CN102978121B - 一种微生物转化法生产麦角硫因的方法 - Google Patents
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Abstract
一种微生物转化法生产麦角硫因的方法，属于发酵与生物转化领域。本发明以组氨酸为转化前体，白香蘑菌为转化微生物，通过微生物培养，底物加入，生物转化的步骤培养生产麦角硫因。本发明的优点在于：1)直接利用微生物的转化作用生产麦角硫因，不需要化学试剂，既节省成本，又利于环境保护。2)微生物转化的效率高，专一性强，生成的麦角硫因，产率大于80％；3)工艺简单，降低生产成本。
Description
技术领域
微生物转化组氨酸生产麦角硫因的菌种与方法，属于发酵与生物转化领域。本发明涉及一种筛选获得的菌种，分类命名为白香蘑菌(Lepista caespitosa(Bres.)Sing.)，及对其培养发酵，并用于转化组氨酸制备麦角硫因的方法，属于生物技术领域。
背景技术
近年来，随着人们对抗氧化剂研究的不断深入，麦角硫因作为一种天然的生物活性物质，开始受到人们广泛的关注，国外已有部分相关报道，而国内对其研究还处于探索阶段。
麦角硫因学名为2-巯基-L-组氨酸三甲基内盐，最初是在1909年由Tanret C从麦角(寄生在禾本科植物黑麦上的一种真菌所成的菌核)中分离得到。麦角硫因具有多种生物学活性。(1)抗氧化活性：直接清除活性氧；螯合各种二价金属阳离子；激活抗氧化酶；影响各种血红素蛋白的氧化作用，如血红素和肌红蛋白。(2)麦角硫因能抑制过氧亚硝基阴离子介导的氨基酸氧化，如酪氨酸硝化，从而对炎症的治疗提供了可行性。
麦角硫因作为无毒的天然抗氧化剂，在水溶液中不易被氧化，并能够激发细胞的天然抗氧化防御系统，其不仅能够螯合重金属离子，而且能够保护细胞，从而保护机体红细胞免于自由基的损伤。此外麦防止辐射的功效，可以保护皮肤表皮细胞免受紫外线损伤。可以用于开发户外护肤产品及防护性的化妆品；同时眼内局部含有高浓度的麦角硫因则可以降低白内障的发病率。
麦角硫因由于其具有显著而独特生物学功能的物质，各国学者很早就对其应用展开了研究。但是由于其在自然界中含量较低，不能由动物机体自身合成，只能从食物中摄取，属于稀有氨基酸，因此限制该产品的开发应用。目前研究表明食用真菌中麦角硫因的含量较高，说明食用真菌中含有生产转化麦角硫因的酶。通过筛选发现白香蘑菌(Lepistacaespitosa(Bres.)Sing.)具有转化生产麦角硫因的能力。能够转化组氨酸生成麦角硫因，从而实现工业化生产。
发明内容
本发明的目的是筛选出一种能够有效生物转化组氨酸为麦角硫因的菌种，并提供一种生物转化反应生成麦角硫因的方法。
本发明的技术方案：一株转化组氨酸制备麦角硫因的菌种，其分类命名为白香蘑菌(Lepista caespitosa(Bres.)Sing.).
用所述的白香蘑菌(Lepista caespitosa(Bres.)Sing.)菌株转化组氨酸制备麦角硫因，其转化方法：
A.菌株的培养：
(1)使用菌株：白香蘑菌(Lepista caespitosa(Bres.)Sing.)；
(2)保藏培养基：葡萄糖营养琼脂培养基；
(3)种子培养基：葡萄糖5-15g/L,蛋白胨1-4g/L，尿素1-5g/L，MgSO4.7H2O0.1-3g/L,PH 7.0,去离子水配制；种子培养条件：用250mL三角瓶装30-80mL种子培养基，按常规方法灭菌、冷却、接种后于26-30度，150-220r/min摇床培养12-36h做为种子培养液；
(4)发酵培养基组成：葡萄糖5-15g/L,蛋白胨1-4g/L，尿素1-20g/L，MgSO4.7H2O0.1-3g/L，PH 7.0,去离子水配制；发酵条件：用500mL三角瓶装100-300mL培养基，按常规方法灭菌，冷却，接种后于26-30度，150-220r/min摇床培养12-24h后添加1.5g/L的组氨酸作为底物继续培养12-24h。
B.生物转化：
(1)将培养所得到的发酵液进一步处理得到的保菌体、冻干菌粉、透性化细胞或固定化细胞作为细胞生物催化剂；
(2)将组氨酸按照0.1％-75％的比例配制成水溶液作为生物转化底物反应液；
(3)将细胞生物催化剂，加入底物反应液进行转化反应；生物转化条件为：底物组氨酸浓度为0.1％-75％，细胞生物催化剂以游离细胞计对底物溶液的用量为10-200g/L；初始pH 5.0-10.0，转化反应温度为20-45℃，150-220r/min摇床培养，转化反应时间0.5-48h。
C.提纯与精制：将转化反应结束后的反应液用D001型强酸性苯乙烯树脂进行离子交换，去离子水洗脱，再经树脂D301纯化，去离子水洗脱，收集富含麦角硫因组分，浓缩，干燥后得到麦角硫因的提取物。
附图说明
图1为本发明的麦角硫因标准品的高效液相色谱图谱。
图2为本发明的麦角硫因样品的高效液相色谱图谱
具体实施例一
检测麦角硫因的方法：利用HPLC进行检测，流动相为乙腈：10mmol/L醋酸铵(80：20)，检测波长为254nm，流速为1.0ml/min，色谱柱：氨基柱(250mm×4.6mm)。样品和标准品的配制：称取适量标准品和样品，采用纯净水为溶剂，配制成溶液。进样量为10ul。麦角硫因标准品和样品的色谱图分别详见图1和图2。
具体实施例二
用白香蘑菌(Lepista caespitosa(Bres.)Sing.)进行培养发酵，斜面培养基为葡萄糖营养琼脂培养基。种子培养基组成为葡萄糖5g/L,蛋白胨1g/L，尿素1g/L，MgSO4.7H2O0.1g/L,PH 7.0,去离子水配制；种子培养条件：用250mL三角瓶装30mL种子培养基，按常规方法灭菌、冷却、接种后于26度，150r/min摇床培养12h做为种子培养液；发酵培养基组成：葡萄糖5g/L,蛋白胨1g/L，尿素1g/L，MgSO4.7H2O 0.1g/L，PH 7.0,去离子水配制；发酵条件：用500mL三角瓶装100mL培养基，按常规方法灭菌，冷却，接种后于26度，150r/min摇床培养12h后添加1.5g/L的组氨酸作为底物继续培养12h。
生物转化：将培养所得到的发酵液进一步处理得到的保菌体、冻干菌粉、透性化细胞或固定化细胞作为细胞生物催化剂；将组氨酸按照0.1％的比例配制成水溶液作为生物转化底物反应液；将细胞生物催化剂，加入底物反应液进行转化反应；生物转化条件为：底物组氨酸浓度为0.1％-％，细胞生物催化剂以游离细胞计对底物溶液的用量为10g/L；初始pH 5.0，转化反应温度为20℃，180r/min摇床培养，转化反应时间0.5h。
提纯与精制：将转化反应结束后的反应液用D001型强酸性苯乙烯树脂进行离子交换，去离子水洗脱，再经树脂D301纯化，去离子水洗脱，收集富含麦角硫因组分，浓缩，干燥后得到麦角硫因的提取物，转化率达到51％。
具体实施例二
使用菌株白香蘑菌(Lepista caespitosa(Bres.)Sing.)进行培养发酵，保藏培养基：葡萄糖营养琼脂培养基；种子培养基：葡萄糖15g/L,蛋白胨4g/L，尿素5g/L，MgSO4.7H2O3g/L,PH 7.0,去离子水配制；种子培养条件：用250mL三角瓶装80mL种子培养基，按常规方法灭菌、冷却、接种后于30度，220r/min摇床培养36h做为种子培养液；发酵培养基组成：葡萄糖15g/L,蛋白胨4g/L，尿素20g/L，MgSO4.7H2O 3g/L，PH 7.0,去离子水配制；发酵条件：用500mL三角瓶装300mL培养基，按常规方法灭菌，冷却，接种后于30度，220r/min摇床培养24h后添加1.5g/L的组氨酸作为底物继续培养24h。
生物转化：将培养所得到的发酵液进一步处理得到的保菌体、冻照75％的比例配制成水溶液作为生物转化底物反应液；将细胞生物催化剂，加入底物反应液进行转化反应；生物转化条件为：底物组氨酸浓度为75％，细胞生物催化剂以游离细胞计对底物溶液的用量为200g/L；初始pH 10.0，，转化反应温度为45℃，220r/min摇床培养，转化反应时间48h。
提纯与精制：将转化反应结束后的反应液用D001型强酸性苯乙烯树脂进行离子交换，去离子水洗脱，再经树脂D301纯化，去离子水洗脱，收集富含麦角硫因组分，浓缩，干燥后得到麦角硫因的提取物，转化率为56％。
具体实施例三
生物转化使用菌株为白香蘑菌(Lepista caespitosa(Bres.)Sing.)；保藏培养基为葡萄糖营养琼脂培养基；种子培养基：葡萄糖10g/L,蛋白胨2g/L，尿素2g/L，MgSO4.7H2O0.2g/L,PH 7.0,去离子水配制；种子培养条件：用250mL三角瓶装60mL种子培养基，按常规方法灭菌、冷却、接种后于28度，180r/min摇床培养24h做为种子培养液；发酵培养基组成：葡萄糖10g/L,蛋白胨2g/L，尿素10g/L，MgSO4.7H2O 0.2g/L，PH 7.0,去离子水配制；发酵条件：用500mL三角瓶装200mL培养基，按常规方法灭菌，冷却，接种后于28度，180r/min摇床培养24h后添加1.5g/L的组氨酸作为底物继续培养24h。
生物转化：将培养所得到的发酵液进一步处理得到的保菌体、冻干菌粉、透性化细胞或固定化细胞作为细胞生物催化剂；将组氨酸按照50％的比例配制成水溶液作为生物转化底物反应液；将细胞生物催化剂，加入底物反应液进行转化反应；生物转化条件为：底物组氨酸浓度为50％，细胞生物催化剂以游离细胞计对底物溶液的用量为100g/L；初始pH6.0，转化反应温度为36℃，180r/min摇床培养，转化反应时间48h。
提纯与精制：将转化反应结束后的反应液用D001型强酸性苯乙烯树脂进行离子交换，去离子水洗脱，再经树脂D301纯化，去离子水洗脱，收集富含麦角硫因组分，浓缩，干燥后得到麦角硫因的提取物，转化率为80％。
具体实施例四
生物转化使用菌株为白香蘑菌(Lepista caespitosa(Bres.)Sing.)；保藏培养基为葡萄糖营养琼脂培养基；种子培养基：葡萄糖5g/L,蛋白胨3g/L，尿素4g/L，MgSO4.7H2O0.5g/L,PH 7.0,去离子水配制；种子培养条件：用250mL三角瓶装50mL种子培养基，按常规方法灭菌、冷却、接种后于28度，200r/min摇床培养36h做为种子培养液；发酵培养基组成：葡萄糖10g/L,蛋白胨4g/L，尿素15g/L，MgSO4.7H2O 0.53g/L，PH 7.0,去离子水配制；发酵条件：用500mL三角瓶装300mL培养基，按常规方法灭菌，冷却，接种后于30度，220r/min摇床培养24h后添加1.5g/L的组氨酸作为底物继续培养24h。
生物转化过程即将培养所得到的发酵液进一步处理得到的保菌体、冻干菌粉、透性化细胞或固定化细胞作为细胞生物催化剂；将组氨酸按照50％的比例配制成水溶液作为生物转化底物反应液；将细胞生物催化剂，加入底物反应液进行转化反应；生物转化条件为：底物组氨酸浓度为50％，细胞生物催化剂以游离细胞计对底物溶液的用量为100g/L；初始pH 8.0，转化反应温度为35℃，200r/min摇床培养，转化反应时间36h。
提纯与精制：将转化反应结束后的反应液用D001型强酸性苯乙烯树脂进行离子交换，去离子水洗脱，再经树脂D301纯化，去离子水洗脱，收集富含麦角硫因组分，浓缩，干燥后得到麦角硫因的提取物，转化率为70％。
Claims (2)
1.用白香蘑菌(Lepista caespitosa(Bres.)Sing.)菌株转化组氨酸制备麦角硫因的方法，其特征是：
菌株的培养：
出发菌株：白香蘑菌(Lepista caespitosa(Bres.)Sing.)；
保藏培养基：葡萄糖营养琼脂培养基；
种子培养基：葡萄糖5-15g/L，蛋白胨1-4g/L，尿素1-5g/L，MgSO4.7H2O 0.1-3g/L，PH7.0，去离子水配制；
种子培养条件：用250mL三角瓶装30-80mL种子培养基，按常规方法灭菌、冷却、接种后于26-30度，150-220r/min摇床培养12-36h做为种子培养液；
发酵培养基组成：葡萄糖5-15g/L，蛋白胨1-4g/L，尿素1-20g/L，MgSO4.7H2O 0.1-3g/L，PH7.0，去离于水配制；
发酵条件：用500mL三角瓶装100-300mL培养基，按常规方法灭菌，冷却，接种后于26-30度，150-220r/min摇床培养12-24h后添加1.5g/L的组氨酸作为底物继续培养12-24h。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述方法还包括生物转化：
将培养所得到的发酵液进一步处理得到的保菌体、冻干菌粉、透性化细胞或固定化细胞作为细胞生物催化剂；将组氨酸按照0.1％-75％的比例配制成水溶液作为生物转化底物反应液；
将细胞生物催化剂，加入底物反应液进行转化反应；生物转化条件为：底物组氨酸浓度为0.1％-75％，细胞生物催化剂以游离细胞计对底物溶液的用量为10-200g/L；初始pH5.0-10.0，转化反应温度为20-50℃，150-250r/min摇床培养，转化反应时间0.5-48h；
提纯与精制：将转化反应结束后的反应液用D001型强酸性苯乙烯树脂进行离子交换，去离子水洗脱，再经树脂D301纯化，去离子水洗脱，收集富含麦角硫因组分，浓缩，干燥后得到麦角硫因的提取物。
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