CN101649344A - D-丙氨酸的生物法制备技术 - Google Patents

Abstract

一种D－丙氨酸的生物法制备技术，将经培养的种子菌种以2－15％(V/V)接种量转接到pH值6－8且含D，L－丙氨酸的发酵培养基中，在培养温度25－37℃，摇床转速100－200rpm，进行有氧发酵培养12－36h，再依次经过离心、脱色、离子交换和浓缩结晶后得到产品。本发明技术方案实现了从D，L－丙氨酸原料中快速而简便地制备D－丙氨酸。该方法能使D－丙氨酸的保留率在90％以上，相对于底物D，L－丙氨酸，目标产物的得率在45％以上，提高了该产品的经济效益。

Description

D-丙氨酸的生物法制备技术

技术领域

本发明属于酶工程领域，涉及一种氨基酸的生物转化方法，尤其涉及一种利用微生物细胞转化D，L-丙氨酸外消旋体系中的L-丙氨酸以制备D-丙氨酸的方法，更具体的涉及一种利用L-丙氨酸脱氨酶的高度专一性，将菌体胞内的L-丙氨酸分解为氨和丙酮酸，并得到D-丙氨酸的方法。

背景技术

丙氨酸是构成蛋白质的20种基本氨基酸之一，是血中氮的优良运输工具，又是一种有效的生糖氨基酸。D-丙氨酸是丙氨酸的一种立体构型，为非天然的氨基酸，不是蛋白质组成氨基酸和人体正常代谢氨基酸，现代研究表明，在医药、食品、化妆品等领域有重要用途。

在医药方面，D-丙氨酸是生产维生素B6的原料，有镇痛作用，它还可以做成输液注射、单剂或合剂(氨基酸的应用[J]，1996，154)。在法国，D-丙氨酸被用做防止颜面潮红的药物。近年的研究还发现D-丙氨酸具有其他生理活性方面的应用。D-丙氨酸可使体内氨基酸氧化酶(DAAO)在肿瘤细胞质中异位表达，阻止体内脂质氧化损伤，清除细胞毒性(辽宁化工[J]，2003，2，58-60)。D-丙氨酸还可以抑制致二甲基亚硝胺(DMNA)的致癌作用，有效抑制率为72.4％。具有伯胺基的D-丙氨酸能竞争性地替代仲胺与亚硝酸盐生成VAN Slyke反应，分解为氮气和有机酸，从而抑制了DMNA的生成。因此D-丙氨酸可以应用于肿瘤的预防。

在食品方面，D-丙氨酸具有丙氨酸的一些共性，即在食品添加剂方面的应用，主要供增味剂和调味料用，增加化学调味料的调味效果，改善人工甜味剂的味感，改善有机酸的酸味。另外，D-丙氨酸本身具有自己的特性，可以应用在功能性食用甜味剂方面。D-丙氨酸甜度高、安全、无热量，既适合普通人群消费，更适合肥胖和糖尿病人消费。D-丙氨酸是合成二肽甜味剂L-天冬氨酸-D-丙氨酸的原料之一(JP5276965)。

在化妆品方面，D-丙氨酸有抑菌作用，而且是自然保湿因子的主要成分，是角质层保持水分的重要角色。

目前D-丙氨酸的制备方法主要有生物法和化学法。

D-丙氨酸的化学法制备有两种，一种是利用不对称合成法直接得到D-丙氨酸，另一种是通过化学合成法得到DL-丙氨酸的混旋体，再利用各种光学拆分方法制备D-丙氨酸。

Yanakada在培养基中添加聚乙二醇，在30℃培养D-环丝氨酸抗性的短杆菌(乳酸发酵短杆菌DCSR-26)72h，可得高光学纯度D-丙氨酸(JP5276965)；Takeuchi等人报道用Brevibacterium lactofementum的抗D-环丝氨酸的突变株来发酵生成D-丙氨酸的研究，但由于丙氨酸消旋酶的作用，所得到的D-丙氨酸的光学纯度很低(EP0310949)。Yamada等人筛选出一株氯代D-丙氨酸抗性菌(乳酸发酵短杆菌HR5-43)，在950mL培养基中添加葡萄糖、生物素、维生素B、磷酸盐等，在pH6.0-8.0下发酵72h可得19.1g的D-丙氨酸，其光学纯度可达99％(JP5308981)。

Noriko Ito等利用Candida、Cryptococcus、Hansenura和Trichosporon同化L-丙氨酸而对D-丙氨酸不起作用的特点，开发了不对称降解DL-丙氨酸生物法制备D-丙氨酸的新工艺(US5,422,255)。

通过比较生物法和化学法发现，化学法生产D-丙氨酸污染大，效率低，光学纯度不高，并且设备费用昂贵。而发酵法菌种的筛选工作比较困难，发酵周期长，能耗高，产物浓度低，提取困难。而利用生物法对DL-丙氨酸外消旋体系中L-丙氨酸的高效转化制备D-丙氨酸，其工艺条件温和，无需高温高压，环境友好，且底物转化率和光学纯度都很高，成本较低，有重要的产业化应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种D-丙氨酸的生物法制备技术，利用微生物细胞中的L-丙氨酸脱氨酶将菌体胞内的L-丙氨酸分解为氨和丙酮酸，从而实现制备D-丙氨酸的方法。

本发明的另一个目的是提供一种L-丙氨酸的高效转化菌株合适培养方法。

本发明所述的用于L-丙氨酸转化的菌株为粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、格氏沙雷氏菌(Serratia grimesii)或其混合。

本发明所用的粪肠球菌为ATCC29212，仅作为满足本发明的充分公开而非限制，本领域技术人员还可以使用该种菌的其它菌株，如：但不仅限于，ATCC882、ATCC4083、ATCC10100、ATCC11832和ATCC29200等在ATCC列表中可以查询到的菌株，以实现本发明相同的目的。

本发明所用的格氏沙雷氏菌为ATCC35478，仅作为满足本发明的充分公开而非限制，本领域技术人员还可以使用该种菌的其它菌株，如：但不仅限于，ATCC14460、ATCC14461和ATCCBAA-1054，以实现本发明相同的目的。

培养本发明所述菌种的种子培养基组成为：牛肉膏5-10g、蛋白胨10-20g、磷酸二氢钾1-5g、硫酸镁0.2-1.0g和L-丙氨酸5-50g，用水定容至1000mL，pH为6.5-7.5。

种子培养时装液量为50-100mL/250mL三角瓶，接种量为一根长满的试管斜面，培养温度为25-37℃，优先选择30-37℃，摇床转速为100-200r/min，优先选择150-200r/min。

当种子培养基当中的L-丙氨酸脱氨酶酶活力大于1U/mL时(酶活力定义：1min转化1μmol的L-丙氨酸的酶量即为1U)，即可保藏作为发酵用的菌种或以此作为种子逐级传代并进行菌种选育或转入发酵培养基当中进行发酵培养。

本发明所述发酵培养为有氧发酵或厌氧发酵，其发酵培养基具体组成为：酵母膏5-20g、葡萄糖10-20g、蛋白胨5-20g、玉米浆5-10g、磷酸二氢钾1.0-2.0g、硫酸镁0.5-1.0g和D，L-丙氨酸5-200g，用水定容至1000mL，pH为7.0-7.5。

发酵培养时装液量为50-150mL/250mL三角瓶，接种量为2-10％，v/v，培养温度为25-37℃，摇床转速为100-200rpm。

本发明所述的菌种种子培养基、种子培养方法、发酵培养基和发酵培养方法，本领域技术人员还可以根据实际需要按各种组成、用量或体积进行整数倍扩大。如：当接种培养使用500mL烧杯时，装液量则为100-200mL，接种量则为二根长满的试管斜面，摇床转速则根据实际需要进行调整。

本发明所述的D-丙氨酸的生物法制备技术，其步骤如下：

1)将经培养的种子菌种以2-15％(V/V)接种量转接到发酵培养基中；

2)在培养温度25-37℃，摇床转速100-200rpm，进行有氧发酵培养12-36h，培养基的pH值控制在6-8之间；

3)当发酵液中丙氨酸含量不再减少时，将发酵液离心去除菌体；

4)将离心所得上清液用活性炭脱色去蛋白后，再经离子交换柱分离后，浓缩至合适浓度，结晶。

上述制备方法中，可以采用厌氧发酵，所述的有氧发酵可以采用通入氧气，所述氧气是纯氧气或是含有氧气的混合气体，如：空气；可以采用摇瓶培养或搅拌式发酵罐等方式的通风培养。此处所列举的内容不作为限定本发明，本领域技术人员能够根据本领域教科书或试验手册选择相应的实现本发明目的培养方式。

上述制备方法中，所述的离子交换可以选择阳离子交换或阴离子交换，优先选择阳离子交换，离子交换树脂的强弱不作为限定本发明。所得母液可以与下一次转化液合并浓缩，再结晶。结晶所得的粗品也可以通过重结晶进行精制。通过离子交换柱制得的D-丙氨酸还可以采用如：重结晶或乙醇沉淀等方法进行进一步的精制。

本发明实现的有益效果：

本发明采用微生物菌种细胞内的L-丙氨酸脱氨酶能将L-丙氨酸分解为氨和丙酮酸的特性，实现了对D，L-丙氨酸为原料进行快速而简便的生物法制备D-丙氨酸。该方法能使D-丙氨酸的保留率在90％以上，相对于底物D，L-丙氨酸，目标产物的得率在45％以上，提高了该产品的经济效益。

具体实施方式

以下详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅供说明具体方法，该方法的其规模不受实施例的限制。

实施例1

种子培养基组成如下：牛肉膏7.5g，蛋白胨15g，磷酸二氢钾3.5g，硫酸镁0.5g，L-丙氨酸25g，水1000mL，pH7.5，121℃灭菌20分钟。

发酵培养基如下：葡萄糖2.0g，酵母膏0.5g，蛋白胨0.7g，玉米浆0.8g，磷酸二氢钾0.1g，硫酸镁0.06g，D，L-丙氨酸10g，水100mL，pH7.2。

用适量的灭菌过的种子培养基将冻干的格氏沙雷氏菌(ATCC35478)菌种溶解，然后接入装有50mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，于37℃恒温培养，摇床转速为200r/min。24hrs后取上述种子10mL接入新鲜的种子培养基继续活化。当种子培养基当中的L-丙氨酸脱氨酶酶活力大于1U/mL时(酶活定义：1min转化1μmol的L-丙氨酸的酶量即为1U)后，取4mL上述活化好的菌种接入100mL发酵培养基中，200rpm下37℃恒温培养36h。

将上述发酵液6000rpm离心20min去除菌体，然后在上述离心所得上清液中加入2g活性炭，充分搅拌30min，过滤，收集滤液。将滤液上氢型强酸离子交换树脂，然后用氨水洗脱，洗出液中再加入5g活性碳脱色后浓缩至30mL，加入50mL乙醇，结晶，得干燥固体物4.5g，测样品旋光， ${\left[\mathrm{\α}\right]}_{25}^D=-14.55,(C=5\%,1\mathrm{MHCl}).$

实施例2

种子培养基组成如下：牛肉膏5.5g，蛋白胨10g，磷酸二氢钾1.5g，硫酸镁1.0g，L-丙氨酸10g，水1000mL，pH7.5，121℃灭菌20分钟。

发酵培养基组成如下：葡萄糖12g，酵母膏8g，蛋白胨5g，玉米浆8g，磷酸二氢钾0.1g，硫酸镁0.06g，D，L-丙氨酸150g，水1000mL，pH7.2。

用适量的灭菌过的种子培养基将冻干的粪肠球菌(ATCC29212)菌种溶解，然后接入装有70mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，于37℃恒温培养，摇床转速为170r/min。24hrs后取上述种子10mL接入新鲜的种子培养基继续活化。当种子培养基当中的L-丙氨酸脱氨酶酶活力1U/mL时(酶活定义：1min转化1μmol的L-丙氨酸的酶量即为1U)后，取5mL上述活化好的菌种接入100mL发酵培养基中，170rpm下37℃恒温培养36h。

将上述发酵液6000rpm离心20min去除菌体，然后在上述离心所得上清液中加入12g活性炭，充分搅拌30min，过滤，收集滤液。将滤液上氢型强酸离子交换树脂，然后用氨水洗脱，洗出液中再加入15g活性碳脱色后浓缩至300mL，加入600mL乙醇，结晶，得干燥固体物72.5g，测样品旋光， ${\left[\mathrm{\α}\right]}_{25}^D=-14.25,(C=5\%,1\mathrm{MHCl}).$

Claims (8)

1.一种D-丙氨酸的生物法制备技术，其步骤如下：

1)将经培养的种子菌种以2-15％，V/V接种量转接到含D，L-丙氨酸的发酵培养基中；

2)在培养温度25-37℃，摇床转速100-200rpm，进行有氧发酵培养12-36h，培养基的pH值控制在6-8之间；

3)当发酵液中丙氨酸含量不再减少时，将发酵液离心去除菌体；

4)将离心所得上清液用活性炭脱色去蛋白后，再经离子交换柱分离后，浓缩至合适浓度，结晶。

2.根据权利要求1所述的D-丙氨酸的生物法制备技术，其特征在于所述的菌种为粪肠球菌和格氏沙雷氏菌之一种或菌种的混合。

3.根据权利要求1所述的D-丙氨酸的生物法制备技术，其特征在于用于所述经培养的种子菌种的培养基组成为：牛肉膏5-10g、蛋白胨10-20g、磷酸二氢钾1-5g、硫酸镁0.2-1.0g和L-丙氨酸5-50g，用水定容至1000mL，pH为6.5-7.5。

4.根据权利要求1所述的D-丙氨酸的生物法制备技术，其特征在于用于所述经培养的种子菌种的培养方法为：装液量50-100mL/250mL三角瓶，接种量为一根长满的试管斜面，培养温度为25-37℃，摇床转速为100-200r/min。

5.根据权利要求4所述的D-丙氨酸的生物法制备技术，其特征在于所述的培养温度为30-37℃。

6.根据权利要求4所述的D-丙氨酸的生物法制备技术，其特征在于所述的摇床转速为150-200r/min。

7.根据权利要求1所述的D-丙氨酸的生物法制备技术，其特征在于所述发酵培养基组成为：酵母膏5-20g、葡萄糖10-20g、蛋白胨5-20g、玉米浆5-10g、磷酸二氢钾1.0-2.0g、硫酸镁0.5-1.0g和D，L-丙氨酸5-200g，用水定容至1000mL，pH为7.0-7.5。

8.根据权利要求1所述的D-丙氨酸的生物法制备技术，其特征在于发酵培养时装液量为50-150mL/250mL三角瓶，接种量为2-10％，V/V。