+YW503进行PCR鉴定。
实施例2毕赤酵母重组菌YZ002的构建
以毕赤酵母GS115的基因组为模板，通过设计引物YW507与YW508，进行PCR扩增HAC1(其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)。扩增体系为50μL(2×PrimeSTAR Max DNA聚合酶25μL，1μL YW507+1μL YW508，0.5μLGS115基因组，蒸馏水至22.5μL)，95℃预变性3分钟，98℃变性10秒，58℃退火15秒，72℃延伸2分钟(30个循环)，72℃再次延伸10分钟。
将上述获得的HAC1片段胶回收后，用限制性内切酶EcoR I和Not I酶切，与同样EcoR I和Not I酶切的pPICZαA载体连接，构建pPICZαA-HAC1质粒，如图2所示。克隆体系为20μL(2μL 10x T4连接酶缓冲液，6μL酶切后的TPL片段，2μL酶切后的pPICZαA片段，1μL T4连接酶，9μL蒸馏水)。阳性转化子鉴定引物YW505与YW506进行鉴定。
用Pme I线性化质粒pPICZαA-HAC1后转入毕赤酵母YZ001感受态细胞中，得到转化后的毕赤酵母重组菌YZ002。阳性转化子鉴定采用引物YW502+YW509进行PCR鉴定。
引物列表如表1所示：
表1实施例中所使用的引物列表
实施例3毕赤酵母重组菌YZ002的SDS-PAGE分析
BMGY培养基：1％酵母粉，2％蛋白胨，1.34％YND，0.1mol/L pH 6.0磷酸缓冲液，1％甘油，生物素4×10-5％。
BMMY培养基：1％酵母粉，2％蛋白胨，1.34％YND，0.1mol/L pH 6.0磷酸缓冲液，2％甲醇，生物素4×10-5％。
毕赤酵母重组菌的SDS-PAGE分析如下：接种毕赤酵母重组菌于BMGY培养基中于30℃过夜培养，随后转接于50mL新鲜BMGY培养基中使得初始OD600为0.1，30℃培养至OD600为6.0，4000rpm离心10min，收集菌体，用50mL BMMY培养基重悬至OD600为1.0进行培养，每隔24h向培养基中添加100％的甲醇至终浓度为1％。诱导表达72h后，取上清用SDS-PAGE分析蛋白表达量。制胶与电泳如下，使用10％的凝胶配方10mL(3.3mL ddH20，4mL 30％丙稀酰胺溶液，2.5mL 1.5mol/L Tris-HCl(pH 8.8)，0.1mL 10％SDS，0.1mL10％过硫酸铵溶液，4μLTEMED)混匀倒胶后，加适量纯化水覆盖于胶面上以保持胶面平整。30min后待分离胶凝固后，倒掉纯化水，用滤纸吸干水分并加入浓缩胶(2.7mL ddH20，0.67mL 30％丙稀酰胺溶液，0.5mL1mol/LTris-HCl(pH 6.8)，40μL 10％SDS，40μL10％过硫酸铵溶液，1μL TEMED)，插入梳子，将蛋白样品上样，电泳(200V，时间约为1h)，电泳后浸于考马斯亮蓝染色液中，染色l-2h，最后用脱色液反复脱色直至背景无色。
实施例3毕赤酵母重组菌的高密度发酵
接种YZ002用于高密度发酵，以10％接种量接种于含有无机盐培养基的20L发酵罐，用氨水、氢氧化钾、磷酸调pH至5.0，温度为30℃，调节转速与通气量控制溶氧在20％以上。当培养基中甘油消耗完后，溶氧快速上升(DO﹥60％)，随即开始流加含有PTM1的50％甘油200mL，流速50ml/h。流加结束后饥饿30min，流加含有PTM1的100％甲醇进行诱导，控制比生长速率在0.015h-1左右，调节转速与通气量控制溶氧大于20％，诱导后每12h分别取样，测定目的蛋白含量与菌体湿重。发酵培养基配方如下：(NH4)2SO4 20g/L，KH2PO4 12g/L，MgSO44.7g/L，CaCl2·2H2O 0.36g/L，甘油40g/L，PTM1 4.35ml/L，用5mol/L的KOH调pH到5.0。甲醇诱导72小时后，离心收集上清液，待用。
实施例4左旋多巴的合成
向水中投放初始丙酮酸，用浓氨水控制pH在7.0-9.0，再一次投加抗氧化剂、螯合剂、铵盐、5-磷酸吡哆醛，以及抗氧化剂亚硫酸钠和螯合剂EDTA，再次用浓氨水将pH控制在7.0-9.0，加入实施例3获得的上清液，通入氮气，调整温度至反应温度25℃，氨水调节pH至7.0-9.0，加入邻苯二酚开始反应；初始基础底物邻苯二酚与丙酮酸投放摩尔比为1:1-1.5。之后，每5-15min分别投加邻苯二酚和丙酮酸为2g/L。反应过程中的补料间隔时间由反应液中邻苯二酚的残留量而定：邻苯二酚的存在对酶会有不可逆转的抑制作用，但这种抑制作用不会立即显现，随着反应的进行，反应液中酶的酶活也会逐渐下降，邻苯二酚残留会逐渐增加。因此，反应前期补料速度较快，之后逐渐降低补料速度。当邻苯二酚残留量低于1g/L，补料速度一般可控制在5-8min/次，当邻苯二酚残留量为1-3g/L，补料速度一般可控制在8-12min/次，当邻苯二酚残留量为3-5g/L，补料速度一般可控制在12-15min/次。当底物邻苯二酚残留≥5g/L时，停止投料，继续搅拌2-3h后反应结束，反应总时长18小时。转化液中左旋多巴最大浓度浓度为120.8g/L，如图3所示。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求保护范围内。
序列表
<110> 浙江工业大学
长兴制药股份有限公司
<120> 一种重组毕赤酵母工程菌及其在合成左旋多巴中的应用
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1371
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgatttacc cggccgaacc gtttcgcatt aagagcgtgg agaccgtgag catgatcccg 60
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<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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35 40 45
Thr Asp Ser Gly Thr Asn Ala Met Ser Asp Lys Gln Trp Ala Gly Met
50 55 60
Met Met Gly Asp Glu Ala Tyr Ala Gly Ser Val Asn Phe Tyr His Leu
65 70 75 80
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85 90 95
His Gln Gly Arg Gly Ala Glu Asn Leu Leu Ser Gln Leu Ala Ile Lys
100 105 110
Pro Gly Gln Tyr Val Ala Gly Asn Met Tyr Phe Thr Thr Thr Arg Tyr
115 120 125
His Gln Glu Lys Asn Gly Ala Ser Phe Val Asp Ile Val Arg Asp Glu
130 135 140
Ala His Asp Ala Thr Leu Asn Val Pro Phe Lys Gly Asn Ile Asp Leu
145 150 155 160
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165 170 175
Tyr Ile Cys Leu Ala Val Thr Val Asn Leu Ala Gly Gly Gln Pro Val
180 185 190
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195 200 205
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260 265 270
Asp Leu Phe Ser Gln Ala Arg Glu Leu Val Val Val Tyr Glu Gly Met
275 280 285
Pro Ser Tyr Gly Gly Leu Ala Gly Arg Asp Met Glu Ala Met Ala Ile
290 295 300
Gly Leu Arg Glu Ala Met Gln Phe Glu Tyr Ile Glu His Arg Ile Lys
305 310 315 320
Gln Val Arg Tyr Leu Gly Asp Lys Leu Lys Ala Ala Gly Val Pro Ile
325 330 335
Val Glu Pro Val Gly Gly His Ala Val Phe Leu Asp Ala Arg Arg Phe
340 345 350
Cys Pro His Leu Ser Gln Glu Glu Phe Pro Ala Gln Ser Leu Ala Ala
355 360 365
Ser Ile Tyr Val Glu Thr Gly Val Arg Ser Met Glu Arg Gly Ile Ile
370 375 380
Ser Ala Gly Arg Asn Lys Glu Thr Gly Glu His His Lys Pro Lys Leu
385 390 395 400
Glu Thr Val Arg Leu Thr Ile Pro Arg Arg Val Tyr Thr Tyr Ala His
405 410 415
Met Asp Val Val Ala Asp Gly Ile Ile Gln Leu Tyr Lys His Lys Glu
420 425 430
Asp Ile Arg Gly Leu Arg Phe Thr Tyr Glu Pro Lys Gln Leu Arg Phe
435 440 445
Phe Thr Ala Arg Phe Glu Tyr Ile
450 455
<210> 3
<211> 1371
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgatctacc cagctgaacc attcagaatc aagtctgttg aaactgtttc tatgatccca 60
agagacgaaa gattgaagaa gatggaagaa gctggtttga acactttctt gttgaactct 120
aaggacgttt acatcgactt gttgactgac tctggtacta acgctatgtc tgacaagcaa 180
tgggctggta tgatgatggg tgacgaagct tacgctggtt ctgttaactt ctaccacttg 240
gaagctactg ttagagaatt gttcggtttc aagcacatcg ttccaactca ccaaggtaga 300
ggtgctgaaa acttgttgtc tcaattggct atcaagccag gtcaatacgt tgctggtaac 360
atgtacttca ctactactag ataccaccaa gaaaagaacg gtgcttcttt cgttgacatc 420
gttagagacg aagctcacga cgctactttg aacgttccat tcaagggtaa catcgacttg 480
aacaagttgc aaaagttgat cgacgaaaag ggtgctaaga acatcgctta catctgtttg 540
gctgttactg ttaacttggc tggtggtcaa ccagtttcta tggaaaacat gagagctgtt 600
agagaattga cttctgctca cggtatcaag gtttactacg acgctactag atgtgttgaa 660
aacgcttact acatcaagga acaagaaaag ggtttcgaaa acaagtctat caaggaaatc 720
gttcacgaaa tgttctctta cgctgacggt tgtactatgt ctggtaagaa ggactgtttg 780
gttaacatcg gtggtttctt gtgtatgaac gacgacgact tgttctctca agctagagaa 840
ttggttgttg tttacgaagg tatgccatct tacggtggtt tggctggtag agacatggaa 900
gctatggcta tcggtttgag agaagctatg caattcgaat acatcgaaca cagaatcaag 960
caagttagat acttgggtga caagttgaag gctgctggtg ttccaatcgt tgaaccagtt 1020
ggtggtcacg ctgttttctt ggacgctaga agattctgtc cacacttgtc tcaagaagaa 1080
tttccagctc aatctttggc tgcttctatc tacgttgaaa ctggtgttag atctatggaa 1140
agaggtatca tctctgctgg tagaaacaag gaaactggtg aacaccacaa gccaaagttg 1200
gaaactgtta gattgactat cccaagaaga gtttacactt acgctcacat ggacgttgtt 1260
gctgacggta tcatccaatt gtacaagcac aaggaagaca tcagaggttt gagattcact 1320
tacgaaccaa agcaattgag attcttcact gctagattcg aatacatcta a 1371
<210> 4
<211> 915
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Ala Thr Gly Cys Cys Cys Gly Thr Ala Gly Ala Thr Thr Cys Thr Thr
1 5 10 15
Cys Thr Cys Ala Thr Ala Ala Gly Ala Cys Ala Gly Cys Thr Ala Gly
20 25 30
Cys Cys Cys Ala Cys Thr Thr Cys Cys Ala Cys Cys Thr Cys Gly Thr
35 40 45
Ala Ala Ala Ala Gly Ala Gly Cys Ala Ala Ala Gly Ala Cys Gly Gly
50 55 60
Ala Ala Gly Ala Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Cys Ala
65 70 75 80
Gly Cys Gly Thr Cys Gly Ala Gly Thr Gly Gly Ala Ala Cys Gly Thr
85 90 95
Ala Thr Cys Cys Thr Ala Cys Gly Thr Ala Ala Thr Ala Gly Gly Ala
100 105 110
Gly Ala Gly Cys Gly Gly Cys Cys Cys Ala Thr Gly Cys Thr Thr Cys
115 120 125
Cys Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Ala Gly Ala Ala Ala Cys Gly Ala
130 135 140
Ala Gly Ala Cys Ala Cys Gly Thr Thr Gly Ala Ala Thr Thr Thr Cys
145 150 155 160
Thr Gly Gly Ala Ala Ala Ala Cys Cys Ala Cys Gly Thr Cys Gly Thr
165 170 175
Cys Gly Ala Cys Cys Thr Gly Gly Ala Ala Thr Cys Thr Gly Cys Ala
180 185 190
Cys Thr Thr Cys Ala Ala Gly Ala Ala Thr Cys Ala Gly Cys Cys Ala
195 200 205
Ala Ala Gly Cys Cys Ala Cys Thr Ala Ala Cys Ala Ala Gly Thr Thr
210 215 220
Gly Ala Ala Ala Gly Ala Ala Ala Thr Ala Cys Ala Ala Gly Ala Thr
225 230 235 240
Ala Thr Cys Ala Thr Thr Gly Thr Thr Thr Cys Ala Ala Gly Gly Thr
245 250 255
Thr Gly Gly Ala Ala Gly Cys Cys Thr Thr Ala Gly Gly Thr Gly Gly
260 265 270
Thr Ala Cys Cys Gly Thr Cys Thr Cys Ala Gly Ala Thr Thr Thr Gly
275 280 285
Gly Ala Thr Thr Thr Ala Ala Cys Ala Gly Thr Thr Cys Cys Gly Gly
290 295 300
Ala Ala Gly Thr Cys Gly Ala Thr Thr Thr Thr Cys Cys Cys Ala Ala
305 310 315 320
Ala Thr Cys Thr Thr Cys Thr Gly Ala Thr Thr Thr Gly Gly Ala Ala
325 330 335
Cys Cys Cys Ala Thr Gly Thr Cys Thr Gly Ala Thr Cys Thr Cys Thr
340 345 350
Cys Ala Ala Cys Thr Thr Cys Thr Thr Cys Gly Ala Ala Ala Thr Cys
355 360 365
Gly Gly Ala Gly Ala Ala Ala Gly Cys Ala Thr Cys Thr Ala Cys Ala
370 375 380
Thr Cys Cys Ala Cys Thr Cys Gly Cys Ala Gly Ala Thr Cys Thr Thr
385 390 395 400
Thr Gly Ala Cys Thr Gly Ala Gly Gly Ala Thr Cys Thr Gly Gly Ala
405 410 415
Cys Gly Ala Ala Gly Ala Thr Gly Ala Cys Gly Thr Cys Gly Cys Thr
420 425 430
Gly Ala Ala Thr Ala Thr Gly Ala Cys Gly Ala Cys Gly Ala Ala Gly
435 440 445
Ala Ala Gly Ala Gly Gly Ala Cys Gly Ala Ala Gly Ala Gly Thr Thr
450 455 460
Ala Cys Cys Cys Ala Gly Gly Ala Ala Ala Ala Thr Gly Ala Ala Ala
465 470 475 480
Gly Thr Cys Thr Thr Ala Ala Ala Cys Gly Ala Cys Ala Ala Ala Ala
485 490 495
Ala Cys Ala Ala Gly Ala Gly Cys Ala Cys Ala Thr Cys Thr Ala Thr
500 505 510
Cys Ala Ala Gly Cys Ala Gly Gly Ala Gly Ala Ala Gly Thr Thr Gly
515 520 525
Ala Ala Thr Gly Ala Ala Cys Thr Thr Cys Cys Ala Thr Cys Thr Cys
530 535 540
Cys Thr Thr Thr Gly Thr Cys Ala Thr Cys Cys Gly Ala Thr Thr Thr
545 550 555 560
Thr Thr Cys Ala Gly Ala Cys Gly Thr Ala Gly Ala Thr Gly Ala Ala
565 570 575
Gly Ala Ala Ala Ala Gly Thr Cys Ala Ala Cys Thr Cys Thr Cys Ala
580 585 590
Cys Ala Cys Ala Thr Thr Thr Ala Ala Ala Gly Thr Thr Gly Cys Ala
595 600 605
Ala Cys Ala Gly Cys Ala Ala Cys Ala Ala Cys Ala Ala Cys Ala Ala
610 615 620
Cys Cys Ala Gly Thr Ala Gly Ala Cys Ala Ala Thr Thr Ala Thr Gly
625 630 635 640
Thr Thr Thr Cys Thr Ala Cys Thr Cys Cys Thr Thr Thr Gly Ala Gly
645 650 655
Thr Cys Thr Thr Cys Cys Gly Gly Ala Gly Gly Ala Thr Thr Cys Ala
660 665 670
Gly Thr Thr Gly Ala Thr Thr Thr Thr Ala Thr Thr Ala Ala Cys Cys
675 680 685
Cys Ala Gly Gly Thr Ala Ala Cys Thr Thr Ala Ala Ala Ala Ala Thr
690 695 700
Ala Gly Ala Gly Thr Cys Cys Gly Ala Thr Gly Ala Gly Ala Ala Cys
705 710 715 720
Thr Thr Cys Thr Thr Gly Thr Thr Gly Ala Gly Thr Thr Cys Ala Ala
725 730 735
Ala Thr Ala Cys Thr Thr Thr Ala Cys Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala
740 745 750
Ala Cys Ala Cys Gly Ala Ala Ala Ala Thr Gly Ala Cys Ala Cys Cys
755 760 765
Gly Ala Cys Thr Ala Cys Ala Thr Thr Ala Cys Thr Ala Cys Ala Gly
770 775 780
Cys Thr Cys Cys Ala Thr Cys Ala Gly Gly Thr Thr Cys Cys Ala Thr
785 790 795 800
Cys Ala Ala Thr Gly Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ala Ala Thr
805 810 815
Thr Cys Thr Thr Ala Thr Gly Ala Cys Ala Thr Thr Ala Gly Cys Gly
820 825 830
Ala Gly Thr Cys Gly Ala Ala Thr Cys Gly Gly Thr Thr Gly Cys Ala
835 840 845
Thr Cys Ala Thr Cys Cys Ala Gly Cys Ala Gly Cys Ala Cys Cys Ala
850 855 860
Thr Thr Thr Ala Cys Cys Gly Cys Thr Ala Ala Thr Gly Cys Ala Thr
865 870 875 880
Thr Thr Gly Ala Thr Thr Thr Ala Ala Ala Thr Gly Ala Cys Thr Thr
885 890 895
Thr Gly Thr Ala Thr Thr Cys Thr Thr Cys Cys Ala Gly Gly Ala Ala
900 905 910
Thr Ala Gly
915
<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gatcgaattc atgatctacc cagctgaacc attc 34
<210> 6
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ataagctagc ggccgcttag atgtattcga atctagcagt gaa 43
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atacactagc agcagaccgt tgc 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cagacatagt acaaccgtca gcg 23
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gcattagctg ctccagtcaa cact 24
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atcttctgta ctctgaagag gagtgg 26
<210> 11
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gatcgaattc atgcccgtag attcttctca taaga 35
<210> 12
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ataagctagc ggccgcctat tcctggaaga atacaaagtc att 43
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gcttccaacc ttgaaacaat gat 23

Claims (8)

1.一种重组毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述重组毕赤酵母工程菌通过如下方法获得：将SEQ ID NO.1所示的酪氨酸酚裂解酶(TPL)的DNA序列进行密码子优化后，转入到毕赤酵母GS115，构建重组毕赤酵母YZ001，随后将SEQ ID NO.4所示的HAC1在毕赤酵母YZ001中过量表达，构建获得重组毕赤酵母工程菌YZ002。
2.如权利要求1所述的重组毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述重组毕赤酵母工程菌的制备方法具体为：
(1)将SEQ ID NO.1所示的酪氨酸酚裂解酶(TPL)的DNA序列进行密码子优化后克隆至毕赤酵母表达载体pPIC9K而获得的表达载体pPIC9K-TPL，将pPIC9K-TPL线性化后，转入毕赤酵母GS115获得重组毕赤酵母YZ001；
(2)将SEQ ID NO.4所示的HAC1与pPICZαA载体连接，构建pPICZαA-HAC1质粒，将pPICZαA-HAC1线性化后转入到毕赤酵母YZ001，构建获得重组毕赤酵母工程菌YZ002。
3.一种如权利要求1-2所述的重组毕赤酵母工程菌作为催化剂的用途。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述用途进一步为合成左旋多巴的用途。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述重组毕赤酵母工程菌经过发酵和离心后的上清液用于催化合成左旋多巴。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述发酵和离心后收集的菌体可重新添加培养基，进行下一批的发酵。
7.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述发酵步骤为：将重组酵母工程菌接种于YPD培养基过夜培养，随后以10％的接种量接种于含有无机盐培养基的20L发酵罐中，流加甲醇诱导72小时。
8.一种左旋多巴的合成方法，该方法以邻苯二酚，丙酮酸和醋酸铵为底物，以权利要求5-7任一项所述的上清液作为催化剂合成左旋多巴。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109929889A (zh) * 2019-03-29 2019-06-25 安徽华恒生物科技股份有限公司 一种l-酪氨酸的制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR970042594A (ko) * 1995-12-29 1997-07-24 김은영 재조합 내열성 티로신 페놀리아제 및 이를 이용한 l-dopa의 제조방법
CN106754846A (zh) * 2016-12-02 2017-05-31 浙江工业大学 一种具核梭杆菌酪氨酸酚裂解酶突变体、基因、载体、工程菌及其应用
CN107325996A (zh) * 2017-05-03 2017-11-07 浙江绿创生物科技有限公司 一种酪氨酸酚裂解酶工程菌及其构建方法与应用
CN109439605A (zh) * 2018-05-14 2019-03-08 浙江工业大学 提高酪氨酸酚裂解酶稳定性的工程菌及其构建方法与应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR970042594A (ko) * 1995-12-29 1997-07-24 김은영 재조합 내열성 티로신 페놀리아제 및 이를 이용한 l-dopa의 제조방법
CN106754846A (zh) * 2016-12-02 2017-05-31 浙江工业大学 一种具核梭杆菌酪氨酸酚裂解酶突变体、基因、载体、工程菌及其应用
CN107325996A (zh) * 2017-05-03 2017-11-07 浙江绿创生物科技有限公司 一种酪氨酸酚裂解酶工程菌及其构建方法与应用
CN109439605A (zh) * 2018-05-14 2019-03-08 浙江工业大学 提高酪氨酸酚裂解酶稳定性的工程菌及其构建方法与应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
XIAO‑LING TANG等: "Process development for efficient biosynthesis of l-DOPA with recombinant Escherichia coli harboring tyrosine phenol lyase from Fusobacterium nucleatum", 《BIOPROCESS AND BIOSYSTEMS ENGINEERING》 *
关波等: "改良毕赤酵母分泌表达外源蛋白能力的研究进展", 《微生物学报》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109929889A (zh) * 2019-03-29 2019-06-25 安徽华恒生物科技股份有限公司 一种l-酪氨酸的制备方法
CN109929889B (zh) * 2019-03-29 2022-10-21 安徽华恒生物科技股份有限公司 一种l-酪氨酸的制备方法

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