CN101328471B - 青春双歧杆菌grx066及其用途 - Google Patents

Abstract

青春双歧杆菌grx066及其用途，本发明涉及功能性乳制品生产技术领域。先通过培养基从传统乳制品中分离获得乳酸菌；再利用酶比色法筛选出其发酵乳抑制血管紧张素转换酶活性比较强的菌株，即为青春双歧杆菌grx066。本发明菌种可应用于制作各种具有降血压功能的食品。

Description

青春双歧杆菌grx066及其用途

技术领域

本发明涉及功能性乳制品生产技术领域。

技术背景

乳酸菌的降血压作用在于其能够代谢产生蛋白酶，从而降解蛋白质，产生ACE活性抑制肽。乳酸菌代谢产生的蛋白酶，包括肽链内切酶以及氨基肽酶等，在这些酶系的作用下，限制性水解蛋白质，产生分子大小以及作用各有差异的生物活性肽段，其中包括已经发现的具有抑制血管紧张素转换酶(Angiotensin Converting Enzyme，ACE)活性的小肽。

发酵乳制品的降血压作用的强弱与其所使用的乳酸菌的种类密切相关。从自然环境中筛选出适合生产降血压发酵产品的乳酸菌具有重要的意义。我国自古就有“药食同源”的说法，通过改善饮食状况预防和治疗疾病。源于牛乳中蛋白的降压肽只对高血压患者起降压的作用，对正常血压无降压作用，这些肽又是利用酶解产生，安全性高。如将具有降压作用的乳酸菌与降血压肽结合开发成保健食品，长期服用可预防、缓解和辅助治疗高血压，这种方式必将为人们所接受。随着人们生活水平的提高，人们越来越重视食品的天然性和功能性，因此将降血压肽和益生菌结合生产功能性酸乳，具有十分广阔的前景。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种具有较强降血压作用的青春双歧杆菌。

本发明青春双歧杆菌grx066，于2008年3月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。保藏编号：CGMCC NO.2406，分类命名：青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)。

经试验验证，本发明所述青春双歧杆菌grx066对低pH和高胆汁酸盐具有抗性，表明本发明菌株具有耐受人消化道不良环境能力。

利用本发明菌株发酵牛乳，可以大量产生具有抑制血压升高的活性物质-血管紧张素转换酶抑制肽(Angiotensin I-Converting Enzyme Peptide，ACEIP)。即利用热处理(如95℃/5分钟)冷却到37℃后的牛乳接种2％～5％的本发明菌株，经37℃培养16～18小时，此时发酵乳对ACE的抑制活性最大，表明本发明菌株、代谢产物及分解产物具有很强的抑制血管紧张素转换酶的活性。

本发明的第二目的是发明青春双歧杆菌grx066的制备方法。

包括以下步骤：

(1)通过培养基从传统乳制品中分离获得乳酸菌；

(2)利用酶比色法筛选出其发酵乳抑制血管紧张素转换酶(AngiotensinI-Converting Enzyme，ACE)活性比较强的菌株；

通过细菌形态学、生理学和培养特征，并通过法国梅埃里公司API系列鉴定试剂条和16SrRNA进行分析鉴定，证实了通过以上方法制备的菌株是具有较强抑制血压升高的青春双歧杆菌菌株grx066。

本发明的第三目的是发明青春双歧杆菌grx066的用途。

青春双歧杆菌grx066可用于生产具有降血压功能的乳制品。

将青春双歧杆菌grx066与液态乳共发酵后用于制备酸奶或乳酸菌饮料或冰淇淋。

也可将青春双歧杆菌grx066培养物经冷冻干燥用于生产具有降血压功能的食品。

由于乳制品中含有青春双歧杆菌grx066而成为具有辅助治疗和稳定高血压症状作用的一种食疗性产品。

附图说明

图1为本发明所述青春双歧杆菌grx066经平板培养的菌落形态观察图。

图2为本发明所述青春双歧杆菌grx066经革兰氏染色的普通光学显微结构照。

具体实施方式

一、样品来源

本例菌株来源于我国新疆民族传统乳制品-酸马奶。酸马奶俗称马奶酒，是我国蒙古族和哈萨克族等少数民族地区的传统乳制品，是一种珍贵的发酵乳产品。

二、从酸马奶中分离出乳酸菌

将新疆民族传统乳制品酸马奶样品接种到MRS培养物中于37℃培养24小时。将该培养物涂布在MRS琼脂平板上，然后在37℃厌氧培养3天。培养后，收集在琼脂培养基上出现的菌落，并进一步纯化，用其检测细菌特征，如下文所述的革兰氏染色模式(如图2)、糖酵解能力等。

将分离获得的菌株用含11％脱脂乳的肉汤培养物培养后加入保护剂冻干，保存在-18℃，然后用于各种检测细菌特征的试验。

三、体外筛选具有抑制能力强的菌株

本发明主要通过比较其不同分离菌株发酵乳的ACE抑制活性，从而获得抑制血管紧张素转换酶能力强的益生菌。

(1)原理：在一定条件下，HHL经ACE的作用生成马尿酸，其反应式可表示如下：

HHL+ACE→Hip+His-Leu

其中：HHL为马尿酰组氨酰亮氨酸；Hip为马尿酸(hippuric acid)；His-Leu为组氨酰亮氨酸。马尿酸在228nm处有最大吸收，因此可以通过马尿酸的生成量来反映ACE的活力大小。

(2)材料与试剂：脱脂乳粉、血管紧张素转化酶(ACE、Sigma公司)、马尿酰组氨酰亮氨酸(HHL、Sigma公司)。

(3)仪器设备：UV-2401PC型紫外分光光度计(日本岛津公司)、SW-CJ-IF型无菌操作台(苏州安泰空气技术有限公司)、SPX-150BS-II生化培养箱(上海新苗医疗器械制造有限公司)。

(4)ACE抑制活性的测定：ACE抑制活性测定方法具体操作步骤和设计如表4所示。按下式公式计算ACE抑制活性。

式中：Aa为样品a的光密度值，是ACE与HHL同时反应的样品；

Ab为样品b的光密度值，是ACE与HHL完全反应的对照；

Ac为样品c的光密度值，是ACE与HHL反应的空白。

表1ACE抑制率体外检测方法

(5)本发明菌株发酵乳的制备：将脱脂乳粉按照11％NFS的比例复原为脱脂乳，再经95℃，5min热处理后，冷却到37℃，接种4％的经3代活化的乳酸菌发酵剂，在37℃培养17-24h，测定分离的不同乳酸菌菌株发酵乳对ACE的抑制活性。

通过比较发现，从分离获得的126株乳酸菌中，104株ACEI活性在60％-70％；21株ACEI活性在70％-85％；本发明青春双歧杆菌grx066的ACEI活性最高，达87.91％。

四、革兰氏染色

采用革兰氏染色法检测菌株的特征。结果如图2所示，发明菌株呈革兰氏阳性菌，为无芽孢，棒状，大小为1.0-1.5um，这是双歧杆菌属的典型特征。

然后，研究该乳酸菌，以阐明其培养特征。结果是，该菌种在MRS琼脂平板上厌氧培养长成直径为2-3mm的灰色菌落(图1)，最适培养温度为37℃。

且，青春双歧杆菌grx066已于2008年3月17日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，并获得保藏号CGMCCNo.2406。

五、耐酸性试验

将肉汤培养基与11％脱脂乳培养基按1∶1比例混合，用10mol/L的HCl调节其pH值分别为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5。然后接种3％本发明菌株培养液，37℃培养2天和4天。测量第2天和第4天细菌的数量，结果如表2。

在pH1.0的培养基中，第2天检测到的pH为1.0-0.86，没有分离到乳酸菌。

在pH1.5的培养基中，第2天检测到的pH为1.5-2，分离到少于10²cfu/mL的乳酸菌。

在pH2.0的培养基中，第2天检测到的pH为2.2-2.5，分离到10⁵cfu/mL的乳酸菌。

在pH2.5的培养基中，第2天检测到的pH为2.7-3，分离到10⁶cfu/mL的乳酸菌。

在PH3.0的培养基中，第2天检测到的pH为3.4-3.6，分离到10⁷cfu/mL的乳酸菌。

在pH3.5的培养基中，第2天检测到的pH为3.6-3.7，分离到10⁶cfu/mL的乳酸菌。

在上述pH基础上进行的第4天培养的检测，结果发现，乳酸菌的数量与第2天检测到数量相近。

表2本发明菌株的耐酸特性

#初始活菌数量为7×10⁹cfu/mL。

总结：本发明具有良好耐酸能力。

六、菌株的耐胆汁能力试验

为了研究本发明菌株的耐胆汁能力，在11％的脱脂乳中加入猪胆盐，使胆汁的浓度分别为1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％和4.5％。分别接种3％本发明菌株培养物，在37℃厌氧条件下培养2天和4天，测量活菌数量，结果见表3。

胆汁浓度分别为1.0％、1.5％、2.0％、2.5％的脱脂乳中细菌的数量在10^5-8cfu/mL的范围内；胆汁浓度为3.0％和3.5％的脱脂乳中细菌的数量为10^3-4cfu/mL；胆汁浓度为4.0％的脱脂乳中细菌的数量减到10²cfu/mL，这个结果证明了该菌株对胆汁具有耐性。

表3本发明菌株的耐胆汁特性

#初始活菌数量为5×10⁹cfu/mL。

总结：本发明具有良好耐胆汁酸盐能力。

七、菌株的糖发酵分析

表4为青春双歧杆菌grx066使用API20A鉴定系统进行的糖发酵反应分析结果。结果与API150CHL系统说明比对，表明本发明菌株为青春双歧杆菌。

表4API20A鉴定系统反应结果

注：“+”表示阳性反应，“-”表示阴性反应。

八、应用实施例

1、具有降血压功能、含本发明菌株酸奶的制作方法：

将鲜奶加热到50℃以上，加入6％的白砂糖搅拌至完全溶解，预热到60～65℃，20Mpa压力均质，90℃左右杀菌5-10分钟，冷却至40～43℃，接种。接种数量为：每1g上述混合物接种嗜热链球菌(如嗜热链球菌ATCC14485)1～500×10⁶cfu/mL、青春双歧杆菌grx 066 1～5000×10⁶cfu/mL。40～42℃发酵至pH值为4.2～4.5，搅拌，冷藏，即制成含活性青春双歧杆菌酸奶。

2、具有降血压功能、含本发明菌株乳酸菌饮料的制作方法：

按应用实施例1制备好酸奶，将酸奶用杀菌并冷却的水、糖浆、乳化稳定剂等混合物稀释2-4倍，制成可直接饮用的乳酸菌饮料。

3、具有降血压功能、含本发明菌株冰淇淋的制作方法：

按应用实施例1制备好酸奶，冰淇淋原料配比如表5所示。

表54000g冰淇淋配方

原料	质量百分比(％)
		青春双歧杆菌酸奶	1600g
白砂糖	300g
		全脂奶粉	250g
黄奶油	125g
		椰子油	92g
糖浆	105g
		乳化稳定剂	24g
水	1104g

将除酸奶以外的其它物料混合，预热到60～65℃，采用20Mpa～30Mpa进行均质，然后在80℃/20s杀菌，冷却到40～50℃，与酸奶混合，采用20Mpa～30Mpa进行均质，在2℃～4℃时，老化时间4h，经凝冻后经过硬化的为硬质冰淇淋，不经硬化的为软质冰淇淋。

4、具有降血压功能、本发明菌种产品的制作方法：

将青春双歧杆菌grx 066冷冻至-40℃～-60℃，经干燥，至含水量为3％～5％，压碎成粉末状，可将粉末状产品加入奶粉、低聚糖、麦芽糊精、风味剂等制成粉末状或片、块状产品，用于日常食用。

此外，本发明还可提供含有作为有效成分的青春双歧杆菌grx 066发酵产物的食物组合物。

以上本发明提供的菌株发酵的各种产物可起到降低高血压的作用，该菌株发酵的牛奶，获得的经乳酸菌发酵的各种发酵乳产品、乳酸菌饮料产品等等，都获得了具有不同程度的降低高血压的特性。

Claims (4)

1.青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)grx066，其特征在于：保藏号为CGMCC No：2406。

2.一种如权利要求1所述青春双歧杆菌grx066的用途，其特征在于：用于生产具有降血压功能的食品。

3.根据权利要求2所述青春双歧杆菌grx066的用途，其特征在于将青春双歧杆菌grx066与液态乳共发酵后用于制备酸奶或乳酸菌饮料或冰淇淋。

4.根据权利要求2所述青春双歧杆菌grx066的用途，其特征在于将青春双歧杆菌grx066经冷冻干燥用于生产具有降血压功能的食品。

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