CN115927075B - 一株具高ace抑制活性的嗜热链球菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物领域，针对嗜热链球菌发酵产品ACE抑制活性较低、且需要与其它菌复配的问题，提供一株具高ACE抑制活性的嗜热链球菌，该菌株具有优良的发酵性能，通过较低的初始接种量获得的发酵乳具有高血管紧张素转换酶ACE抑制活性（72%‑75%），而且获得的发酵乳经过不同消化酶和不同条件储存，ACE抑制活性仍然保持较高的水平（65%‑75%）；如食用本发明的发酵乳组合物，可维持机体健康血压水平。本发明还提供所述嗜热链球菌的应用。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，尤其是涉及一株具高ACE抑制活性的嗜热链球菌及其应用。
背景技术
心血管疾病的预防是改善国民健康、进一步提升健康期望寿命的重要公共卫生策略。在心血管病防治策略中，高血压的防治是重中之重。目前高血压已经成为日常生活中最为常见的慢性疾病，是人类健康的“无形杀手”。原发性高血压病是一种需要不断治疗甚至终身治疗的慢性疾病，可谓是一场“持久战”。
目前高血压患者还是以药物治疗为主。血压正常高值人群虽尚未达到高血压诊断标准，却具有非常重要的临床意义。这部分人群发展成高血压的可能性比血压正常者大得多。血压正常高值人群数量庞大，应该用非药物疗法进行干预，千万不能认为“不要紧”或顺其自然发展。血管紧张素转换酶抑制肽(ACE抑制肽)在血压正常高值人群对于高血压的预防，以及高血压患者的日常保健和辅助治疗过程中都起着非常重要的作用。
生产ACE抑制肽的方法有合成法、酶解法和发酵法。合成法操作繁琐，种类有限；酶解法成本高，后续过程复杂。有较多的研究发现，一些益生菌具有较好的蛋白水解活性，可分解蛋白产生一定量的ACE抑制肽，其发酵乳可能具有调节血压的功效。这些研究中的益生菌多数为瑞士乳杆菌L.helveticus，Yamamoto等选用L.helveticus CPN4发酵制成酸乳，从中分离得到了一种两个氨基酸(Tyr-Pro)构成的抗高血压活性二肽；郭宇星通过优化得出L.helveticus 15019最适培养条件为发酵液初始pH值7.5，培养温度39℃，接种量4％，ACE抑制活性为75.46±0.42％(《瑞士乳杆菌发酵法制备乳清蛋白源性A C E抑制肽的研究》，食品科学，2006,Vol.27,No.06,151-154.)；薛建岗以分离自甘肃地区传统发酵酸奶、酸奶乳清、酸牛奶、酸牦牛奶及鲜牦牛奶和曲拉中的60株L.helveticus为研究对象，以ACE抑制率为主要指标筛选得到一株优良菌株L.helveticus IMAU80872。对L.helveticusIMAU80872在脱脂乳中的发酵温度、接种量及发酵时间研究中发现，以接种量1×106CFU/g接种，40℃发酵10h，发酵乳ACE抑制率可达到74.09％。也有一些研究表明植物乳杆菌、干酪乳杆菌、粪肠球菌等具有较高的ACE抑制活性。
虽然国内研究中发现很多乳酸菌都具有产ACE抑制肽的能力，但仅停留在基础研究阶段，将其应用于功能性酸乳生产的研究很少，国内还没有相关的降压发酵乳产品上市。嗜热链球菌作为一类重要的发酵剂菌种，广泛用于生产一些重要的发酵乳产品，包括酸奶和奶酪(如瑞士、林堡干酪)。有一些研究还发现嗜热链球菌也具有一些功能活性，比如生产胞外多糖、细菌素和维生素。关于嗜热链球菌单菌发酵在降压方面的研究较少，已报道的研究中显示嗜热链球菌发酵产品ACE抑制活性较低，且基本是与其他菌进行复配。如，陈世伟将保加利亚乳杆菌LB6与嗜热链球菌按照1:1的活菌数比例复配，以106CFU/mL复原乳为目标添加量，将上述两菌与脱脂乳混合均匀，制备具有产ACE抑制肽能力的直投式功能性发酵剂，但这里起作用的主要是保加利亚乳杆菌LB6，嗜热链球菌对ACE抑制能力并未体现，也未指出是具体哪一株。Kawase等人发现利用Streptococcus thermohilus TMC 1543和Lactobacillus casei TMC0409联合发酵牛乳不但有降胆固醇作用，还有显著的降血压作用。
针对血压正常高值人群，建议采用健康饮食和生活方式作为主要的降压治疗方法。我国传统发酵食品中菌种资源丰富，嗜热链球菌是乳酸菌的链球属中唯一可应用在发酵食品上的菌株。嗜热链球菌作为重要的发酵乳酸菌之一，对其进行可维持机体血压健康水平菌株的挖掘和筛选，开发自主知识产权菌株发酵剂，尽快开发出辅助降低正常高值人群血压的发酵类产品，显得意义重大。
发明内容
本发明为了克服嗜热链球菌发酵产品ACE抑制活性较低、且需要与其它菌复配的问题，提供一株具高ACE抑制活性的嗜热链球菌，该菌株具有优良的发酵性能，通过较低的初始接种量获得的发酵乳具有高血管紧张素转换酶ACE抑制活性(72％-75％)，而且获得的发酵乳经过不同消化酶和不同条件储存，ACE抑制活性仍然保持较高的水平(65％-75％)；如食用本发明的发酵乳组合物，可维持机体健康血压水平。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一株具高ACE抑制活性的嗜热链球菌，嗜热链球菌命名为WHH1590(简称1590)，于2022年07月27日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.25413，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，微生物分类命名为嗜热链球菌Streptococcus thermophilus
该菌株是发明人在前期工作中从西藏牦牛酥油中筛选得到的。
所述嗜热链球菌最适生长温度为42℃，兼性厌氧。
本发明还提供所述嗜热链球菌在制备发酵产品中的应用。发酵产品包括但不局限于发酵乳、发酵奶粉、口服液或片剂。
所述发酵产品的制备方法为：将所述嗜热链球菌接种于蛋白基料中进行发酵，发酵条件为：初始接种量(0.5-5)×106CFU/mL，发酵温度36-43℃，发酵时间4-18h。
所述蛋白基料包括但不局限于全脂乳粉、脱脂乳粉、乳清蛋白粉及全乳蛋白粉中的一种或几种。
作为优选，所述嗜热链球菌以菌粉形式接种于蛋白基料中，菌粉的活菌数为(1.5-2.5)×1011CFU/g。
作为优选，所述发酵温度为42℃，发酵时间为12-14h。
本发明还提供所述嗜热链球菌在制备食品或药品中的应用。
因此，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供的嗜热链球菌WHH1590菌株通过较低的初始接种量获得的发酵乳具有高血管紧张素转换酶ACE抑制活性(72％-75％)，例如初始接种量为5×105CFU/mL时，发酵12小时，ACE抑制活性即可达到75％以上；
(2)本发明提供的嗜热链球菌WHH1590菌株后酸较稳定，且制得的发酵产品风味优良，如发酵乳乳质构稠厚，有较长拉丝，奶香味浓郁；
(3)本发明提供的嗜热链球菌WHH1590菌株发酵产品耐受性好，通过pH调节或不同消化酶等条件处理，仍具有较高的ACE抑制活性(＞60％)；
(4)本发明提供的嗜热链球菌WHH1590菌株发酵产品性能稳定，在4℃和室温储存3个月后，ACE抑制活性均基本无变化；
(5)本发明提供的嗜热链球菌WHH1590制得的各种产品具有维持机体血压健康水平的功能。
附图说明
图1为嗜热链球菌WHH1590在显微镜下观察到的形态；
图2为嗜热链球菌WHH1590发酵乳的拉丝图；
图3为嗜热链球菌WHH1590发酵乳的旋转扫描测试结果图；
图4为嗜热链球菌WHH1590在不同初始接种量、不同温度下的产酸曲线；
图5为嗜热链球菌WHH1590在不同初始接种量、不同发酵时间下的ACE抑制活性变化图；
图6为嗜热链球菌WHH1590发酵乳在不同消化酶处理条件下的ACE抑制活性变化图；
图7为嗜热链球菌WHH1590发酵乳在不同储藏条件下的ACE抑制活性变化图。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案做进一步说明。
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的，实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例1菌株的筛选
1.1ACE抑制活性测定方法
ACE抑制肽体外筛选方法，是在一定条件下，ACE与血管紧张素I(ANGI)的模拟底物作用产生具有特异性吸收的物质，通过加入ACE抑制肽前后该物质吸收特性的差异变化来反应ACE抑制活性的大小。ACE抑制肽活性测定的关键是ACE活性的测定，即ACE抑制活性大小反应ACE抑制肽活性或含量。本发明是利用ACE酶解底物马尿酰组氨酰亮氨酸(N—Hip-His.Leu,HHL)生成的马尿酸和二肽(His.Leu,HL)来定量的，其中多以马尿酸的生成量定量。
1.1.1试剂配置
分别配置0.1mol/L硼酸-硼砂缓冲液、0.1U/mL ACE溶液、5mmol/L的HHL溶液。
1.1.2样品处理：
在1.5mL离心管中加入200μl 5mmol/L的HHL溶液和80μl的发酵乳上清液，对照加80μl的缓冲液，于37℃水浴保温5min后，加入20μl ACE溶液，混匀后在37℃水浴中保温30min，加入250μl 1mol/L的盐酸溶液以终止反应。通过高效液相色谱仪waters e2695色谱系统(D18SM7963A)采用外标法进行定量。平行实验3次，结果取平均值。
R＝(A-B)/A×100％
R：发酵乳样品对ACE的抑制率
A：空白对照品中马尿酸的浓度
B：添加发酵乳样品组中马尿酸的浓度
1.2菌株的筛选由从新疆、青海、内蒙古、云南、四川等地传统发酵食品(包括牛酸乳、泡菜、牦牛酥油等样品)中分离得到的61株嗜热链球菌作为筛选目标嗜热链球菌的来源。这61株嗜热链球菌均保存于杭州娃哈哈科技有限公司。
将这36株嗜热链球菌甘油管200μl接种至10mL M17液体试管中，37℃培养24h。一代种子液200μl接种至10mL M17液体试管中，37℃培养过夜。二代种子液1mL离心去上清，生理盐水洗一次，重悬至1mL生理盐水中。200μl重悬液接至10mL脱脂乳中(大约107CFU/mL的接种量)，37℃发酵16h。挑取凝乳的试管，破乳，取适量发酵乳高速低温离心后，取乳清。按上述1.1方法进行ACE抑制活性的测定。ACE抑制活性测定结果如下表。发酵乳ACE抑制活性具有菌株特异性，不同菌株中蛋白水解酶和肽酶的活性有较大差异。本发明中这61株嗜热链球菌发酵乳中降压肽的种类和活性差异较大，因而ACE抑制活性从0％-75.2％具有较大跨度。结果显示，嗜热链球菌WHH449(杭州娃哈哈集团有限公司自主菌株，微生物保藏编号为：CGMCC No.11952)ACE抑制活性较高，为69.2％。嗜热链球菌WHH1590的ACE抑制活性最高。
实施例2菌株的分离与培养
一株具有高ACE抑制活性的嗜热链球菌，该菌株是发明人在前期工作中从西藏牦牛酥油中筛选得到的。经鉴定属于嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)，命名为WHH1590，于2022年07月27日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.25413。
该菌株的形态学特征为：在M17琼脂培养基中生长形态为浅黄白色菌落，表面较光滑、边缘不整齐。革兰氏染色呈典型阳性，显微镜下观察，如图1所示，细胞呈球状，无鞭毛，不产芽孢，不运动。培养特征为：最适生长温度为42℃，兼性厌氧，生长于M17培养基中。
实施例3菌株的鉴定
3.1生物学鉴定
针对16s rRNA基因序列测序，所得结果与NCBI GenBank数据库中进行同源性比对分析，结果显示该菌株为嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)。
3.2WHH1590菌株的API50CHL系统鉴定
WHH1590发酵菌液1mL离心，菌泥用生理盐水重悬。调整OD600至5mL重悬菌液的OD600为0.5左右。离心去上清，用API50培养基5mL重悬。加入API50板中，每孔100μL。37℃孵育24h和48h。
实施例4WHH1590冻干菌粉的制备
将菌株嗜热链球菌WHH1590以1％-3％的接种量接种于10mL特定优化发酵培养基中，在42℃恒温培养箱中培养16h，作为一代种子液。同样方法传至第二代。二代种子液1％-3％的接种量接种于10L特定优化发酵培养基的发酵罐中，42℃恒温培养16h，将发酵液8000rpm离心10min收集菌体，用0.85％无菌生理盐水洗涤一次，加入适量的特定优化保护剂，重悬一定时间，真空冷冻干燥，菌粉真空包装。制得的菌粉活菌数达到1.5-2.5×1011CFU/g，可用于嗜热链球菌WHH1590相关发酵产品的制作和生产。
实施例5WHH1590发酵乳ACE抑制活性的测定
5.1ACE抑制活性测定方法
5.1.1试剂配置
分别配置0.1mol/L硼酸-硼砂缓冲液、0.1U/mL ACE溶液、5mmol/L的HHL溶液。
5.1.2样品处理：
在1.5mL离心管中加入200μl 5mmol/L的HHL溶液和80μl的发酵乳上清液，对照加80μl的缓冲液，于37℃水浴保温5min后，加入20μl ACE溶液，混匀后在37℃水浴中保温30min，加入250μl 1mol/L的盐酸溶液以终止反应。通过高效液相色谱仪waters e2695色谱系统(D18SM7963A)采用外标法进行定量。
R＝(A-B)/A*100％
R：发酵乳样品对ACE的抑制率
A：空白对照品中马尿酸的浓度
B：添加发酵乳样品组中马尿酸的浓度
5.2WHH1590发酵乳ACE抑制活性的测定
WHH1590菌粉在乳粉基料中发酵，后酸较稳定，发酵8-12h左右酸奶酸度合适，风味较好。通过上述方法进行多个平行样品的检测，发现发酵乳ACE抑制活性均在75％左右。
实施例6菌株WHH1590发酵乳组织状态的观察
WHH1590菌粉在全脂乳粉基料中发酵，后酸较稳定，发酵8-12h左右酸奶酸度合适，奶香味浓郁。发酵乳质地稠厚，无乳清析出。破乳后，结构细腻。取适量发酵乳至无菌平皿中，用洁净玻璃棒蘸取适量发酵乳，如图2所示，有较长拉丝，拉丝长度25-30厘米，发酵性能优良。
实施例7嗜热链球菌WHH1590发酵乳流变学性能测试
在全脂乳粉基料中，初始接种量分别为5×105CFU/mL和5×106CFU/mL，42℃温度中发酵10小时和12小时。
为评价嗜热链球菌WHH1590发酵乳的组织状态和质构特性，对该发酵乳的流变学特性进行测试，即通过旋转扫描，测定不同剪切应变率下的黏度。这一指标可间接反映发酵乳在入口、留口和吞咽过程中的黏度变化趋势。嗜热链球菌WHH1590发酵乳旋转扫描测试结果见图3，三份发酵乳样品粘度变化趋势类似。随着剪切力的不断加大，粘度呈梯度下降。初始接种量分别为5×105CFU/mL和5×106CFU/mL，42℃温度中发酵12小时的两份发酵乳粘度扫描曲线基本重合。同时对该三份发酵乳进行了内部口味测试。结果表明，上述发酵乳呈现出较高的黏度，在入口时表现出更好的稠厚感，口感接受度高。
实施例8菌株WHH1590在不同初始接种量不同温度下的发酵产酸情况在全脂乳粉基料中，初始接种量分别为5×105CFU/mL、1×106CFU/mL、2.5×106CFU/mL、5×106CFU/mL，分别在36℃、39℃和42℃温度中发酵，追踪发酵曲线。同一初始接种量(如2.5×106CFU/mL)时，温度为42℃的发酵速度均快于39℃，尤其快于36℃，且后酸化稳定，是菌株WHH1590最合适的发酵温度，见图4(a)。温度为42℃时，不同初始接种量的发酵速度差别不大，后酸化均较稳定，见图4(b)。温度为39℃和42℃时，不同初始接种量的发酵速度均较快，4小时即可凝乳且后酸化均较稳定，有作为商业发酵剂的潜能。初始接种量为5×105CFU/mL时即可达到较为理想的结果。
实施例9菌株WHH1590在不同初始接种量不同发酵时间ACE抑制活性变化在全脂乳粉基料中，发酵温度42℃，嗜热链球菌WHH1590和WHH449初始接种量分别为5×105CFU/mL、1×106CFU/mL、2.5×106CFU/mL、5×106CFU/mL，分别在发酵4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h和18h检测ACE抑制活性，两株菌检测结果见下表，其中WHH1590结果绘制成曲线图，见图5。从这些数据可以看出，接种量在5×105CFU/mL，发酵时间12h，嗜热链球菌WHH1590对ACE抑制活性(74％)是嗜热链球菌WHH499(20.6％)的3.6倍。嗜热链球菌WHH499接种量在2.5 -5×106CFU/mL，且发酵时间大于16h，其ACE抑制活性可以达到69％。而嗜热链球菌WHH1590接种量降低10倍，发酵时间缩短25％(接种量在5×105CFU/mL，发酵时间12h)，其ACE抑制活性可以达到75％。相同发酵条件下，嗜热链球菌WHH1590较嗜热链球菌WHH449有更强的蛋白水解活性，ACE抑制率更高。对于嗜热链球菌WHH1590，同一发酵时间，不同初始接种量得到的发酵乳ACE抑制活性差别不大。初始接种量为5×105CFU/mL，发酵12小时，发酵乳ACE抑制活性即可达到最高水平(75％左右)，后续基本保持不变，有效地节约了接种成本。
实施例10菌株WHH1590发酵乳不同消化酶处理条件下的ACE抑制活性变化200mL全脂乳合适条件灭菌处理后，嗜热链球菌WHH1590和WHH499冻干菌粉按5×105CFU/mL初始活菌数接种，42℃发酵14h，离心得上清原液。上清原液分别用合适浓度的硫酸和氢氧化钠将pH调至2.5和8.0。1mL pH2.5上清加适量10mg/mL Pepsin，1mL pH8.0上清加适量1mg/mLTrypsinase，37℃水浴4h。分别检测ACE抑制率。检测结果见图6。相同处理条件下，嗜热链球菌WHH1590较嗜热链球菌WHH449有更强的蛋白水解活性，ACE抑制率更高。嗜热链球菌WHH449活性肽在碱性条件很不稳定，ACE抑制率降低至初始样品的24％。嗜热链球菌WHH1590调酸和胃蛋白酶处理后ACE抑制率还是处于比较高的水平，基本保持不变；胰蛋白酶处理后抑制率下降稍多，但还处于不错的水平(＞60％)。ACE抑制肽的稳定性是发挥降压作用的重要条件。嗜热链球菌WHH1590发酵所得降压肽具有出色的耐酸、耐碱、耐胆盐和耐酶解的能力，因此嗜热链球菌WHH1590发酵在生产、应用和储存过程中存在较明显的优势。
实施例11菌株WHH1590发酵乳不同储藏条件下ACE抑制活性变化200mL全脂乳合适条件灭菌处理后，WHH1590冻干菌粉按5×105CFU/mL初始活菌数接种，43℃发酵12h，发酵乳成品95℃10min灭菌处理，分装成小样后分别置于4℃和室温保存。定期检测风味发酵乳成品的ACEi％。储存3个月的ACE抑制活性变化情况见图7。不管是4℃还是室温保存，发酵乳成品的ACEi％均保持较高的水平，储存3个月的ACE抑制活性仍大于70％，表明该菌株发酵乳或对维持机体血压健康水平有一定的功效。
从实施例9和10可以看出，在相同发酵条件下，嗜热链球菌WHH1590较嗜热链球菌WHH449有更强的蛋白水解活性，ACE抑制率更高；而且不仅要关注对ACE抑制活性的强弱，ACE抑制肽的稳定性也是发挥降压作用的重要条件，嗜热链球菌WHH1590发酵所得降压肽具有更出色的耐酸、耐碱、耐胆盐和耐酶解的能力，因此嗜热链球菌WHH1590发酵在生产、应用和储存过程中存在较明显的优势。可见，即使是同一种属，不同菌株的蛋白酶和肽酶的种类和活性不同，得到的降压肽对ACE抑制活性和稳定性就有很大差异，这不是本领域技术人员可以简单预测的，本发明的嗜热链球菌WHH1590具有创造性。
本发明提供的嗜热链球菌WHH1590制备的发酵产品除了上述发酵乳，还包括发酵奶粉、口服液或片剂等形式的食品、药品。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (7)
1. 一株具高ACE抑制活性的嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus），其特征在于，嗜热链球菌于2022年07月27日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，微生物保藏编号为CGMCC No.25413，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.如权利要求1所述的嗜热链球菌在制备发酵产品中的应用。
3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述发酵产品的制备方法为：将所述嗜热链球菌接种于蛋白基料中进行发酵，蛋白基料选自全脂乳粉、脱脂乳粉、乳清蛋白粉及全乳蛋白粉中的一种或几种，发酵条件为：初始接种量(0.5-5)×106 CFU/mL，发酵温度36-43℃，发酵时间4-18h。
4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述嗜热链球菌以菌粉形式接种于蛋白基料中，菌粉的活菌数为(1.5-2.5)×1011 CFU/g。
5.如权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述发酵温度为42℃，发酵时间为12-14h。
6.如权利要求1所述的嗜热链球菌在制备食品中的应用。
7.如权利要求1所述的嗜热链球菌在制备药品中的应用，所述药品有维持机体血压健康水平的功能。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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