CN105154370B - 一株产细胞被膜蛋白酶的鼠李糖乳杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株产细胞被膜蛋白酶的鼠李糖乳杆菌，命名为鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）R1，该菌株已于2015年07月6日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC No.11055。本发明还公开了所述菌在制备抗高血压的发酵乳品中的应用，实验证实本发明的菌株在化学合成培养基或牛乳基质中生长能产生细胞被膜蛋白酶，对于血管紧张素转化酶活性抑制率可达63.1%至69.5%之间，预示本发明所述鼠李糖乳杆菌菌株在生产抗高血压功效的发酵乳品方面具有广泛的应用前景。

Description

一株产细胞被膜蛋白酶的鼠李糖乳杆菌及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一株产细胞被膜蛋白酶的鼠李糖乳杆菌及其在制备抗高血压的发酵乳品中的应用。
背景技术
乳酸菌是公认的安全级微生物，广泛应用于乳制品的发酵。牛乳是一种富含酪蛋白而缺少游离氨基酸的环境，一些乳酸菌菌株为了适应这种特殊的生长环境，进化出一套完整的蛋白酶系统，用来水解酪蛋白获得游离的氨基酸以供菌体生长使用。这种蛋白酶系统包括三个主要组分：细胞被膜蛋白酶(Cell Envelope Proteinase,CEP)，寡肽转运系统和细胞内肽酶。其中，细胞被膜蛋白酶是催化水解酪蛋白的第一步，在整个蛋白酶系统中具有核心作用，该酶在细胞内合成，经过分泌系统转运至胞外并且锚定在菌体细胞壁上。细胞被膜蛋白酶可以将牛乳中的酪蛋白降解为寡肽，寡肽再经由转运系统进入细胞内被肽酶降解为游离的氨基酸。乳酸菌细胞被膜蛋白酶的合成受到培养基中氮源的调控，当培养基中游离氨基酸丰富时，其合成被抑制，而当游离氨基酸非常贫乏时，细胞被膜蛋白酶将大量合成。牛乳恰好是这种游离氨基酸贫乏的环境，可以刺激特定菌株合成大量的细胞被膜蛋白酶。
血管紧张素转化酶(angiotensin-converting enzyme,ACE)可以将无活性的十肽血管紧张素I转变成血管收缩剂八肽血管紧张素II，同时使血管舒张九肽失活，进而使血压升高。通过抑制血管紧张素转化酶的活性可以达到抗高血压的效果。近期研究表明，来源于牛乳的短肽具有抑制血管紧张素转化酶的活性，进而达到抗高血压的效果，这种短肽被称为生物活性肽。
利用具有细胞被膜蛋白酶活性的乳酸菌菌株发酵牛乳是获得生物活性肽的一种经济适用的方法。
鼠李糖乳杆菌是一类较早发现并应用的益生型乳酸菌，如上世纪80年代由美国科学家从健康人肠道中分离的鼠李糖乳杆菌LGG，该菌株能够耐受消化道环境，并在肠道内定殖，起到调节肠道菌群，预防和治疗腹泻，提高机体免疫力等作用。近年来，国内外对于鼠李糖乳杆菌的研究主要集中于该菌株定殖于肠道细胞的粘附机制及其对免疫系统的调控。
目前，国外已发表的产生细胞被膜蛋白酶的鼠李糖乳杆菌有分离自人阴道的鼠李糖乳杆菌BGT10，然而因其分离生境的特定性，限制了该菌株的在食品领域的应用；此外报道了一株产生细胞被膜蛋白酶的鼠李糖乳杆菌CECT287，其发酵牛乳72小时后产物对血管紧张素转化酶活性最高抑制能力为47％，但由于该菌株发酵周期长且血管紧张素转化酶活性抑制能力居中，从而对于该菌株应用于生产具有抗高血压的益生型发酵乳制品造成了一定的阻碍。基于此，研发或筛选具有细胞被膜蛋白酶酶活力高，发酵周期短，产物对于血管紧张素转化酶活性抑制能力强的鼠李糖乳杆菌成为亟待解决的课题。
发明内容
针对现有技术所述的鼠李糖乳杆菌细胞被膜蛋白酶酶活力较低，发酵周期长，产物对于血管紧张素转化酶活性抑制能力较弱的问题，本发明的目的是提供一株产细胞被膜蛋白酶的鼠李糖乳杆菌及其在制备抗高血压的发酵乳品中的应用。
本发明所述的产细胞被膜蛋白酶的鼠李糖乳杆菌，其特征在于：所述菌株命名为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)R1，该菌株已于2015年07月6日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC No.11055。
上述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)R1分离自新疆传统发酵酸奶中，是一株能够在特定的化学合成培养基或原料乳中产生细胞被膜蛋白酶的鼠李糖乳杆菌，具有鼠李糖乳杆菌的典型特征，即为：革兰氏阳性，兼性厌氧，无芽孢，不运动；菌落较小且大小均一，边缘整齐；细胞呈短杆状，常3-5个成链；其生理生化特征是：过氧化氢酶阴性，VP反应阴性，吲哚反应阴性，上述鼠李糖乳杆菌CGMCC No.11055的生理生化特征详见表1。
表1 鼠李糖乳杆菌CGMCC No.11055的生理生化特征
上述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)R1CGMCC No.11055生长温度为25-42℃，最适生长温度为37℃。
上述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)R1CGMCC No.11055在MRS培养基中生长，静置培养12小时后，菌体密度达到5.32，pH值为4.34。
上述MRS培养基的配方：胰蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5g，葡萄糖20.0g，柠檬酸三铵2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，乙酸钠3.12g，磷酸氢二钠1.63g，乙酸钾2.25g，吐温-80 1.0mL，蒸馏水1000mL，115℃灭菌30min。
通过在美国生物工程信息中心(National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)查阅国际相关的基因库，将本发明的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)R1 CGMCC No.11055 16S rDNA基因序列与有关菌株的16S rDNA基因序列比较，虽有相似性(如表2所示)，但却不完全相同，说明本发明的菌株是首次分离鉴定，具有原创性。
表2 鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)R1CGMCC No.11055的16S rDNA序列与GenBank提交菌株序列相似性比较
名称 同源性(％)
Lactobacillus rhamnosus ChPR-II-str56 98％
Lactobacillus rhamnosus SN6 98％
Lactobacillus rhamnosus Z5 98％
Lactobacillus rhamnosus LE38 98％
上述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)R1CGMCC No.11055在化学合成培养基中37℃静置培养24小时，菌体密度可达到2.85，pH值降至3.95。检测细胞被膜蛋白酶酶活最高达到200个酶活单位每毫克蛋白。
上述化学合成培养基配方为：葡萄糖10g/L，乙酸钠5g/L，磷酸二氢钾3g/L，磷酸氢二钾3g/L，七水硫酸镁0.2g/L，四水硫酸锰0.05g/L，七水硫酸亚铁0.02g/L，丙氨酸0.1g/L，精氨酸0.1g/L，天冬氨酸0.2g/L，天冬酰胺0.2g/L，半胱氨酸0.2g/L，谷氨酰胺0.2g/L，谷氨酸0.2g/L，甘氨酸0.1g/L，组氨酸0.1g/L，异亮氨酸0.1g/L，亮氨酸0.1g/L，赖氨酸0.1g/L，苯丙氨酸0.1g/L，甲硫氨酸0.1g/L，脯氨酸0.1g/L，丝氨酸0.1g/L，苏氨酸0.1g/L，酪氨酸0.1g/L，色氨酸0.1g/L，缬氨酸0.1g/L，对氨基苯甲酸0.01g/L，D-生物素0.01g/L，VB10.001g/L，VB6 0.002g/L，VB3 0.001g/L，VB5 0.001g/L，叶酸0.001g/L，VB12 0.001g/L，VB2 0.001g/L，腺嘌呤0.01g/L，鸟嘌呤0.01g/L，尿嘧啶0.01g/L，黄嘌呤0.01g/L，胸腺嘧啶0.01g/L，吐温80 1.0ml/L，自然pH值，115℃灭菌30分钟。
本发明所述的产细胞被膜蛋白酶的鼠李糖乳杆菌在制备抗高血压的发酵乳品中的应用。
上述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)R1在化学合成培养基或牛乳基质中生长能产生细胞被膜蛋白酶，将其以体积比为2％～4％的量接种于原料乳中，37℃发酵12～14小时即获得活菌数为(5～6)×109CFU/mL的具有抗高血压的发酵乳品。
上述原料乳优选鲜牛乳，鲜牛乳采用巴氏消毒法，在85℃保温15秒。
本发明公开了一株产细胞被膜蛋白酶的鼠李糖乳杆菌，有效解决了目前的细胞被膜蛋白酶酶活力较低，发酵周期长，产物对于血管紧张素转化酶活性抑制能力较弱的问题，同时利用其制备的发酵乳又为现有生活提供了一种高效抑制血管紧张素转化酶活性的发酵乳品，实验证实该菌株发酵原料乳12至14小时后，对于血管紧张素转化酶活性抑制率可达63.1％至69.5％之间，预示本发明所述鼠李糖乳杆菌菌株在生产抗高血压功效的发酵乳品方面具有广泛的应用前景。
附图说明
本发明所述的产细胞被膜蛋白酶的鼠李糖乳杆菌已于2015年07月6日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)”，保藏号为CGMCC No.11055。
图1鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)R1CGMCC No.11055在化学合成培养基中37℃静置培养24小时内，菌体细胞密度(OD600)和产生细胞被膜蛋白酶(CEP)的曲线。
具体实施方式
实施例1：鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)R1CGMCC No.11055菌株的筛选及生理生化特性
将新疆传统发酵酸奶样品涂布在MRS培养基琼脂平板上，倒置平板37℃培养24小时，挑取白色圆形且过氧化氢酶阴性的菌落，镜检为短杆菌，反复划线确定纯菌落，接种到MRS培养基，显微观察个体形态及进行生化反应测定，最终筛选得到一株鼠李糖乳杆菌，命名为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)R1。
上述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)R1菌株为革兰氏阳性菌，兼性厌氧，无芽孢，不运动；菌落较小且大小均一，边缘整齐；细胞呈短杆状，常3-5个成链；其生理生化特征是：过氧化氢酶阴性，VP反应阴性，吲哚反应阴性，可利用乳糖、葡萄糖、山梨糖、蔗糖、甘油，不能利用木糖和果糖。
将菌株鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)R1接种到MRS培养基中，37℃静置培养12小时，菌体密度达到5.32，pH值为4.34。
上述MRS培养基的配方：胰蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5g，葡萄糖20.0g，柠檬酸三铵2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，乙酸钠3.12g，磷酸氢二钠1.63g，乙酸钾2.25g，吐温-80 1.0mL，蒸馏水1000mL，115℃灭菌30min。
上述筛选倒的菌株鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)R1已于2015年07月6日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC No.11055。
实施例2：鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)R1CGMCC No.11055的细胞被膜蛋白酶活力测定
将鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)R1CGMCC No.11055按照体积比2％的比例接种于MRS培养基37℃静置培养10小时。培养液通过6000g离心5分钟收集菌体。菌体用无菌水洗涤，6000g离心5分钟收集菌体重悬于等体积的无菌水中。
按照体积比2％的比例将重悬于无菌水中的CGMCC No.11055菌株接种于化学合成培养基中37℃静置培养24小时，期间每隔两个小时取出1mL菌液，6000g离心5分钟收集菌体，用0.85％的氯化钠溶液(添加10mM氯化钙)洗涤两次，6000g离心5分钟收集菌体细胞，重悬于pH 7.0的磷酸盐缓冲液中，使最终的细胞密度达到107～9cfu的菌数。
测定全细胞的细胞被膜蛋白酶的酶活，培养0小时至14小时酶活由0酶活单位增至200酶活单位，继续培养至24小时酶活降至70酶活单位。
上述细胞被膜蛋白酶的测定方法：以N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide为反应底物的酶活测定方法。待测细胞悬液30μL，与214μL 50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)，112μL 5M氯化钠，19μL 20mM反应底物混匀，40℃温浴10分钟，加入188μL 80％乙酸终止反应。反应液10000g离心5分钟，使用酶标仪检测410nm处的吸光值。从p-nitroanilide标准曲线计算出释放的p-摩尔数。酶活单位定义：40℃条件下每分钟每毫克菌体蛋白释放的p-nitroanilide的微摩尔数，单位U/mg。
上述化学成培养基(Chemical Defined Medium，CDM)配方如下：葡萄糖10g/L，乙酸钠5g/L，磷酸二氢钾3g/L，磷酸氢二钾3g/L，七水硫酸镁0.2g/L，四水硫酸锰0.05g/L，七水硫酸亚铁0.02g/L，丙氨酸0.1g/L，精氨酸0.1g/L，天冬氨酸0.2g/L，天冬酰胺0.2g/L，半胱氨酸0.2g/L，谷氨酰胺0.2g/L，谷氨酸0.2g/L，甘氨酸0.1g/L，组氨酸0.1g/L，异亮氨酸0.1g/L，亮氨酸0.1g/L，赖氨酸0.1g/L，苯丙氨酸0.1g/L，甲硫氨酸0.1g/L，脯氨酸0.1g/L，丝氨酸0.1g/L，苏氨酸0.1g/L，酪氨酸0.1g/L，色氨酸0.1g/L，缬氨酸0.1g/L，对氨基苯甲酸0.01g/L，D-生物素0.01g/L，VB1 0.001g/L，VB6 0.002g/L，VB3 0.001g/L，VB5 0.001g/L，叶酸0.001g/L，VB12 0.001g/L，VB2 0.001g/L，腺嘌呤0.01g/L，鸟嘌呤0.01g/L，尿嘧啶0.01g/L，黄嘌呤0.01g/L，胸腺嘧啶0.01g/L，吐温80 1.0ml/L，自然pH值，115℃灭菌30分钟。
实施例3：鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)R1CGMCC No.11055发酵牛乳的产物对血管紧张素转化酶(ACE)的抑制活性实验
按照体积比2％将鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)R1CGMCC No.11055接种于5mL巴氏消毒的牛乳中，37℃静置培养12h。
按照体积比2％接种量转接于100mL巴氏消毒的牛乳中，37℃静置培养14h。发酵产物加入终浓度为10％的三氯乙酸，沸水浴保温20分钟，8000g离心15分钟，收集上清液，并用1M NaOH将其的pH调至8.3后经过孔径为0.22μm的滤膜过滤，于-20℃条件下保存待测。检测待测样品的ACE活性抑制率为69.5％。IC50约为832μg/mL。
上述ACE抑制率测定方法为：在200μL HHL缓冲液(15mM马尿酸-L-组氨酰-L-亮氨酰溶解于100mM硼酸盐，pH 8.3)中加入80μL待测样品，混匀后在37℃保温3分钟，迅速加入20μL ACE(100mU/mL)，混匀，在37℃保温30分钟，加入250μL 1.0M HCl终止反应。反应中ACE释放出来的马尿酸通过1.7mL乙酸乙酯萃取，8000g离心15分钟后取出1mL乙酸乙酯，冷冻干燥后溶解于1mL水，在228nm处测定吸光值。
其中A是反应体系中存在抑制剂和ACE时的吸光值，B是反应体系中存在ACE但无抑制剂时的吸光值，C是反应体系中无抑制剂与ACE时的吸光值。
实施例4：鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)R1CGMCC No.11055发酵牛乳的产物对血管紧张素转化酶(ACE)的抑制活性实验
按照体积比2％将鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)R1CGMCC No.11055接种于5mL巴氏消毒的牛乳中，37℃静置培养12h。
按照体积比4％接种量转接于100mL巴氏消毒的牛乳中，37℃静置培养12h。发酵产物加入终浓度为10％的三氯乙酸，沸水浴保温20分钟，8000g离心15分钟，收集上清液，并用1M NaOH将其的pH调至8.3后经过孔径为0.22μm的滤膜过滤，于-20℃条件下保存待测。检测待测样品的ACE活性抑制率为63.1％。IC50约为1017μg/mL。
上述ACE抑制率测定方法为：在200μL HHL缓冲液(15mM马尿酸-L-组氨酰-L-亮氨酰溶解于100mM硼酸盐，pH 8.3)中加入80μL待测样品，混匀后在37℃保温3分钟，迅速加入20μL ACE(100mU/mL)，混匀，在37℃保温30分钟，加入250μL 1.0M HCl终止反应。反应中ACE释放出来的马尿酸通过1.7mL乙酸乙酯萃取，8000g离心15分钟后取出1mL乙酸乙酯，冷冻干燥后溶解于1mL水，在228nm处测定吸光值。
其中A是反应体系中存在抑制剂和ACE时的吸光值，B是反应体系中存在ACE但无抑制剂时的吸光值，C是反应体系中无抑制剂与ACE时的吸光值。
实施例5：制备鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)R1CGMCC No.11055发酵乳品
鲜牛乳经过巴氏消毒后冷却到40℃，以体积比为2％～4％的量将鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)R1CGMCC No.11055接种于鲜牛乳中，37℃发酵12～14h，冷却至10℃，装瓶。
发酵乳品指标：鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)R1CGMCC No.11055活菌数为5.76×109CFU/mL，按照实施例3所述方法，检测发酵乳对于血管紧张素转化酶活性抑制效率，其结果为66.2％。

Claims (2)

1. 一株产细胞被膜蛋白酶的鼠李糖乳杆菌，其特征在于：所述菌株命名为鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）R1，该菌株已于2015 年07 月6 日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC No.11055。
2. 权利要求1所述产细胞被膜蛋白酶的鼠李糖乳杆菌在制备具有抗高血压的发酵乳品中的应用方法是：所述鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）R1在化学合成培养基或牛乳基质中生长能产生细胞被膜蛋白酶，将其以体积比为2%~4%的量接种于鲜牛乳中，37℃发酵12~14小时即获得活菌数为（5~6）×109 CFU/mL的具有抗高血压的发酵乳品。
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