CN109929889B

CN109929889B - 一种l-酪氨酸的制备方法

Info

Publication number: CN109929889B
Application number: CN201910246367.4A
Authority: CN
Inventors: 韩成秀; 郭恒华; 张冬竹; 刘树蓬; 章晖; 田宋魁
Original assignee: Anhui Huaheng Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Anhui Huaheng Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-03-29
Filing date: 2019-03-29
Publication date: 2022-10-21
Anticipated expiration: 2039-03-29
Also published as: CN109929889A

Abstract

本发明属于酶催化领域，具体涉及一种L‑酪氨酸的制备方法，以L‑丙氨酸和苯酚为原料，以D‑氨基酸氧化酶、丙氨酸消旋酶、过氧化氢酶和酪氨酸酚裂解酶为催化剂，以含氧气体为氧化剂，多酶偶联合成L‑酪氨酸。采用上述方案，反应简单、易于操作；底物L‑丙氨酸和苯酚都是较为经济和便于获得的原料，L‑丙氨酸市售价格约为两万元每吨，与现有技术中以丙酮酸为底物的制备方法相比，成本投入更低；中间产物丙酮酸和氨根离子又进一步参与到后续反应中，无中间产物堆积现象，并且中间产物的消耗也进一步加快了L‑丙氨酸的反应速率；最终产物L‑酪氨酸生成后即在混合液中结晶，便于分离提纯。

Description

一种L-酪氨酸的制备方法

技术领域

本发明属于酶催化领域，具体涉及一种L-酪氨酸的制备方法。

背景技术

L-酪氨酸(L-Tyrosine)是一种重要的生化试剂，是合成多肽类激素、抗生素、L-多巴等药物的主要原料，广泛地应用于医药、食品添加剂、生物化工和饲料等领域，在医药上能用作甲状腺功能亢进症治疗。

目前制备L-酪氨酸的方法主要有三种：一是蛋白水解法，利用天然蛋白资源，如人发、猪毛、猪血粉等为原料，经水解、提取、精制等步骤分离得到L-酪氨酸，由于蛋白水解液中含有多种氨基酸，尤其L-胱氨酸的等电点和溶解度和L-酪氨酸接近，所以L-酪氨酸不易提纯，提纯成本高，杂质多；二是发酵法，发酵培养大肠杆菌基因工程菌，在合适的培养基和培养条件下，可发酵直接产生L-酪氨酸，但产量很低，只有8～15mg/L，例如申请号为201410706579.3的专利；三是酶催化法，以苯酚、丙酮酸、氯化铵为原料，再利用酶催化发生产L-酪氨酸，例如申请号为201610511684.0的专利，用丙酮酸、苯酚和氯化铵加入β-酪氨酸酶进行酶催化反应，该方法也利用等电点提取，收率高，纯度高，但丙酮酸市售价格约为九万元每吨，成本高，投入工业生产后经济价值较低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种原料成本低、制备方法简单、产品产量高的L-酪氨酸的制备方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种L-酪氨酸的制备方法，以L-丙氨酸和苯酚为原料，以D-氨基酸氧化酶、丙氨酸消旋酶、过氧化氢酶和酪氨酸酚裂解酶为催化剂，以含氧气体为氧化剂，多酶偶联合成L-酪氨酸。

所述制备方法包括如下步骤：

A)向L-丙氨酸溶液中添加苯酚，搅拌均匀，得到转化液A；

B)向转化液A中加入氨基酸氧化酶、过氧化氢酶和酪氨酸酚裂解酶，得到混合液B；

C)向混合液B中通入含有氧气的气体，反应5～10小时后混合液中析出的晶体即为L-酪氨酸晶体。

采用上述方案，以L-丙氨酸、苯酚为原料，再加入D-氨基酸氧化酶、丙氨酸消旋酶、过氧化氢酶、酪氨酸酚裂解酶，在有氧环境下反应产生L-酪氨酸，其中，L-丙氨酸在酶的催化作用下先生成丙酮酸和氨根离子，再进一步反应生产L-酪氨酸，反应简单、易于操作；底物L-丙氨酸和苯酚都是较为经济和便于获得的原料，L-丙氨酸市售价格约为两万元每吨，与现有技术中以丙酮酸为底物的制备方法相比，成本投入更低；中间产物丙酮酸和氨根离子又进一步参与到后续反应中，无中间产物堆积现象，并且中间产物的消耗也进一步加快了L-丙氨酸的反应速率；最终产物L-酪氨酸生成后即在混合液中结晶，便于分离提纯。

具体地，所述步骤A)中，搅拌均匀后，调节溶液pH值至6.0～8.0，温度保持在20～40℃；L-丙氨酸的浓度为5～15g/L，苯酚的浓度为5～15g/L。

优选的，四种酶添加后，混合液B中四种酶的浓度分别为：过氧化氢酶0.1～1U/mL；丙氨酸消旋酶0.1～1U/mL；D-丙氨酸氧化酶0.1～1U/mL；酪氨酸酚裂解酶0.1～1U/mL。为便于产物分离提纯，四种酶以粗酶形式加入体系中参与反应。

所用酶制剂可以自行发酵培养获得，也可以在市场购买，例如发明人在试验过程中所用的过氧化氢粗酶即为庞博生物所售粗酶产品，酶活力5万U/g(每分钟降解1μmol过氧化氢为1个酶活力单位U)。所用的丙氨酸消旋酶是按照专利CN201310229268.8构建的大肠杆菌工程菌生产的，丙氨酸消旋酶的酶活定义如下：每分钟消旋L-丙氨酸生成1μmol的D-丙氨酸为1个酶活力单位U。构建双酶质粒工程菌生产D-丙氨酸氧化酶和L-酪氨酸酚裂解酶，将D-丙氨酸氧化酶基因和酪氨酸酚裂解酶基因同时连入到表达载体上，构建表达载体质粒，再将表达质粒导入到受体大肠杆菌中得到。D-丙氨酸氧化酶基因来源于纤细红酵母(Rhodotorula glutinis)，氨基酸序列如下：

酪氨酸酚裂解酶基因来源于嗜热链球菌(Symbiobacterium thermophilum)，氨基酸序列如下：

D-丙氨酸氧化酶的酶活定义如下：每分钟消耗D-丙氨酸生产1μmol丙酮酸为一个酶活力单位U。

酪氨酸酚裂解酶的酶活力定义如下：每分钟消耗丙酮酸生产1μmol酪氨酸为一个酶活力单位U。

所述步骤C)中通入含氧气体的量为：每毫升混合液B通入含氧气体1～3ml/min；含氧气体可以为空气。反应结束的判断方法为：反应开始后，每半小时用高效液相色谱仪检测一次混合液中L-丙氨酸和L-酪氨酸的含量，至L-丙氨酸无法检测到时，结束反应。

附图说明

图1为实施例1-3反应过程中L-酪氨酸转化率随反应时间变化折线图。

具体实施方式

一、制备

实施例1

A)配制L-丙氨酸溶液并向溶液中添加苯酚，搅拌均匀，得到转化液A，其中L-丙氨酸浓度为5g/L，苯酚浓度为5g/L，水浴加热至40℃；

B)向转化液A中加入D-氨基酸氧化酶粗酶、丙氨酸消旋酶、过氧化氢酶粗酶和酪氨酸酚裂解酶粗酶，得到混合液B，其中，D-氨基酸氧化酶浓度为0.5U/ml，过氧化氢酶浓度为0.5U/ml，酪氨酸酚裂解酶浓度为0.5U/ml，丙氨酸消旋酶浓度为0.6U/ml；

C)向混合液B中通入空气，每毫升混合液B通入空气2ml/min，在40℃搅拌条件下开始反应，每半小时用HPLC检测体系中L-丙氨酸和L-酪氨酸的含量，直至7小时后L-丙氨酸浓度低于0.1g/L，结束反应，得到L-酪氨酸溶液。

实施例2

A)配制L-丙氨酸溶液并向溶液中添加苯酚，搅拌均匀，得到转化液A，其中L-丙氨酸浓度为10g/L，苯酚浓度为10g/L，水浴加热至40℃；

B)向转化液A中加入D-氨基酸氧化酶粗酶、丙氨酸消旋酶、过氧化氢酶粗酶和酪氨酸酚裂解酶粗酶，得到混合液B，其中，D-氨基酸氧化酶浓度为0.4U/ml，丙氨酸消旋酶浓度为0.7U/ml，过氧化氢酶浓度为0.1U/ml，酪氨酸酚裂解酶浓度为0.4U/ml；

C)向混合液B中通入空气，每毫升混合液B通入空气1ml/min，在40℃搅拌条件下开始反应，每半小时用HPLC检测体系中L-丙氨酸和L-酪氨酸的含量，直至6小时后L-丙氨酸浓度低于0.1g/L，结束反应，得到L-酪氨酸溶液。

实施例3

A)配制L-丙氨酸溶液并向溶液中添加苯酚，搅拌均匀，得到转化液A，其中L-丙氨酸浓度为8g/L，苯酚浓度为8.5g/L，水浴加热至40℃；

B)向转化液A中加入D氨基酸氧化酶粗酶、丙氨酸消旋酶粗酶，过氧化氢酶粗酶和酪氨酸酚裂解酶粗酶，得到混合液B，其中，氨基酸氧化酶浓度为1U/ml，丙氨酸消旋酶浓度为1U/ml，过氧化氢酶浓度为1U/ml，酪氨酸酚裂解酶浓度为1U/ml；

C)向混合液B中通入空气，每毫升混合液B通入空气2ml/min，在40℃搅拌条件下开始反应，每半小时用HPLC检测体系中L-丙氨酸和L-酪氨酸的含量，直至5小时后L-丙氨酸浓度低于0.1g/L，结束反应，得到L-酪氨酸溶液。

二、检测

1、将实施例3中步骤C)在反应过程中，每半小时用高效液相色谱仪检测体系中L-丙氨酸和L-酪氨酸的含量，选用PerkinElmerSeries200高效液相色谱仪检测分析，配示差折光检测器；色谱条件为：流动相是甲醇-0.1％甲酸水(40:60)、采用汉邦MegresC18色谱柱(4.6×250mm，5μm)，流速1ml/min、柱温30℃、进样量20μl。

将检测到的L-丙氨酸和L-酪氨酸含量后计算转化率记录入表1，并画出转化率折线图，见附图1。

表1转化率随反应时间变化数据

反应时间h	0	0.5	1	1.5	2	2.5	3	3.5	4	4.5	5	5.5	6	6.5	7
																L-丙氨酸g/L	8.02	6.64	5.40	4.70	3.72	2.91	2.53	2.01	1.74	1.50	1.30	1.10	0.89	1.68	0.08
苯酚g/L	8.47	7.02	5.90	4.96	3.94	2.99	2.65	2.14	1.80	1.63	1.37	1.20	0.94	0.77	0.07
																L-酪氨酸g/L	0.00	2.84	5.12	6.92	9.00	10.80	11.56	12.51	13.27	13.55	14.12	14.50	14.97	15.35	15.92

由表1数据计算实施例3中L-丙氨酸和苯酚的转化率为96.7％。采用同样的方法，检测并计算实施例1和实施例2中L-丙氨酸和苯酚的转化率分别为91.9％和92.3％.可见，本发明的制备L-酪氨酸的方法转化率高于90％，甚至最高可达96％以上。

<110> 安徽华恒生物科技股份有限公司

<120> 一种L-酪氨酸的制备方法

<160> 368

<210> 1

<211> 368

<212> PRT

<213> Rhodotorula glutinis

<400> 1

1 MET His Ser Gln Lys Arg Val Val Val Leu Gly Ser Gly Val Ile

16 Gly Leu Ser Ser Ala Leu Ile Leu Ala Arg Lys Gly Tyr Ser Val

31 His Ile Val Ala Arg Asp Leu Pro Glu Asp Val Ser Ser Gln Thr

46 Phe Ala Ser Pro Trp Ala Gly Ala Asn Trp Thr Pro Phe MET Ser

61 Leu Thr Asp Gly Pro Arg Gln Ala Lys Trp Glu Glu Leu Thr Phe

76 Lys Lys Trp Val Glu Leu Val Pro Thr Gly Gln Val MET Trp Leu

91 Lys Gly Thr Arg Arg Phe Ala Gln Asn Glu Asp Gly Leu Leu Gly

106 His Trp Tyr Lys Asp Ile Thr Pro Asn Tyr Arg Pro Leu Pro Ser

121 Ser Glu Cys Pro Pro Asn Ser Ile Gly Val Thr Tyr Asp Thr Leu

136 Ser Val His Ala Pro Lys Tyr Cys Gln Tyr Leu Ala Arg Gly Leu

151 Gln Lys Leu Gly Ala Thr Phe Glu Arg Arg Thr Val Thr Ser Val

166 Glu Gln Ala Phe Glu Gly Val Asp Leu Val Val Asn Ala Thr Gly

181 Leu Gly Ala Lys Ser Ile Ala Gly Ile Asp Asp Gln Ala Ala Glu

196 Pro Ile Arg Gly Gln Thr Val Leu Val Lys Ser Ala Cys Lys Arg

211 Cys Thr MET Asp Ser Ser Asp Pro Ser Ser Pro Ala Tyr Ile Ile

226 Pro Arg Pro Gly Gly Glu Val Ile Cys Gly Gly Thr Tyr Gly Val

241 Gly Asp Trp Asp Leu Ser Val Asn Pro Glu Thr Val Gln Arg Ile

256 Leu Lys His Cys Leu Arg Leu Asp Pro Ser Ile Ser Ser Asp Gly

271 Thr Ile Glu Gly Ile Glu Val Leu Arg His Asn Val Gly Leu Arg

286 Pro Ala Arg Arg Gly Gly Pro Arg Val Glu Ala Glu Arg Leu Val

301 Leu Pro Leu Asp Arg Ser Lys Ser Pro Leu Ser Leu Gly Lys Gly

316 Thr Thr Arg Ala Ala Lys Glu Lys Glu Val Thr Leu Val His Ala

331 Tyr Gly Phe Ser Ser Ala Gly Tyr Gln Gln Ser Trp Gly Ala Ala

346 Glu Asp Val Ala Leu Leu Val Glu Glu Ala Phe Gln Arg Tyr His

361 Gly Ala Ala Arg Glu Ser Lys Leu

<210> 2

<211> 458

<212> PRT

<213> Symbiobacterium thermophilum

<400> 2

1 Met Gln Arg Pro Trp Ala Glu Pro Tyr Lys Ile Lys Ala Val Glu

16 Pro Ile Arg Met Thr Thr Arg Glu Tyr Arg Glu Gln Ala Ile Arg

31 Glu Ala Gly Tyr Asn Thr Phe Leu Leu Arg Ser Glu Asp Val Tyr

46 Ile Asp Leu Leu Thr Asp Ser Gly Thr Asn Ala Met Ser Asp Arg

61 Gln Trp Gly Ala Leu Met Met Gly Asp Glu Ala Tyr Ala Gly Ala

76 Arg Ser Phe Phe Arg Leu Glu Glu Ala Val Arg Glu Ile Tyr Gly

91 Phe Lys Tyr Val Val Pro Thr His Gln Gly Arg Gly Ala Glu His

106 Leu Ile Ser Arg Ile Leu Ile Lys Pro Gly Asp Tyr Ile Pro Gly

121 Asn Met Tyr Phe Thr Thr Thr Arg Thr His Gln Glu Leu Gln Gly

136 Gly Thr Phe Val Asp Val Ile Ile Asp Glu Ala His Asp Pro Gln

151 Ala Asn His Pro Phe Lys Gly Asn Val Asp Ile Ala Lys Phe Glu

166 Ala Leu Ile Asp Arg Val Gly Ala Asp Lys Ile Pro Tyr Ile Asn

181 Val Ala Leu Thr Val Asn Met Ala Gly Gly Gln Pro Val Ser Met

196 Ala Asn Leu Arg Glu Val Arg Lys Val Cys Asp Arg His Gly Ile

211 Arg Met Trp Ser Asp Ala Thr Arg Ala Val Glu Asn Ala Tyr Phe

226 Ile Lys Glu Arg Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Lys Pro Val Arg Glu

241 Ile Leu Lys Glu Met Met Ser Tyr Phe Asp Gly Cys Thr Met Ser

256 Gly Lys Lys Asp Cys Leu Val Asn Ile Gly Gly Phe Leu Ala Met

271 Asn Glu Glu Trp Ile Leu Gln Lys Ala Arg Glu Gln Val Val Ile

286 Phe Glu Gly Met Pro Thr Tyr Gly Gly Leu Ala Gly Arg Asp Met

301 Glu Ala Ile Ala Gln Gly Ile Tyr Glu Met Val Asp Asp Asp Tyr

316 Ile Ala His Arg Ile His Gln Val Arg Tyr Leu Gly Glu Gln Leu

331 Leu Glu Ala Gly Ile Pro Ile Val Gln Pro Ile Gly Gly His Ala

346 Val Phe Leu Asp Ala Arg Ala Phe Leu Pro His Ile Pro Gln Asp

361 Gln Phe Pro Ala Gln Ala Leu Ala Ala Ala Leu Tyr Val Asp Ser

376 Gly Val Arg Ala Met Glu Arg Gly Ile Val Ser Ala Gly Arg Asn

391 Pro Gln Thr Gly Glu His Asn Tyr Pro Lys Leu Glu Leu Val Arg

406 Leu Thr Ile Pro Arg Arg Val Tyr Thr Asp Arg His Met Asp Val

421 Val Ala Tyr Ser Val Lys His Leu Trp Lys Glu Arg Asp Thr Ile

436 Arg Gly Leu Arg Met Val Tyr Glu Pro Pro Thr Leu Arg Phe Phe

451 Thr Ala Arg Phe Glu Pro Ile Ser

Claims

1.一种L-酪氨酸的制备方法，其特征在于：以L-丙氨酸和苯酚为原料，以D-氨基酸氧化酶、丙氨酸消旋酶、过氧化氢酶和酪氨酸酚裂解酶为催化剂，以含氧气体为氧化剂，多酶偶联合成L-酪氨酸；

具体包括如下步骤：

A)向L-丙氨酸溶液中添加苯酚，搅拌均匀，得到转化液A；

其中，L-丙氨酸的浓度为5～15g/L，苯酚的浓度为5～15g/L；

B)向转化液A中加入D-氨基酸氧化酶、丙氨酸消旋酶、过氧化氢酶和酪氨酸酚裂解酶，得到混合液B；

四种酶添加后，混合液B中四种酶的浓度分别为：过氧化氢酶0.1～1U/mL；丙氨酸消旋酶0.1～1U/mL；D-丙氨酸氧化酶0.1～1U/mL；酪氨酸酚裂解酶0.1～1U/mL；

C)向混合液B中通入含有氧气的气体，反应5～10小时后所得溶液即为L-酪氨酸溶液。

2.根据权利要求1所述的L-酪氨酸的制备方法，其特征在于：所述步骤A)中，调节溶液pH值至6.0～8.0，温度保持在20～40℃。

3.根据权利要求1所述的L-酪氨酸的制备方法，其特征在于：通入含氧气体的量为：每毫升混合液B通入含氧气体1～3ml/min。

4.根据权利要求1所述的L-酪氨酸的制备方法，其特征在于：反应结束的判断方法为：反应开始后，每半小时用高效液相色谱仪检测一次混合液中L-丙氨酸和L-酪氨酸的含量，至L-丙氨酸无法检测到时，结束反应。