CN104293699B - 一株具有γ‑氨基丁酸和谷胱甘肽合成能力的嗜热链球菌及其应用 - Google Patents

一株具有γ‑氨基丁酸和谷胱甘肽合成能力的嗜热链球菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株具有γ‑氨基丁酸和谷胱甘肽合成能力的嗜热链球菌，该菌株命名为嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)ST1，已于2014年8月29日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏编号为CGMCC No.9781。本发明还公开了所述的嗜热链球菌在发酵生产功能性乳制品中的应用。

Description

一株具有γ-氨基丁酸和谷胱甘肽合成能力的嗜热链球菌及 其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一株具有γ-氨基丁酸和谷胱甘肽合成能力的嗜热链球菌及其应用。
背景技术
嗜热链球菌是重要的发酵剂菌株，与德氏乳杆菌保加利亚亚种或瑞士乳杆菌混合发酵生产酸奶、硬奶酪等发酵乳制品。嗜热链球菌通过产生乳酸、胞外多糖、香味物质等赋予产品特殊的风味和质地，是公认的安全级食品微生物。全世界嗜热链球菌年消费量达1021菌体细胞。目前选育的嗜热链球菌发酵剂菌株，在保证快速产酸、产黏及产生浓郁香味的传统优良特性的基础上，对增强菌株的益生特性方面给予极大关注。
γ-氨基丁酸(gama-amino butyric acid，GABA)一种天然存在的非蛋白组成氨基酸，广泛存在于动植物体内，参与多种代谢活动，具有镇静神经、抗焦虑、提高脑活力和改善睡眠等生理功能，是一种抑制性神经递质。随着研究的深入，GABA已经成为一种新型功能性因子，逐渐应用于医药和食品加工业。GABA的制备方法包括化学合成法和生物合成法。化学合成的GABA，成本高且使用有毒溶剂提取，产品缺乏安全性，不宜用于食品添加；而生物合成法安全性高，产物可以达到食品级标准。生物合成法主要是利用微生物的谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase,GAD)催化L-谷氨酸发生脱羧反应转化为GABA。许多微生物都编码有谷氨酸脱羧酶，目前利用大肠杆菌固定化细胞转化谷氨酸为GABA的效率高达85％。但是大肠杆菌菌株本身存在极大安全隐患，因而利用食品安全级菌株生产GABA在食品工业中有巨大的应用潜力。
谷胱甘肽(GSH)是另一种广泛存在于动植物体内由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的功能性三肽化合物。由于GSH分子中含有一个还原性的巯基，可通过氧化脱氢作用将活性氧还原，从而消除细胞内的自由基，因此GSH在保护细胞抵抗氧化胁迫中具有重要的作用。此外，GSH的巯基能够螯合重金属、氟化物等起到解毒的功能。鉴于GSH重要的生理功能，不仅作为药物应用于临床，还可以广泛应用于延缓衰老、增强免疫力、抗肿瘤等功能性食品中。利用微生物合成GSH包括两个步骤，首先L-谷氨酸和L-半胱氨酸在γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化下生成γ-谷氨酰半胱氨酸，然后在谷胱甘肽合成酶的催化下γ-谷氨酰半胱氨酸与甘氨酸缩合形成GSH。目前比较基因组分析发现，嗜热链球菌细胞内催化上述两种反应的酶融合成为由一种酶即谷胱甘肽合成酶直接催化合成谷胱甘肽的反应，使得嗜热链球菌产生谷胱甘肽，由此提高了嗜热链球菌发酵乳制品的益生性。鉴于此，开发或筛选具有γ-氨基丁酸和谷胱甘肽合成能力的嗜热链球菌能够同时产生γ-氨基丁酸和谷胱甘肽以极大的满足人们对发酵乳制品的功能性要求有重要的意义。
发明内容
针对传统发酵乳制品菌株益生特性不足，本发明要解决的问题是提供一株具有γ-氨基丁酸(GABA)和谷胱甘肽(GSH)合成能力的嗜热链球菌及其应用。
本发明所述的具有γ-氨基丁酸和谷胱甘肽合成能力的嗜热链球菌，其特征在于：该菌株命名为嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)ST1，已于2014年8月29日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏编号为CGMCC No.9781。
上述嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)CGMCC No.9781分离自新疆传统发酵酸奶中，是一株能够转化谷氨酸产生GABA并利用谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸合成GSH的嗜热链球菌，具有嗜热链球菌的典型特征：革兰氏阳性、兼性厌氧，无芽孢，不运动；菌落较小且大小均一，边缘整齐；细胞呈椭球形，液体培养时以链状出现；其生理生化特征是：过氧化氢酶阴性，V-P反应阴性，吲哚反应阴性，详见表1。
表1：嗜热链球菌CGMCC No.9781的生理生化特征
上述嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)CGMCC No.9781生长温度为37-42℃，最适生长温度为42℃。
上述嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)CGMCC No.9781在MRS培养基中快速生长，静置培养12小时后，pH值4.54，乳酸产量为3.6g/L。
上述嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)CGMCC No.9781的16S rDNA基因序列已提交GenBank，其登录号GU344726。通过在美国生物工程信息中心(National Centerfor Biotechnology Information，NCBI)查阅国际相关的基因库，与本发明的嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)CGMCC No.9781有关菌株的16S rDNA基因序列虽有相似性(如表2所示)，但却不完全相同，说明本发明公开的菌株是首次分离鉴定，具有原创性。
表2：嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)CGMCC No.9781的16S rDNA序列与GenBank提交菌株序列相似性比较
名称 同源性(％)
Streptococcus thermophilus CGLBL208 98％
Streptococcus thermophilus KLDS3.0606 98％
Streptococcus thermophilus FMA808 97％
Paenibacillus illinoisensis M4 97％
本发明所述具有γ-氨基丁酸和谷胱甘肽合成能力的嗜热链球菌在发酵生产功能性乳制品中的应用。
实验证实：本发明的嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)CGMCC No.9781在添加2％谷氨酸钠的MRS培养基中42℃静置培养24小时，γ-氨基丁酸(GABA)产量为3.24g/L。本发明的嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)CGMCC No.9781在化学合成培养基(chemical defined medium,CDM)中42℃静置培养24小时，谷胱甘肽(GSH)产量为3.19mg/mg protein。其中，所述化学合成培养基配方为：乳糖10g/L，乙酸钠1g/L，柠檬酸三铵6g/L，磷酸二氢钾3g/L，磷酸氢二钾2.5g/L，六水氯化镁0.2g/L，氯化钙0.05g/L，硫酸锰0.028g/L，氯化亚铁0.005g/L，硫酸锌0.005g/L，硫酸锌0.0001g/L，对氨基苯甲酸0.01g/L，生物素0.01g/L，吡哆醛0.005g/L，烟酸0.001g/L，泛酸0.001g/L，叶酸0.001g/L，氰钴胺0.001g/L，核黄素0.001g/L，腺嘌呤0.01g/L，鸟嘌呤0.01g/L，尿嘧啶0.01g/L，黄嘌呤0.01g/L，天冬氨酸0.46g/L，谷氨酸0.4g/L，赖氨酸0.44g/L，精氨酸0.13g/L，组氨酸0.15g/L，苯丙氨酸0.28g/L，脯氨酸0.65g/L，色氨酸0.05g/L，甲硫氨酸0.13g/L，丙氨酸0.24g/L，缬氨酸0.33g/L，亮氨酸0.48g/L，异亮氨酸0.22g/L，甘氨酸0.18g/L，丝氨酸0.34g/L，半胱氨酸0.25g/L，酪氨酸0.29g/L。
上述实验明确了本发明公开的嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)CGMCCNo.9781可以转化谷氨酸生成GABA，并可以利用培养基的谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸合成GSH，预示该菌株在发酵生产功能性乳制品(如酸奶、硬奶酪等)中具有潜在的价值和广阔的应用前景。
具体实施方式
实施例1：嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)菌株的筛选及生理生化特性鉴定
将新疆传统发酵酸奶样品涂布在MRS培养基琼脂平板上，倒置平板42℃培养24小时，挑取白色圆形且过氧化氢酶阴性的菌落，镜检为链球菌，反复划线确定纯菌落，接种到MRS培养基，显微观察个体形态及进行生化反应测定，最终筛选得到一株嗜热链球菌，该菌株命名为嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)ST1，已于2014年8月29日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其保藏编号为CGMCC No.9781。
上述嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)CGMCC No.9781菌株为革兰氏阳性菌，兼性厌氧，无芽孢，不运动；菌落较小且大小均一，边缘整齐；细胞呈椭球形，液体培养时以链状出现；其生理生化特征是：过氧化氢酶阴性。V-P反应阴性。吲哚反应阴性。可利用乳糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖，不能利用木糖。
将上述嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)CGMCC No.9781接种到MRS培养基中，42℃静置培养12小时，pH值下降到4.54，乳酸产量为3.61g/L。
实施例2：嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)CGMCC No.9781转化谷氨酸生成GABA
将嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)CGMCC No.9781转接到含有2％谷氨酸的MRS培养基中，42℃静置培养24小时。培养物经过1000g离心5分钟收集上清液，经过0.22μm微米滤膜过滤后得到无菌发酵液，测定其中GABA含量为3.24g/L。
上述GABA检测方法：取出100μL无菌发酵液冰浴10分钟，加入200μL 0.2mol/L硼酸缓冲液(pH9.0)，再加入1ml 6％的苯酚和400μL次氯酸钠溶液，充分震荡后在沸水浴中反应10min后，立刻冰浴冷却20min，待溶液出现蓝绿色取出50μL，加入150μL60％乙醇溶液，在630nm波长下测定吸光度值。
实施例3：应用嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)CGMCC No.9781转化谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸生产谷胱甘肽(GSH)
将嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)CGMCC No.9781在MRS培养基中培养至稳定期前期，6000g离心3分钟收集菌体，加入无菌水洗涤菌体2次，最后用等体积的CDM培养基重悬菌体，按照2％的比例接种于化学合成(chemical defined medium,CDM)培养基中42℃静止培养24小时。
其中：上述化学合成培养基配方为：乳糖10g/L，乙酸钠1g/L，柠檬酸三铵6g/L，磷酸二氢钾3g/L，磷酸氢二钾2.5g/L，六水氯化镁0.2g/L，氯化钙0.05g/L，硫酸锰0.028g/L，氯化亚铁0.005g/L，硫酸锌0.005g/L，硫酸锌0.0001g/L，对氨基苯甲酸0.01g/L，生物素0.01g/L，吡哆醛0.005g/L，烟酸0.001g/L，泛酸0.001g/L，叶酸0.001g/L，氰钴胺0.001g/L，核黄素0.001g/L，腺嘌呤0.01g/L，鸟嘌呤0.01g/L，尿嘧啶0.01g/L，黄嘌呤0.01g/L，天冬氨酸0.46g/L，谷氨酸0.4g/L，赖氨酸0.44g/L，精氨酸0.13g/L，组氨酸0.15g/L，苯丙氨酸0.28g/L，脯氨酸0.65g/L，色氨酸0.05g/L，甲硫氨酸0.13g/L，丙氨酸0.24g/L，缬氨酸0.33g/L，亮氨酸0.48g/L，异亮氨酸0.22g/L，甘氨酸0.18g/L，丝氨酸0.34g/L，半胱氨酸0.25g/L，酪氨酸0.29g/L。
培养结束后，检测发酵产物中GSH的含量为3.19mg/mg protein。
上述谷胱甘肽含量的检测方法：1mL的反应体系包含700μL 0.3mM NADPH，100μL6mM 5,5二巯基(2-对硝基苯甲酸)，180μL待测样品。反应体系混匀后加入10μL 50U/mL的谷胱甘肽还原酶开始反应，在412nm下连续100秒检测吸光值的改变，计算反应速率。利用已知浓度的GSH标准品绘制标准曲线，通过比较待测溶液的反应速率与标准曲线比较计算出样品中的GSH含量。

Claims (2)

1.一株具有γ-氨基丁酸和谷胱甘肽合成能力的嗜热链球菌，其特征在于：所述嗜热链球菌命名为嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)ST1，已于2014年8月29日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏编号为CGMCC No.9781。
2.权利要求1所述具有γ-氨基丁酸和谷胱甘肽合成能力的嗜热链球菌在发酵生产功能性乳制品中的应用。
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