CN109536424A - 一种短乳杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种短乳杆菌，于2018年7月17日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)予以保藏，保藏编号为：CGMCC No.16125。本发明提供的短乳杆菌具有调理人体胃肠道健康的功能。

Description

一种短乳杆菌及其应用
技术领域
本发明属于人体微生态学技术领域，尤其涉及一种短乳杆菌及其应用。
背景技术
各种微生物(细菌)经常从不同的环境附到人体，并能在一定部位定居和不断生长、繁殖后代，这种现象通常称为“细菌定植”。定植的微生物必须依靠人体不断供给营养物质才能生长和繁殖，才能进而对人体产生影响。短乳杆菌作为人体、动物体内有益的细菌，定植于人体肠道、生殖系统内，发挥改善胃肠道健康的作用。
例如，中国专利文献CN102660477A中公开了一种乳杆菌及其冻干菌粉与应用，其中涉及的短乳杆菌CGMCC No.5760与本专利的短乳杆菌比较具有如下缺陷：
1、短乳杆菌CGMCC No.5760对大肠杆菌的抑菌直径是16mm,对沙门氏菌的抑菌直径是14.8mm,对金黄色葡萄球菌的抑菌直径是14.3mm，因此，抑制病原菌能力较弱。
2、冻干菌粉的冻干工艺直接关系到冻干后菌粉的存活率，其制为冻干菌粉后，活菌数量较低，影响其效用。
发明内容
为此，本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种抑制病原菌能力强的短乳杆菌。
本发明所要解决的第二个技术问题是现有技术中的冻干菌粉工艺得到的短乳杆菌菌粉的存活率低的问题，进而提供一种菌株存活率高的短乳杆菌冻干粉的制备方法。
本发明的短乳杆菌，于2018年7月17日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)予以保藏，保藏编号为：CGMCC No.16125。
所述的短乳杆菌，其16SrDNA序列具有如SEQ ID NO.1所示的序列结构。所述SEQID NO.1的序列结构具体如下：
ggatgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgaacgagttctcgttgatgatcggtgcttgcaccgagattcaacatggaacgagtggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcccttaagtgggggataacatttggaaacagatgctaataccgcatagatccaagaaccgcatggttcttggctgaaagatggcgtaagctatcgcttttggatggacccgcggcgtattagctagttggtgaggtaatggctcaccaaggcgatgatacgtagccgaactgagaggttgatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatggacgcaagtctgatggagcaacgccgcgtgagtgaagaaggctttcgggtcgtaaaactctgatgttggagaagaatggtcggcagagtaactgttgccggcgtgacggtatccaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttatccagatttattgggcgtaaagcgagcgcaggcggttttttaagtctgatgtgaaagccctcggcttaaccgaggaagcgcatcggaaactgggaaacttgagtgcagaagaggacagtggaactccatgtgtagcggtgaaatgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcggctgtctggtctgtaactgacgctgaggctcgaaagcatgggtagcgaacaggattagataccctggtagtccatgccgtaaacgatgaatgctaggtgttggagggtttccgcccttcagtgccgcagctaacgcattaagcattccgcctggggagtacgaccgcaaggttgaaactcaaaggaattgacgggggcacgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcttttgatcacttgagagatcaggtttccccttcgggggcaaaatgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatgactagttgccagcatttagttgggcactctagtaagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggatggtacaacgagttgcgagaccgcgaggtcaagctaatctcttaaagccattctcagttcggactgtaggctgcaactcgcctacacgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagcacgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgagagtttgtaacacccgaagccggtggcgtaacccttttagggagcgagccgtct。
所述的短乳杆菌在制备调理胃肠道健康的保健品、乳制品、药物中的应用。
优选地，所述的短乳杆菌在制备治疗和/或预防腹泻的保健品、药物中的应用。
进一步优选地，所述保健品包括短乳杆菌冻干粉。
本发明的由所述的短乳杆菌制备得到的短乳杆菌冻干粉。
本发明的短乳杆菌冻干粉的制备方法，包括如下步骤：向所述的短乳杆菌中加入保护剂，混合均匀，将其置于-30～-50℃的温度下预冻1-3h，然后置于-10～-20℃的温度下升华10-20h，再置于15～35℃的温度下升华1-5h，在真空下放置1-10h后，即得短乳杆菌冻干粉。
优选地，所述保护剂为脱脂奶粉、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、甘露醇、谷氨酸钠、L-半胱氨酸、明胶中的一种或多种。
优选地，所述的短乳杆菌冻干粉的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)取所述的短乳杆菌，厌氧培养，得到发酵液；
(2)取步骤(1)中发酵得到的所述发酵液，将其置于转速为8000-12000r/min下，离心10-60min，收集菌泥；
(3)向步骤(2)中得到的菌泥中加入所述保护剂，所述保护剂与所述菌泥的重量比为3:1，混合均匀，将其置于-40℃的温度下预冻3h，然后置于-15℃的温度下升华15h，再置于25℃的温度下升华2h，在真空下放置2h后，使所述菌泥的含水量小于5％，即得短乳杆菌冻干粉。
优选地，步骤(1)具体包括如下步骤：取所述的短乳杆菌，按照0.5-3％的接种量接种至LYT发酵培养基中厌氧培养，在温度为37±3℃、转速为30-80rpm、发酵罐的罐压为0.03-0.08Mpa的条件下，发酵12-24h，在对数生长期得到一级发酵液；然后，取所述一级发酵液，按照5-10％的接种量接种至LYT发酵培养基中，在温度为37±3℃、转速为100-200rpm、发酵罐的罐压为0.03-0.08Mpa的条件下，厌氧培养15-28h，得到对数期生长的二级发酵液；再取所述二级发酵液，按照5-12％的接种量接种至LYT发酵培养基中，在温度为37±3℃、转速为100-200rpm、发酵罐的罐压为0.03-0.08Mpa的条件下，厌氧培养18-36h，得到对数期生长的短乳杆菌的三级发酵液。
进一步优选地，步骤(1)具体包括如下步骤：取所述的短乳杆菌，按照1％的接种量接种至LYT发酵培养基中厌氧培养，在温度为37℃、转速为50rpm、发酵罐的罐压为0.05Mpa的条件下，发酵18h，在对数生长期得到一级发酵液；然后，取所述一级发酵液，按照8％的接种量接种至LYT发酵培养基中，在温度为37℃、转速为150rpm、发酵罐的罐压为0.05Mpa的条件下，厌氧培养20h，得到对数期生长的二级发酵液；再取所述二级发酵液，按照7.5％的接种量接种至LYT发酵培养基中，在温度为37℃、转速为150rpm、发酵罐的罐压为0.05Mpa的条件下，厌氧培养24h，得到对数期生长的短乳杆菌的三级发酵液。
进一步优选地，步骤(1)中，所述LYT发酵培养基的pH值为7.0，具体包括如下重量份的原料：
蛋白胨2.0重量份；酵母浸粉2.0重量份；葡萄糖2.0重量份；微量盐4.0重量份，L-半胱氨酸盐0.05重量份；
所述微量盐包括如下原料：氯化钙0.2g/L，硫酸镁0.48g/L，碳酸氢钠10g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，磷酸氢二钾1.0g/L，氯化钠2.0g/L。
本发明的上述技术方案，相比现有技术具有以下优点：
(1)本发明所述的短乳杆菌，从婴儿粪便分离大量的短乳杆菌，根据抑制病源菌能力、产酸能力、消化能力等试验，筛选出能够较好地消化蛋白、肉渣、玉米、淀粉、树叶、草的短乳杆菌，得到本发明所述的短乳杆菌，将其用于人体，因为同源菌种好定殖，短乳杆菌会抑制有害菌，进而维护肠道菌群生态平衡，形成生物屏障，抑制有害菌对肠道的入侵。另外，所述短乳杆菌还可以通过产生大量的短链脂肪酸促进肠道蠕动及菌体大量生长改变渗透压而防止便秘。此外，菌体崩解产物和代谢物中含有多种酶、小肽、短链脂肪酸等成分，补充营养成分等优势。
(2)本发明所述的短乳杆菌，在人的胃肠道疾病中，特别是腹泻发挥了很好的预防和治疗作用，并且通过多种途径弥补了抗生素和疫苗的不足，为人类的健康和获得安全的食品开辟了新的途径。
(3)本发明所述的短乳杆菌，对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的抑菌直径较大，具有较强的抑制病原菌能力。
(4)本发明所述的短乳杆菌，耐酸耐胆盐性良好，且经过冻干粉等工艺操作后菌株活性仍然较为理想、种子的保存期长。且通过本发明所述的短乳杆菌冻干粉的制备方法制备，制备过程中，采用特定的保护剂，使制为冻干粉后短乳杆菌的保持较高的存活率。
附图说明
图1是本发明所述的短乳杆菌的显微图；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本实施例的短乳杆菌，于2018年7月17日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)予以保藏，保藏编号为CGMCC No.16125。
实施例1短乳杆菌的分离筛选
保藏编号为CGMCC No.16125的所述短乳杆菌通过如下方法分离得到：
将人体肠道粪便1克，装入由30个玻璃球的灭菌瓶内加生理盐水作100倍稀释充分打均后，再作10-3、10-4、依次到10-8稀释度，取10-4、10-5、10-6、10-7、10-8五个稀释度的菌液分别接种于LYT(自制的)通用琼脂平板、伊红、美兰琼脂、BB(BS)双歧杆菌选择性培养基、LBS(LC)乳酸杆菌选择性培养基、EC肠球菌择基和Sb酵母菌择基。每种培养基接6个平板，接种后立即上下翻转培养皿使接种液在平皿表面均匀扩散。其中3个作需氧培养，24小时后即观察。另3个作厌氧培养48小时。经过肉眼观察和解剖显微镜45℃角折射光观察。将每种菌落再移植到LYT琼脂一个菌落及液体培养基一个菌落，分别做厌氧和需氧，同时涂片作革兰氏染色镜检，分离出138个菌株，进行鉴定结果属于8个科，11个属的36种菌，其中所分离筛选出的菌种每月继代一次，5代前冻干保存。
得到的所述短乳杆菌的菌种为革兰氏阳性菌，其特性如下：
所述短乳杆菌大小为0.7～1.0×2～4μm，呈单个或双链排列，其菌落为小菌落，呈乳白色，半透明，表面粗糙，45°折光观察，其分布均匀，有彩色光带，其微观结构如图1所示。
所述短乳杆菌能发酵葡萄糖、阿拉伯糖、葡萄糖酸盐、麦芽糖、松三糖和核糖。以下对所述短乳杆菌9084株的第1代、第10代、第13代生产种第1代、第10代、第13代生产种子制备的菌液活菌数进行测试。其测试结果如下：
表1不同传代次数的短乳杆菌的OD值及活菌数
上述结果显示生产种子传至13代时，所述短乳杆菌不低于1.0×108CFU/mL，其能够保证生物制品生产的正常进行，表明所述短乳杆菌保藏编号为CGMCC No.16125株生产种子在1-13代活力稳定。
所述的短乳杆菌，其16SrDNA序列具有如SEQ ID NO.1所示的序列结构。所述SEQID NO.1的序列结构具体如下：ggatgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgaacgagttctcgttgatgatcggtgcttgcaccgagattcaacatggaacgagtggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcccttaagtgggggataacatttggaaacagatgctaataccgcatagatccaagaaccgcatggttcttggctgaaagatggcgtaagctatcgcttttggatggacccgcggcgtattagctagttggtgaggtaatggctcaccaaggcgatgatacgtagccgaactgagaggttgatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatggacgcaagtctgatggagcaacgccgcgtgagtgaagaaggctttcgggtcgtaaaactctgatgttggagaagaatggtcggcagagtaactgttgccggcgtgacggtatccaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttatccagatttattgggcgtaaagcgagcgcaggcggttttttaagtctgatgtgaaagccctcggcttaaccgaggaagcgcatcggaaactgggaaacttgagtgcagaagaggacagtggaactccatgtgtagcggtgaaatgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcggctgtctggtctgtaactgacgctgaggctcgaaagcatgggtagcgaacaggattagataccctggtagtccatgccgtaaacgatgaatgctaggtgttggagggtttccgcccttcagtgccgcagctaacgcattaagcattccgcctggggagtacgaccgcaaggttgaaactcaaaggaattgacgggggcacgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcttttgatcacttgagagatcaggtttccccttcgggggcaaaatgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatgactagttgccagcatttagttgggcactctagtaagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggatggtacaacgagttgcgagaccgcgaggtcaagctaatctcttaaagccattctcagttcggactgtaggctgcaactcgcctacacgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagcacgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgagagtttgtaacacccgaagccggtggcgtaacccttttagggagcgagccgtct。
实施例2短乳杆菌冻干粉的制备
本实施例的短乳杆菌为保藏编号为CGMCC No.16125的菌株，其通过如下方法制备为短乳杆菌冻干粉：
(1)取所述的短乳杆菌，按照1％的接种量接种至装有35L的LYT发酵培养基的50L发酵罐中，在温度为37℃、转速为50rpm、发酵罐的罐压为0.05Mpa的条件下，发酵18h，在对数生长期得到一级发酵液；然后，取所述一级发酵液，按照8％的接种量接种至装有LYT发酵培养基的发酵罐中，在温度为37℃、转速为150rpm、发酵罐的罐压为0.05Mpa的条件下，厌氧培养20h，得到对数期生长的二级发酵液；再取所述二级发酵液，按照7.5％的接种量接种至LYT发酵培养基中，在温度为37℃、转速为150rpm、发酵罐的罐压为0.05Mpa的条件下，厌氧培养24h，得到对数期生长的短乳杆菌的三级发酵液。
其中，所述LYT发酵培养基的pH值为7.0，具体包括如下重量份的原料：蛋白胨2.0重量份；酵母浸粉2.0重量份；葡萄糖2.0重量份；微量盐4.0重量份，L-半胱氨酸盐0.05重量份；
所述微量盐包括如下原料：氯化钙0.2g/L，硫酸镁0.48g/L，碳酸氢钠10g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，磷酸氢二钾1.0g/L，氯化钠2.0g/L。
由于短乳杆菌为兼性厌氧菌，厌氧培养长的更好，因此，采用上述方法培养所述短乳杆菌，菌株活性、繁殖生长状况更优。作为本实施例的优选实现方式，还包括在制备所述一级发酵液、二级发酵液、三级发酵液时进行检验的步骤，其具体如下：得到所述一级发酵液应纯粹，且OD600值为1.8-2.3；得到的所述二级发酵液应纯粹，且OD600值为1.8-2.4；得到的所述三级发酵液应纯粹。
(2)取步骤(1)中发酵得到的所述发酵液，将其置于离心机中，转速为8000r/min，离心60min，收集菌泥；
(3)向步骤(2)中得到的菌泥中加入所述保护剂，所述保护剂为蔗糖、脱脂奶粉和明胶按照5:3:1的重量比混合而成。将所述蔗糖、所述脱脂奶粉、所述明胶混合均匀，经115℃灭菌30min，待冷却至室温后，在无菌条件下与所述菌泥按照3:1的重量比混匀，制成菌悬液，将其置于-40℃的温度下预冻3h，然后置于-15℃的温度下升华15h，再置于25℃的温度下升华2h，在真空下放置2h后，使所述菌泥的含水量小于5％，即得短乳杆菌冻干粉。
实施例3短乳杆菌冻干粉的制备
本实施例的短乳杆菌为保藏编号为CGMCC No.16125的菌株，其通过如下方法制备为短乳杆菌冻干粉：
(1)取所述的短乳杆菌，按照3％的接种量接种至LYT发酵培养基中厌氧培养，在温度为37±3℃、转速为30rpm、发酵罐的罐压为0.08Mpa的条件下，发酵12h，在对数生长期得到一级发酵液；然后，取所述一级发酵液，按照5％的接种量接种至LYT发酵培养基中，在温度为37±3℃、转速为100rpm、发酵罐的罐压为0.03Mpa的条件下，厌氧培养28h，得到对数期生长的二级发酵液；再取所述二级发酵液，按照12％的接种量接种至LYT发酵培养基中，在温度为37±3℃、转速为200rpm、发酵罐的罐压为0.08Mpa的条件下，厌氧培养36h，得到对数期生长的短乳杆菌的三级发酵液。
(2)取步骤(1)中发酵得到的所述发酵液，将其置于转速为12000r/min下，离心10min，收集菌泥；
(3)向步骤(2)中得到的菌泥中加入所述保护剂，所述保护剂为蔗糖、脱脂奶粉和明胶按照5:3:1的重量比混合而成。所述保护剂与所述菌泥的重量比为3:1，混合均匀，将其置于-40℃的温度下预冻3h，然后置于-15℃的温度下升华15h，再置于25℃的温度下升华2h，在真空下放置2h后，使所述菌泥的含水量小于5％，即得短乳杆菌冻干粉。
作为本实施可替换的实现方式，所述保护剂还可替换为脱脂奶粉、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、甘露醇、谷氨酸钠、L-半胱氨酸、明胶中的一种或多种。
效果试验例
为验证本发明的技术效果，进行以下实验：
实验一、保藏编号为CGMCC No.16125的短乳杆菌种子的保存期试验
取保藏编号为CGMCC No.16125的所述短乳杆菌，将基础种子冻干粉于-80℃条件下保存，保存期为2年，每两年检测一次。
活菌基数的方法具体如下：
无菌称取3g产品制剂，加入27mL PTYG液体培养基或生理盐水，充分摇匀(用数个玻璃球摇打)后作10倍系列稀释，选择适宜稀释度进行接种。采用LBS选择性培养基，细菌的每个稀释度按0.2mL接种3个平板，并迅速转动平板，使菌液在培养基表面流匀。培养48小时后，观察每个平板上的细菌生长情况，并计数。当每个平皿上的菌落数小于10或大于300时，应重新调整最后稀释度，重新测定。每克制剂中，短乳杆菌应不少于1.0×107CFU。根据3个平皿菌落总数按下列公式计算活菌数：
检测结果如下：
表2短乳杆菌的菌株在-80℃保存不同时间的活菌数
表3短乳杆菌的菌株在4℃保存不同时间的活菌数
表4短乳杆菌的菌株在25℃保存不同时间的活菌数
实验二、短乳杆菌的活菌数对比实验
取实施例2中制备得到的所述的短乳杆菌冻干粉，记为CGMCC No.16125组；取中国专利文献CN102660477A中保藏编号为CGMCC No.5760的短乳杆菌，按照该文献中的方法制备得到冻干粉，记为CGMCC No.5760组；按照实验一的方法检测两组的菌粉在常温下保存不同时间的活菌数。
其实验结果如下：
实验三、菌株的耐酸耐胆盐特性实验
pH对益生菌在体内存活的影响是非常重要的。单纯的体外酸耐受性试验多将胃酸pH设定为3～3.5，因为动物，特别是幼龄动物胃内的pH一般在3～4左右，小肠内pH在4～5左右，大肠内高达5以上。此外作用时间也是进行此类试验时应考虑的重要问题之一。由于胆盐的存在改变了菌体外膜的通透性，所以对益生菌产生抑制、杀灭作用，进而影响益生菌的存活。
耐胃酸试验：取保藏编号为CGMCC No.16125的所述短乳杆菌，以人工胃液为基础，然后按10％接种量接入已活化两代的液体培养物，37℃静置培养，分别于0、1、2、4h取样测定活菌数。
耐胆酸盐试验：取保藏编号为CGMCC No.16125的所述短乳杆菌，以人工肠液为基础，加入0.3％的3号胆盐，然后按照10％的接种量接入活化两代的双歧杆菌液体培养物，37℃静置培养，分别于0、1、2、4h取样测定活菌数，并计算存活率。
耐胃酸的检测结果如下：
耐胆酸盐的检测结果如下：
实验四、抑制病原菌能力对比实验
取本发明的保藏编号为CGMCC No.16125的所述短乳杆菌记为，以及中国专利文献CN102660477A中保藏编号为CGMCC No.5760的短乳杆菌，分别检测其对强毒大肠杆菌EC82—86、强毒沙门氏菌C79—14、腐生葡萄球菌SS9084(由中国药检所提供)的抑菌半径，并记录。
其检测结果如下：
实验五、保护剂对冻干粉工艺的影响实验
本实验以存活率为指标，考察对保护剂的冻干保护作用。按照实施例2中的方式制备短乳杆菌冻干粉，区别仅在于：将保护剂分别替换为脱脂奶粉、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、谷氨酸钠、L-半胱氨酸、明胶、甘露醇，制备得到短乳杆菌，分别测试得到的短乳杆菌冻干粉在常温下保存30天后的存活率。
由此可见，单一的成分作为保护剂的效果并不理想。为了验证该工艺的稳定性，对实施例2中的方案进行三次实验验证，活菌率结果分别为91.6、92.5、95.9，误差率＜4％，证实结果稳定可靠。
按照实施例2中的方式制备短乳杆菌冻干粉，区别仅在于：将保护剂分别替换为将脱脂奶粉、蔗糖、明胶三种成分按照1:1:1的重量比混合，并将其记为第一组；将脱脂奶粉、蔗糖、明胶三种成分按照1:3:2的重量比混合，并将其记为第二组；将脱脂奶粉、蔗糖、明胶三种成分按照1:5:3的重量比混合，并将其记为第三组；将脱脂奶粉、蔗糖、明胶三种成分按照2:1:2的重量比混合，并将其记为第四组；将脱脂奶粉、蔗糖、明胶三种成分按照2:3:3的重量比混合，并将其记为第五组；将脱脂奶粉、蔗糖、明胶三种成分按照2:5:1的重量比混合，并将其记为第六组；将脱脂奶粉、蔗糖、明胶三种成分按照3:1:3的重量比混合，并将其记为第七组；将脱脂奶粉、蔗糖、明胶三种成分按照3:3:2的重量比混合，并将其记为第八组；将实施例2制备得到的短乳杆菌冻干粉，记为第九组。分别测试上述各组得到的短乳杆菌冻干粉在常温下保存30天后的存活率。
其检测结果如下：
实验六、所述短乳杆菌对小白鼠安全性试验
取20-22g的小白鼠，清洁级试验用小白鼠40只，分4组，每组10只，其中1-3组均给于本发明所述的短乳杆菌的活菌制剂，其中，所述短乳杆菌不低于1.0×108CFU，给药周期为3天，给药结束后，观察所有小白鼠的临床症状，对试验结果进行评价。
观察喂药后小白鼠的精神、采食、饮水、生长、增重等临床情况，以及观察试验期间动物是否有与药物相关的不良反应，如呼吸、行为异常、精神抑制及排粪异常等变化情况。并于给药前当天(第1天)以及实验结束的第13天记录每组小白鼠的重量，计算小白鼠的日均增重。
其实验结果如下：
各组在试验期间小白鼠全部健活，精神良好，食欲旺盛，皮毛肤色正常，排便排尿色泽形态正常，无其他异常临床症状、无生病及死亡显现。
分别于给药前当天(第1天)、实验结束后第13天对每组小白鼠进行称重，并计算各组平均日增重。结果见下表：
从表中发现3个实验组的小白鼠日均增重明显高于空白对照的第4组，表明本发明所述的短乳杆菌对小白鼠有增重作用，且给药安全性检验合格。实验七、所述短乳杆菌对犬肠道菌群失调腹泻模型的改善效果实验
本试验采用头孢氨苄作为诱导药物，通过持续给药导致比格犬肠道菌群紊乱，构建试验犬抗生素相关性腹泻，具体包括如下步骤：取3.5～4月龄，体重5.0～6.5kg的普通级试验用比格犬25只，其中5只，作为对照组，另外20只以梯度增加诱导药物剂量的方式，连续给予抗生素诱导，构建试验犬肠道菌群失调腹泻模型，抗生素诱导15～20天，构模成功。将经抗生素诱导的20只比格犬分为高剂量组、中剂量组、低剂量组、模型组，对高剂量组、中剂量组、低剂量组分别给予高、中、低剂量的本发明所述的短乳杆菌的活菌制剂，模型组不给药，给药周期为6～8天，给药结束后，观察所有犬只的临床症状。
其实验结果如下：
造模前，各组比格犬活泼好动，被毛平整光滑、粪便干燥成形，较为正常。造模结束时，对照组比格犬饮食正常，行动活跃，排便次数规律，粪便干燥成形。经抗生素诱导的试验犬逐步出现大便稀湿、机敏性降低、偶有厌食或乏力、呕吐等症状，属于抗生素过量致肠道菌群失调所导致的典型症状。
经造模的比格犬，在治疗第5天，中、高剂量治疗组犬只稀便情况明显改善，由稀便恢复至成形便(中、高剂量治疗组3只犬成形软便，2只犬粪便成形干燥)，但与对照组相比，水分稍多，至治疗第7天，中、高剂量组犬只粪便成形，水分少，与对照组犬只粪便基本一致。低剂量治疗组犬只至喂药治疗第7天，有3只犬开始恢复至成形便，但水分偏多。模型组腹泻犬只症状虽有改善，但粪便仍为不成形稀便，而中、高剂量治疗组5只犬粪便成形，未见有持续腹泻情况或腹泻复发的情况。由此可见，本发明所述的短途杆菌具有调理胃肠道健康的功能。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
SEQUENCE LISTING
<110> 谭瑛
<120> 一种短乳杆菌及其应用
<130> 2018
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1469
<212> DNA
<213> 短乳杆菌
<400> 1
ggatgaacgc tggcggcgtg cctaatacat gcaagtcgaa cgagttctcg ttgatgatcg 60
gtgcttgcac cgagattcaa catggaacga gtggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa 120
cctgccctta agtgggggat aacatttgga aacagatgct aataccgcat agatccaaga 180
accgcatggt tcttggctga aagatggcgt aagctatcgc ttttggatgg acccgcggcg 240
tattagctag ttggtgaggt aatggctcac caaggcgatg atacgtagcc gaactgagag 300
gttgatcggc cacattggga ctgagacacg gcccaaactc ctacgggagg cagcagtagg 360
gaatcttcca caatggacgc aagtctgatg gagcaacgcc gcgtgagtga agaaggcttt 420
cgggtcgtaa aactctgatg ttggagaaga atggtcggca gagtaactgt tgccggcgtg 480
acggtatcca accagaaagc cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg 540
tggcaagcgt tatccagatt tattgggcgt aaagcgagcg caggcggttt tttaagtctg 600
atgtgaaagc cctcggctta accgaggaag cgcatcggaa actgggaaac ttgagtgcag 660
aagaggacag tggaactcca tgtgtagcgg tgaaatgcgt agatatatgg aagaacacca 720
gtggcgaagg cggctgtctg gtctgtaact gacgctgagg ctcgaaagca tgggtagcga 780
acaggattag ataccctggt agtccatgcc gtaaacgatg aatgctaggt gttggagggt 840
ttccgccctt cagtgccgca gctaacgcat taagcattcc gcctggggag tacgaccgca 900
aggttgaaac tcaaaggaat tgacgggggc acgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat 960
tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatctt ttgatcactt gagagatcag 1020
gtttcccctt cgggggcaaa atgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga 1080
gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttatga ctagttgcca gcatttagtt 1140
gggcactcta gtaagactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca 1200
tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg gatggtacaa cgagttgcga 1260
gaccgcgagg tcaagctaat ctcttaaagc cattctcagt tcggactgta ggctgcaact 1320
cgcctacacg aagtcggaat cgctagtaat cgcggatcag cacgccgcgg tgaatacgtt 1380
cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac catgagagtt tgtaacaccc gaagccggtg 1440
gcgtaaccct tttagggagc gagccgtct 1469

Claims (10)

1.一种短乳杆菌，其保藏编号为CGMCC NO.16125。
2.根据权利要求1所述的短乳杆菌，其特征在于，所述短乳杆菌的16SrDNA序列具有如SEQ ID NO.1所示的序列结构。
3.权利要求1或2中所述的短乳杆菌在制备调理胃肠道健康的保健品、乳制品、药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的短乳杆菌在制备治疗和/或预防腹泻的保健品、药物中的应用。
5.一种由权利要求1或2所述的短乳杆菌制备得到的短乳杆菌冻干粉。
6.一种短乳杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：向权利要求1或2中所述的短乳杆菌中加入保护剂，混合均匀，将其置于-30～-50℃的温度下预冻1-3h，然后置于-10～-20℃的温度下升华10-20h，再置于15～35℃的温度下升华1-5h，在真空下放置1-10h后，即得短乳杆菌冻干粉。
7.根据权利要求6所述的短乳杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，所述保护剂为脱脂奶粉、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、甘露醇、谷氨酸钠、L-半胱氨酸、明胶中的一种或多种。
8.根据权利要求7所述的短乳杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
(1)取权利要求1或2中所述的短乳杆菌，厌氧培养，得到发酵液；
(2)取步骤(1)中发酵得到的所述发酵液，将其置于转速为8000-12000r/min下，离心10-60min，收集菌泥；
(3)向步骤(2)中得到的菌泥中加入所述保护剂，所述保护剂与所述菌泥的重量比为3:1，混合均匀，将其置于-40℃的温度下预冻3h，然后置于-15℃的温度下升华15h，再置于25℃的温度下升华2h，在真空下放置2h后，使所述菌泥的含水量小于5％，即得短乳杆菌冻干粉。
9.根据权利要求8所述的短乳杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤(1)具体包括如下步骤：取权利要求1或2中所述的短乳杆菌，按照0.5-3％的接种量接种至LYT发酵培养基中厌氧培养，在温度为37±3℃、转速为30-80rpm、发酵罐的罐压为0.03-0.08Mpa的条件下，发酵12-24h，在对数生长期得到一级发酵液；然后，取所述一级发酵液，按照5-10％的接种量接种至LYT发酵培养基中，在温度为37±3℃、转速为100-200rpm、发酵罐的罐压为0.03-0.08Mpa的条件下，厌氧培养15-28h，得到对数期生长的二级发酵液；再取所述二级发酵液，按照5-12％的接种量接种至LYT发酵培养基中，在温度为37±3℃、转速为100-200rpm、发酵罐的罐压为0.03-0.08Mpa的条件下，厌氧培养18-36h，得到对数期生长的短乳杆菌的三级发酵液。
10.根据权利要求9所述的短乳杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中，所述LYT发酵培养基的pH值为7.0，具体包括如下重量份的原料：
蛋白胨2.0重量份；酵母浸粉2.0重量份；葡萄糖2.0重量份；微量盐4.0重量份，L-半胱氨酸盐0.05重量份；
所述微量盐包括如下原料：氯化钙0.2g/L，硫酸镁0.48g/L，碳酸氢钠10g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，磷酸氢二钾1.0g/L，氯化钠2.0g/L。
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