CN101255454B

CN101255454B - 利用酵母生物合成谷胱甘肽的方法

Info

Publication number: CN101255454B
Application number: CN2008100346856A
Authority: CN
Inventors: 叶勤; 李志敏; 李娓
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2008-03-14
Filing date: 2008-03-14
Publication date: 2011-07-20
Anticipated expiration: 2028-03-14
Also published as: CN101255454A

Abstract

本发明利用酵母生物合成谷胱甘肽的方法，是利用酵母细胞内的γ-GCS和GS，以葡萄糖为能源，利用细胞内的糖酵解系统产生三磷酸腺苷，将反应液中的谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸合成谷胱甘肽；采用酿酒酵母、面包酵母、假丝酵母等酵母细胞，进行通透化处理后，在由磷酸缓冲液、MgCl₂·6H₂O、CaCl₂·2H₂O、葡萄糖、L-谷氨酸、L-半胱氨酸构成的反应液进行反应，生产γ-L-谷氨酰基L-半胱氨酸，再加入甘氨酸生成谷胱甘肽；在两阶段反应中，谷胱甘肽对γ-GCS催化反应抑制的影响大大地减小；用本发明生产的谷胱甘肽，在产品浓度和反应的得率上都比一步反应法有了非常明显的提高。

Description

利用酵母生物合成谷胱甘肽的方法

【技术领域】

本发明涉及生物催化技术领域，具体地说，是一种利用酵母生物合成谷胱甘肽的方法。

【背景技术】

谷胱甘肽(Glutathione，GSH)是一种具有重要生理功能的活性物质，它由谷氨酸(L-Glu)、半胱氨酸(L-Cys)、甘氨酸(Gly)三个氨基酸组成，化学名为γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸，分子式为C₁₀H₁₈O₆N₃S。谷胱甘肽具有还原型和氧化型两种形式，在生物体内主要是以还原型存在，氧化型谷胱甘肽通过谷胱甘肽还原酶还原为还原型的谷胱甘肽。谷胱甘肽广泛分布于动物、植物、微生物中，在生物体中具有独特的生理功能，参与蛋白质和核糖核酸的合成、氧及营养物质的运输、维持内源酶的活力、参与体内三羧酸循环及糖代谢，清除体内过多自由基等功能。目前，在临床上，谷胱甘肽用于抗辐射、肿瘤(癌症)、氧中毒、衰老和协调内分泌的治疗。谷胱甘肽(GSH)作为一种抗氧化剂，也被用做食品添加剂来延长食品的保质期和强化食品中的氨基酸成分。

谷胱甘肽的生产方法主要有提取法、化学合成法、发酵法和酶法。

提取法(如Ferrara P J，Dalby G.US Patent 3396033)是以谷胱甘肽含量丰富的动、植物和酵母为原料，通过加入适当的溶剂或结合淀粉酶、蛋白酶的处理，再经过多步分离获得的。由于天然组织中谷胱甘肽的含量低，分离提取的处理步骤多，使得该方法谷胱甘肽的总体得率不高，所以，提取法逐渐被其它方法所替代。

化学合成法(Harington CR，Mead TH.Biochemical Journal(1935)29：1602-1611)生产的谷胱甘肽是D-型和L-型的消旋体，而具有生理活性的是L-谷胱甘肽，所以要得到有活性的谷胱甘肽(GSH)需要将产物进行光学拆分，此外，其化学合成步骤繁多，时间较长，污染严重。

近年来，利用发酵法生产谷胱甘肽的报道较多，发酵水平也逐渐提高。例如谭天伟等人(Process Biochemistry(2006)41：2424～2428)利用啤酒酵母高密度发酵，通过在发酵过程中加入前体氨基酸，发酵液中菌体干重达到了140g/L，谷胱甘肽的浓度达到了2190mg/L。发酵法生产的谷胱甘肽多存在于微生物的胞内，所以在提高谷胱甘肽含量的同时，产物还原型谷胱甘肽对γ-L-谷氨酰基-L-半胱氨酸合成酶的反馈抑制也加重，限制了谷胱甘肽产量的进一步提高。另外，发酵过程中的菌体细胞通透性不好，使得加入的底物氨基酸很难进入胞内用于合成谷胱甘肽，导致谷胱甘肽相对于所加入的氨基酸的得率不高，且发酵生产周期长，生产率低，也不利于产物的分离提取。

与微生物发酵法相比，酶法生产谷胱甘肽具有产物浓度高，杂质少，有利于下游分离提取，生产周期短等优点。酶法合成谷胱甘肽包括两步反应：第一步是L-谷氨酸和L-半胱氨酸及三磷酸腺苷(ATP)在镁离子(Mg²⁺)存在条件下，通过γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶(γ-GCS)的作用生成γ-L-谷氨酰基-L-半胱氨酸；第二步反应是γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸和甘氨酸及ATP在Mg²⁺存在条件下通过谷胱甘肽合成酶(GS)的作用生成γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸即谷胱甘肽。两步反应都需要ATP的参与，且合成反应的第一个酶(γ-GCS)受到还原型谷胱甘肽的反馈抑制(Richman PG，Meister A.Journalof Biological Chemistry(1975)250：1422-1426)。

酶法合成谷胱甘肽又分为两种方法，一种是利用纯酶催化合成谷胱甘肽，这种方法需要在加入三个前体氨基酸的同时加入三磷酸腺苷(ATP)，而且酶的分离纯化比较麻烦，酶和三磷酸腺苷(ATP)的价格都比较昂贵，因此不适合用于工业化生产。另一种是利用微生物细胞内的谷胱甘肽合成的酶系，在添加前体氨基酸和三磷酸腺苷(ATP)(或利用微生物自身代谢产生的ATP)的条件下生物合成谷胱甘肽。

迄今，人们对用酶法生产谷胱甘肽已有很多的研究，也尝试过很多种微生物，报道较多的有啤酒酵母、假丝酵母、基因工程啤酒酵母以及基因工程大肠杆菌等，如Gushima等人(J Appl Biochem(1983)5：43-52)利用分子生物学的方法将大肠杆菌内分别编码γ-GCS和GS的基因gshA和gshB引入E.coli RC912中，两个酶γ-GCS和GS的酶活分别比出发菌高了10倍和14.5倍，但谷胱甘肽的含量较出发菌仅高1.3倍。即使这些微生物体内γ-GCS和GS的活力都很高，但由于无法很好地解决产物的反馈抑制而使得反应的转化率很难有明显的提高。

在酶法合成谷胱甘肽的过程中，如何解决谷胱甘肽的反馈抑制对提高反应的转化率极为重要，另外，底物氨基酸(L-谷氨酸、L-半胱氨酸、甘氨酸)应该容易进入细胞以参加合成反应。以往在酶法合成的过程中，都是将三个前体氨基酸同时加入，其缺点是在反应过程中生成一定浓度的谷胱甘肽后对γ-GCS产生反馈抑制，使得产物谷胱甘肽的浓度难以进一步提高。

【发明内容】

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种解决谷胱甘肽反馈抑制γ-GCS的方法，提高酶法合成谷胱甘肽相对于L-Cys的转化率。

本发明的方法是利用酵母自身的酶系，经过通透化处理提高其通透性，利用其对葡萄糖的酵解作用来产生三磷酸腺苷(ATP)，并采用两步反应来解决谷胱甘肽对合成酶γ-GCS的反馈抑制，使得谷胱甘肽的得率提高，从而降低生产成本，达到较好的效果。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种利用酵母生物合成谷胱甘肽的方法，其特征是，采用酵母细胞，在通透化处理后，进行两步反应，获得谷胱甘肽，其具体的步骤为：

(1)反应前对酵母细胞进行通透化处理，具体的方法是：将活性干酵母悬浮液或酵母发酵液离心(1050×g，离心5分钟)，所得的菌体在-20℃温度下冷冻24小时以上；

(2)第一步反应：在反应器中加入含葡萄糖、L-谷氨酸、L-半胱氨酸的反应液，再加入酵母湿菌体，加入量为10～25％(w/v)，于37℃下反应7～12小时，在细胞内的γ-GCS作用下合成γ-L-谷氨酰基-L-半胱氨酸。

(3)第二步反应：在第一步反应的反应液中再加入甘氨酸，于37℃下继续反应20～30小时，将第一阶段反应生成的γ-L-谷氨酰基-L-半胱氨酸进一步合成谷胱甘肽。

(4)将反应液离心(因本方法合成的谷胱甘肽主要存在于反应液中，菌体中的含量相对很少)，上清液即可以常规方法进行谷胱甘肽的分离；将离心后得到的菌体经洗涤重悬，于100℃沸水浴中加热3分钟，将菌体中的谷胱甘肽溶出，快速冷却到室温，离心，得到的上清液即可与上述反应液的上清液合并，进行谷胱甘肽的分离。

所述的酵母菌体为具有γ-GCS和GS以及糖酵解活性的酵母细胞，如酿酒酵母、面包酵母、假丝酵母、毕赤酵母等。

所述的酵母细胞可以是专门培养的，如市场上销售的安琪牌高活性干酵母，也可以是发酵工业废弃的、但仍具有代谢活性的酵母细胞。

所述的通透化处理是在两步反应前进行的，其处理方法除了所述的将发酵液离心后所得的湿菌体在-20℃温度下冷冻24小时或以上外，还可将细胞在-20℃冻结后，再于37℃环境中融化，如此反复冻融三次；或采取化学试剂(如甲苯等)进行处理，得到通透性良好的酵母细胞。

所述第一步反应的反应液的组分为：0.2mol/L磷酸缓冲液(pH值7.0)、MgCl₂·6H₂O 5-30mmol/L、CaCl₂·2H₂O 5-20mmol/L、葡萄糖0.1-1.0mol/L，以及前体氨基酸：L-谷氨酸5-30mmol/L、L-半胱氨酸5-20mmol/L。

所述第二步反应的反应液为在第一步反应的反应液中添加甘氨酸5-30mmol/L。

谷胱甘肽的测定可采用DTNB比色法。DTNB储存液为0.01mol/L的溶解于0.05mol/L磷酸缓冲液(pH值7.0)的DTNB溶液。测定时，将DTNB储存液用0.5mol/L、pH值8.0的Tris-HCl缓冲液稀释100倍，配成DTNB分析液，避光放置，现配现用。测定时，取的谷胱甘肽标准品溶液或样品溶液(0.1～3.0mmol/L)0.5mL，加入1.5mL浓度为0.15mol/L的NaOH溶液，再加入0.5mL 3％的甲醛溶液，在25℃下反应2分钟，取出反应后的溶液0.5mL加入DTNB分析液中，在25℃下反应5分钟，于波长412nm测定吸光值。也可利用HPLC测定谷胱甘肽。

本发明利用酵母生物合成谷胱甘肽的方法的积极效果是：

(1)本发明利用微生物细胞内的γ-GCS和GS，以葡萄糖为能源，利用细胞内的糖酵解系统产生三磷酸腺苷(ATP)，将反应液中的谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸合成谷胱甘肽，这样合成的谷胱甘肽具有天然谷胱甘肽的结构。

(2)采用本发明的方法生成的谷胱甘肽大部分存在于反应液中，在第二个反应中，会有大量的谷胱甘肽生成，会对合成反应的第一个酶，即γ-GCS催化的反应产生抑制，但由于本发明的方法在第一步反应中已经生成了大量的γ-L-谷氨酰基-L-半胱氨酸，所以在第二步反应中，γ-GCS的影响被大大地减小了。

(3)本发明是利用葡萄糖的酵解作用产生三磷酸腺苷(ATP)，相对于在反应液中直接加入三磷酸腺苷的方法降低了成本。

(4)采用两步反应法生产谷胱甘肽，其产物的浓度和反应的转化率都比一步反应法有明显地提高，详见具体实施方式中的实施例。

【具体实施方式】

以下通过若干实施例对本发明利用酵母生物合成谷胱甘肽的方法进行具体描述或作进一步说明，其目的在于更好地理解本发明的方法，但本发明的保护范围不限于以下的实施例。

实施例1 以啤酒厂发酵废弃酵母进行反应，未进行通透化处理

将含啤酒酵母的发酵液以1050×g离心5分钟后，取10g湿酵母加入100mL反应液中，反应液具体组分为：磷酸钾缓冲液0.2mol/L(pH值7.0)、MgCl₂·6H₂O20mmol/L、CaCl₂·2H₂O 10mmol/L、葡萄糖0.4mol/L、L-谷氨酸10mmol/L、L-半胱氨酸10mmol/L，甘氨酸20mmol/L，于37℃条件下反应36小时，得到的谷胱甘肽浓度为750.5mg/L，关于半胱氨酸的得率为24.4％。

实施例2 以啤酒厂发酵废弃酵母进行反应，进行通透化处理

使用与实施例1同样的湿酵母细胞，但在反应前经过在冰箱内于-20℃冷冻24小时，使用前在37℃下解冻以提高细胞的通透性；

反应步骤同实施例1，得到的谷胱甘肽浓度为1028mg/L，关于半胱氨酸的得率为33.5％。

实施例3 以经通透化处理的啤酒厂废弃酵母进行两步转化反应

酵母细胞及其通透化处理同实施例2；

经通透化处理的细胞进行两步转化反应：

第一步转化反应：采用的反应液除未加入甘氨酸外，其余成分与实施例1所述的反应液相同，于37℃下反应7小时；

第二步转化反应：在第一步转化反应的反应液中加入甘氨酸，使其浓度达到20mmol/L，于37℃下继续反应29小时，得到的谷胱甘肽的浓度为1569mg/L，关于半胱氨酸的得率为51.1％。

实施例4 同实施例3，以经通透化处理的啤酒厂废弃酵母进行两步转化反应，但是三种氨基酸：L-谷氨酸、L-半胱氨酸、甘氨酸的浓度分别为20mmol/L、20mmol/L、30mmol/L，得到的谷胱甘肽的浓度达2207mg/L。

实施例5 以安琪高活性干酵母进行反应

取市售的安琪高活性干酵母10g，重悬于20mL 0.02mol/L(pH值7.0)的磷酸缓冲液中，于1050×g下离心5分钟，再用相同体积的磷酸缓冲液反复洗细胞涤两次；湿酵母细胞于-20℃和37℃下反复冻融三次；

按实施例1的方法进行一步反应，即将10g湿酵母加入100mL反应液中，葡萄糖浓度为1mol/L，反应36小时，谷胱甘肽的浓度为1174mg/L，关于半胱氨酸的得率为38.2％；

按实施例3的方法进行两步转化反应，葡萄糖的浓度为1mol/L，反应36小时，谷胱甘肽的浓度达到1765mg/L，关于半胱氨酸的得率为57.4％。

实施例6 以热带假丝酵母进行反应

将实验室保存的热带假丝酵母接种在斜面培养基上——培养基组分为(g/L)：葡萄糖20、蛋白胨20、酵母提取物10、琼脂20、pH值6.0，于30℃下培养36小时；

取一环接种于装有30mL一级种子培养基的250mL摇瓶中，培养基的组分为(g/L)：葡萄糖20、蛋白胨20、酵母提取物10、pH值6.0，于30℃、200转/分钟的摇床振荡培养12小时，为一级种子；

以5％的接种量将一级种子接种于装有30mL二级种子培养基的250mL摇瓶中，二级种子培养基的组分同一级种子培养基，于30℃、200转/分钟的条件下振荡培养10小时，为二级种子；

再以5％的接种量将二级种子接种于若干装有50mL发酵培养基的500mL摇瓶中，发酵培养基的组分为(g/L)：葡萄糖40、尿素2.0、K₂HPO₄1.5、MgSO₄·7H₂O0.5、FeSO₄·7H₂O 3.0×10^-3、MnCl₂·4H₂O 0.3×10^-3、ZnSO₄·7H₂O 4.0×10^-3、CaCl₂·2H₂O 1.0×10^-3、CuSO₄·5H₂O 0.5×10^-3、生物素0.05×10^-3、pH值6.0，在30℃，200转/分钟的摇床振荡培养30小时；

将培养的假丝酵母进行离心洗涤，得到的湿假丝酵母细胞分别在-20℃和37℃下反复冻融三次；

按实施例1的方法进行一步反应，得到的谷胱甘肽的浓度为449.6mg/L，关于半胱氨酸的得率为14.6％。

按实施例3的方法进行两步转化反应，得到的谷胱甘肽的浓度为815.4mg/L，关于半胱氨酸的得率为26.5％。

实施例7 以实验室保存的酿酒酵母菌株进行反应

将实验室保存的菌株按实施例6的方法进行培养，将得到的酿酒酵母细胞进行同样的通透化处理；

按实施例1的方法进行一步反应，得到的谷胱甘肽的浓度为489.8mg/L，关于半胱氨酸的得率为15.9％。

按实施例3的方法进行两步转化反应，得到的谷胱甘肽的浓度为850.7mg/L，关于半胱氨酸的得率为27.7％。

通过对多种酵母细胞的实施例可以清楚地看到，本发明两步转化反应得到的谷胱甘肽的浓度和关于半胱氨酸的得率都要明显好于一步反应。

Claims

1.一种利用酵母生物合成谷胱甘肽的方法，其特征在于，采用酵母细胞，在通透化处理后，进行两步反应，获得谷胱甘肽，其具体步骤为：

(1)反应前对酵母细胞进行通透化处理；

(2)第一步反应：在反应器中加入含葡萄糖、L-谷氨酸、L-半胱氨酸的反应液，所述反应液的组分为：0.2mol/L磷酸缓冲液——pH值7.0、MgCl₂·6H₂O 5-30mmol/L、CaCl₂·2H₂O 5-20mmol/L、葡萄糖0.1-1.0mol/L，以及前体氨基酸：L-谷氨酸5-30mmol/L、L-半胱氨酸5-20mmol/L；再加入酵母湿菌体，加入量为10～25％(w/v)，于37℃下反应7～12小时，在细胞内的γ-GCS作用下合成γ-L-谷氨酰基-L-半胱氨酸；

(3)第二步反应：在第一步反应的反应液中再加入5-30mmol/L甘氨酸，于37℃下继续反应20～30小时，将第一阶段反应合成的γ-L-谷氨酰基-L-半胱氨酸进一步合成谷胱甘肽；

(4)将反应液离心，将离心后得到的菌体经洗涤重悬，于100℃沸水浴中加热3分钟，快速冷却到室温，离心，进行谷胱甘肽的分离。

2.根据权利要求1所述的利用酵母生物合成谷胱甘肽的方法，其特征在于，步骤(2)所述的酵母湿菌体为酿酒酵母、面包酵母、假丝酵母和毕赤酵母。

3.根据权利要求1所述的利用酵母生物合成谷胱甘肽的方法，其特征在于，所述的酵母湿菌体是发酵工业废弃的、但仍具有代谢活性的细胞。