CN112458002B - 一株降尿血酸乳酸菌菌株及其筛选方法和制备功能性酸奶的应用 - Google Patents
一株降尿血酸乳酸菌菌株及其筛选方法和制备功能性酸奶的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一株降尿血酸乳酸菌菌株及其筛选方法和应用，特点是该乳酸菌分类命名为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)PDD‑5株，于2020年8月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20573，其筛选方法包括以下步骤：1)挑选传统发酵食品泡菜为样品进行乳酸菌的初步筛选及分离纯化；2)获得过氧化氢酶活性呈阴性和革兰氏染色呈阳性的菌株，然后培养收集菌体，重悬于肌苷‑鸟苷溶液中并培养后，选取对肌苷或鸟苷降解率最高的乳酸菌即可，优点是具有抗氧化、抗炎、免疫调节、降血尿酸、可用于缓解治疗高尿酸血症等功能。
Description
技术领域
本发明涉及一株高效降解嘌呤核苷的乳酸菌菌株，尤其是涉及一种可降尿血酸的乳酸菌菌株及其筛选方法及应用。
背景技术
嘌呤是生物体内的一种重要碱基，是有机化合物。它由嘧啶环与咪唑环并合而成。嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸是组成细胞的主要成分，是DNA和RNA的基本组成单位，在细胞结构、代谢、能量和功能调节等方面起重要作用。人体内的嘌呤主要有腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤和黄嘌呤四种，而嘌呤在人体中代谢形成尿酸，当人体内尿酸过高时会引起痛风。痛风是因嘌呤代谢紊乱和血尿酸排泄障碍所致血尿酸增高的一组异质性疾病，是常见的炎症性关节炎，男性高发，其特征是尿酸盐结晶在关节或其他结缔组织中沉积，临床表现为高尿酸血症、急性痛风性关节炎、痛风性肾病、痛风石、关节畸形和功能障碍等。
随着人们生活水平的提高，饮食结构发生了明显变化，嘌呤的摄入量明显增加，高尿酸血症和痛风发病率明显增加，且有逐渐年轻化的趋势，痛风已成为严重威胁人类健康的主要疾病。尿酸盐结晶是痛风性关节炎的致病因子，血尿酸长期持续超过饱和点(>420μmol/L)，就容易形成尿酸盐结晶。因此，要控制痛风，就必须控制尿酸。痛风的发病机制是尿酸水平逐渐升高达到饱和后形成晶体，尿酸盐晶体沉积在周围关节中，最终导致不可逆的关节损伤和畸形。急性痛风性关节炎的初次发作往往可自行缓解，但因疾病本身特点，会再次或反复发作。血尿酸水平高于0.36mM的阈值称为高尿酸血症，随着痛风反复发作和持续的高尿酸血症状态，将累及机体多种器官，并出现多种合并症，对机体造成较大的危害。将血尿酸水平降至低于尿酸饱和阈值能够溶解现有的尿酸盐晶体并防止新的晶体形成。虽然痛风治疗已经被欧洲风湿病防治联合会和美国风湿病联合会认可，但痛风患者尿酸的综合管理仍然不理想。高嘌呤饮食是尿酸生成增多的外源性因素，而核苷酸基因突变是尿酸生成过多的内源性因素。人体中尿酸的来源主要有两部分，80％由细胞自身的新陈代谢产生，称为内源性尿酸；剩下的20％则来源于富含嘌呤的食物，称为外源性尿酸。对于内源性尿酸，除了用药之外我们很难人为进行干预，因此，控制食物来源的20％尿酸就显得尤为重要。食物来源的嘌呤很少能被人体利用，发挥生理作用，它们大部分都在肠道内被吸收分解成尿酸。有研究表明，肠道菌群与高尿酸血症的发病有一定关系：随着乳酸杆菌等有益菌群数量的减少，尿酸的处理能力也随之下降。这提示，口服乳酸菌治疗尿酸的代谢紊乱，或可作为治疗高尿酸血症和痛风的新方法。乳酸菌是人体肠道内的有益菌群，具有分解、产生营养物质的能力，它们自身的吸收和转化也能给人体带来更多的益生作用。
乳酸菌是一类能利用碳水化合物产生乳酸的非病原性、革兰阳性细菌的通称。研究表明，乳酸菌具有改善胃肠道功能、提高免疫能力、改善机体营养状况等良好机能，它们是人类肠道重要的生理菌群，对机体有多种其他正常生理菌群无法比拟的生理作用。作为人体肠道内的正常菌群一员，乳酸菌在高尿酸血症治疗方向上拥有药物治疗无可比拟的优点：①无药物不良反应②几乎不需要限制饮食，患者依从度高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种可以降尿血酸的乳酸菌及其筛选方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：
1、一株降尿血酸的乳酸菌，该乳酸菌分类命名为短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)PDD-5株，于2020年8月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20573。
2、上述降血尿酸的乳酸菌的筛选方法，包括以下步骤：
(1)乳酸菌的初步筛选及分离纯化
挑选传统发酵食品泡菜为样品稀释后，涂布于含有溴甲酚紫的MRS固体培养基平板，静置，于37-43℃培养36-48h，挑选出呈黄色的菌落，将筛选得到具有典型乳酸菌特征的单一菌落初步定为乳酸菌；将初步确定的菌落在MRS固体培养基平板上反复划线几次，从而进一步进行纯化，直至出现单一的形态一致的菌落，保藏菌种以备下次使用；(2)目标菌株的筛选
将步骤(1)获得的菌落按体积百分比1％接种量加入到液体MRS培养基，将能够在液体MRS培养基上生长出来的黄色菌落通过过氧化氢酶活性检测和革兰氏染色法，获得过氧化氢酶活性呈阴性和革兰氏染色呈阳性的菌株，将菌株在液体MRS培养基中于37℃培养48h，传代2次，取发酵液2mL于4℃，5000r/min，离心5min收集菌体，并用无菌生理盐水清洗菌体2次，离心收集菌体重悬于750μL肌苷-鸟苷溶液中并置于37℃下120rpm培养60min，取出立马沸水浴加热5min，离心收集上清液，检测肌苷、鸟苷含量，选取一株对肌苷或鸟苷降解率最高的乳酸菌，即为目标菌株，将该菌株分类命名为短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)PDD-5株，于2020年8月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20573。
所述筛选菌株通过耐酸、耐胆盐实验表明其对酸和胆盐有一定的耐受能力且疏水性较好，且对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌具有较好的抑制特性且可以治疗缓高尿酸血症。其中，菌株对肌苷和鸟苷降解率可达68.86％和95.75％，且该菌株可降低高尿酸血症大鼠血尿酸含量，含量低至43.59±8.657(μmol/L)，效果与阳性药物效果相近。其中，作为优选的实施方式，菌株的浓度为1011～1012CFU/g。
步骤(1)中所述的含有溴甲酚紫的MRS固体培养基的配制方法如下：将MRS肉汤52.24g，溴甲酚紫0.04g，琼脂粉10-20g，溶于1L蒸馏水中，于121℃灭菌20min即可。
步骤(2)中所述的肌苷-鸟苷溶液配制方法如下：将33.7mg肌苷和35.7mg鸟苷溶于100ml浓度为100mmol/L，pH7.0的K3PO4溶液中，照紫外并过0.45mm滤膜即可。
4、上述具有降尿血酸功能的乳酸菌在制备大肠杆菌或/和金黄色葡萄球菌抗菌剂方面的应用。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明首次公开了一株可高效降解嘌呤核苷及降血尿酸的乳酸菌菌株及其筛选方法，包括高效降解嘌呤核苷乳酸菌的分离筛选、有较好的耐酸耐胆盐及抑菌特性、有较好的疏水性。
该菌株对酸和胆盐有一定的耐受能力且疏水性较好，且对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌具有较好的抑制特性且可以治疗缓高尿酸血症。其中，菌株对肌苷和鸟苷降解率可达68.86％和95.75％，且该菌株具有明显降低高尿酸血症大鼠血尿酸含量的作用，可降低高尿酸血症大鼠血尿酸含量低至43.59±8.657(μmol/L)，效果与阳性药物效果相近。
上述一株高效降解嘌呤核苷及可降血尿酸的乳酸菌，该乳酸菌分类命名短乳杆菌(Lactobacillus brevis)PDD-5株，于2020年8月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20573，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
附图说明
图1为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)PDD-5菌株对肌苷和鸟苷的降解率。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
一、实验测定方法
1、目标菌株降解嘌呤核苷的测定
(1)肌苷、鸟苷标准曲线的绘制：
嘌呤核苷含量的测定方法采用高效液相色谱法，将肌苷和鸟苷标准品各称取0，0.01，0.02，0.03，0.04，0.05g定容配置成0，100，200，300，400，500μg/mL的梯度标准溶液经过0.45μm的微孔滤膜后选择适用的液相色谱条件进行测定，以标准品浓度x(单位μg/mL)为横坐标，高效液相色谱法出峰面积y为纵坐标，绘制标准曲线，计算线性回归方程如下：
表1
| 标准品 | 线性回归方程 | 相关系数 |
| 肌苷 | y＝21.83x+111 | <![CDATA[R<sup>1</sup>＝0.9971]]> |
| 鸟苷 | y＝28.529x+14.841 | <![CDATA[R<sup>2</sup>＝0.9997]]> |
；
(2)样品中嘌呤核苷含量的测定：
将筛选出的乳酸菌制备的培养液2mL于4℃，5000r/min，离心5min收集菌体，并用无菌生理盐水清洗菌体2次，离心收集菌体重悬于750μL肌苷-鸟苷混合液中，放入恒温混匀仪120rpm，37℃反应1h后，迅速将反应液置于沸水浴中5min，终止反应后10000r/min离心5min收集上清液，过0.45μm的无菌微孔滤膜后入高效液相色谱仪。以肌苷-鸟苷混合液做母液标准样品检测。
2、降尿血酸指标测定
(1)实验动物分组及灌胃
40只体重为180-200g的雄性SD大鼠随机分为6组，每组8只。正常组、高尿酸血症模型组、高尿酸血症模型组+低浓度菌株干预组(LD)、高尿酸血症模型组+中浓度菌株干预组(MD)、高尿酸血症模型组+高浓度菌株干预组(HD)、高尿酸血症模型组+别嘌呤醇组。适应性喂养一周后，选取边造模边灌胃的方式，除正常组正常饲养外，其余每组均采用氧嗪酸钾腹腔注射造模。从第8d开始，每天按300mg/kg体重腹腔注射氧嗪酸钾CMC-Na混悬液，同时辅以高嘌呤鼠粮，自由饮水，持续14d，氧嗪酸钾腹腔注射后2小时进行低中高浓度菌株组(LD、MD、HD)及药物组灌胃治疗。
(2)血尿酸(UA)含量测定采用紫外分光光度法研究尿酸和四氰乙烯之间的荷移反应。尿酸和四氰乙烯可以形成淡绿色的荷移配合物，其配合比为1:2。在测定波长395nm处，该配合物的表观摩尔吸光系数ε＝624×104L/(mol·cm)，方法线性范围为5.7×10-7～5.7×10-6mol/L。在10ml具塞比色管中，加入一定量1.14×10-8mol/L的尿酸溶液，再加入3ml的1.01×10-3mol/L四氰乙烯溶液，用水定容至刻度，摇匀，室温下放置10分钟后，用1cm的比色皿，以试剂空白为参比，在波长395nm处测定吸光度。
二、具体实施例
实施例1
一株高效降解嘌呤核苷及可降血尿酸的乳酸菌，该乳酸菌分类命名为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)PDD-5株，于2020年8月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20573，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
实施例2
上述实施例1高效降解嘌呤核苷及可降血尿酸乳酸菌的筛选方法，包括以下步骤：
(1)乳酸菌的初步筛选及分离纯化
挑选新鲜牛乳、中国咸菜、中国新疆奶疙瘩为样品稀释后，涂布于含有溴甲酚紫的MRS固体培养基平板，静置，于37-43℃培养36-48h，挑选出呈黄色的菌落，将筛选得到具有典型乳酸菌特征的单一菌落初步定为乳酸菌；将初步确定的菌落在MRS固体培养基平板上反复划线几次，从而进一步进行纯化的目的，直至出现单一的形态一致的菌落，保藏菌种以备下次使用。其中含有溴甲酚紫的MRS固体培养基的配制方法如下：将MRS肉汤52.24g，溴甲酚紫0.04g，琼脂粉10g～20g，溶于1L蒸馏水中，于121℃灭菌20min即可；成肌苷-鸟苷混合液配制方法如下：将33.7mg肌苷和35.7mg鸟苷溶于100ml浓度为100mmol/L，pH7.0的K3PO4溶液中，照紫外并过0.45mm滤膜即可；
(2)目标菌株的筛选
将步骤(1)保藏的菌种按体积百分比1％接种量加入到液体MRS培养基中，将能够在MRS培养基上生长出来的黄色菌落通过过氧化氢酶活性检测和革兰氏染色法及16srDNA和API50-CHL糖发酵实验，获得过氧化氢酶活性呈阴性和革兰氏染色呈阳性的菌株，将该菌株在液体MRS培养基于37℃培养48h后；取发酵液2mL于4℃，5000r/min，离心5min收集菌体，并用无菌生理盐水清洗菌体2次，离心收集菌体重悬于750μL肌苷-鸟苷溶液中，放入恒温混匀仪120rpm，37℃反应1h后，迅速将反应液置于沸水浴中5min，终止反应后10000r/min离心5min收集上清液，过0.45μm的无菌微孔滤膜后入高效液相色谱仪，按上述实验方法中公式计算菌体对肌苷、鸟苷的降解率，选取一株对肌苷或鸟苷降解率最高的菌株，将能够高效降解肌苷或鸟苷的菌株进行16srDNA和API50-CHL糖发酵实验，得到一株核苷降解率的乳酸菌，该乳酸菌分类命名为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)PDD-5株，于2020年8月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20573。
由图1短乳杆菌(Lactobacillus brevis)PDD-5菌株的降解率可知，其对肌苷和鸟苷降解率可达68.86％和95.75％。
实施例3
短乳杆菌(Lactobacillus brevis)PDD-5株在培养基中的生长曲线：将活化好的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)PDD-5菌株，以体积比1％的接种量接种到MRS培养基中37-43℃培养。测定不同生长时间的菌体OD600值。短乳杆菌(Lactobacillus brevis)PDD-5菌株在5-22h处于对数生长期，这时期生长速率常数R最大，菌体生长速度最快，乳酸大量生成(发酵液PH维持在4左右)。22h后，菌体生长进入稳定器，菌体死亡与生长达到动态平衡，生长速率常数R基本为零，此时菌体生长速度减慢，趋于稳定，菌株产酸能力在进入稳定期后受到了抑制。此外，在74h以内发酵液OD600值都能维持比较稳定的比较。
实施例4
短乳杆菌(Lactobacillus brevis)PDD-5菌株的抑菌特性：实验选择2种致病菌金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、做为指示菌株，观察短乳杆菌(Lactobacillus brevis)PDD-5菌株对2种致病菌的抑制能力。将实验室-80℃冻存的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、2种致病菌自细菌冻存管内接种到LB液体培养基中，37℃，120r/min振荡培养。以体积比1％的接种量每隔24h传代一次，共传代三次，使菌种活化。再按体积百分比1％的接种量接种后放置过夜，调节菌体浓度为2号麦氏比浊管浊度(6×108cfu/ml)，备用。配制MRS固体培养基，121℃灭菌15min，备用。将活化后的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)PDD-5菌悬液4000rpm离心5分钟，上层清液即为候选菌株培养液，备用。取用制作好的无菌培养皿，加入预先灭菌牛津杯，每个平皿放入4个，调整牛津杯位置使之分布均匀。取刚才制备的固体MRS培养基，加入750μL指示菌悬液，快速混合均匀后倒入放有牛津杯的平皿，彻底冷却凝固后，用无菌镊子取出牛津杯，即为含有指示菌的检测培养皿。取制备好的培养液120μL加入检测培养皿的其中3个小孔中，同样加入120μL的无菌生理盐水作对照，短乳杆菌(Lactobacillus brevis)PDD-5菌株做3个平行，37℃恒温培养10h后测量并记录各菌株抑菌圈直径。表2显示短乳杆菌(Lactobacillus brevis)PDD-5菌株对致病菌的抑制结果。可以看出，短乳杆菌(Lactobacillus brevis)PDD-5对这两种致病菌有较好的抑制作用，直径可达17mm以上，
表2
| 致病菌名称 | 抑菌圈直径(mm) |
| 金黄色葡萄球菌 | 17.83±1.40 |
| 大肠杆菌 | 17.65±1.98 |
。
实施例5
短乳杆菌(Lactobacillus brevis)PDD-5菌株耐酸耐胆盐能力实验：将活化好的菌株以体积百分比2％的接种量置于pH为1、2、3的培养基和MRS培养基中，37℃下处理1h、2h、3h后，进行平板活菌计数。短乳杆菌(Lactobacillus brevis)PDD-5菌株的耐酸能力较好，在pH3.0的条件下处理3小时该菌株能够保持106cfu/mL以上的活菌数；而通常微酸在3.0左右，由此说明短乳杆菌(Lactobacillus brevis)PDD-5菌株具备了抵抗多数条件下人体酸性环境的能力。将活化好的菌株以体积百分比2％的接种量置于牛胆盐浓度分别为0.03％、0.05％、0.1％、0.2％、0.3％的MRS培养基中，37℃下处理1h、2h、3h和4h后，进行平板活菌计数。人体小肠中胆汁的浓度范围在0.03％～0.3％。能在正常生理胆盐浓度中生长和进行代谢的乳酸菌被认为是能在肠道转运过程中存活。本菌株能在胆盐浓度≤0.3％时，短乳杆菌(Lactobacillus brevis)PDD-5菌株的活菌数保持在104～105cfu/mL，说明短乳杆菌(Lactobacillus brevis)PDD-5可以耐受人体正常胆汁浓度，具备在肠道中生存所需的胆盐耐受能力。
实施例6
利用上述实例1和实例2中筛选出的乳酸菌检验其降血尿酸效果的测试，具体实验步骤如下：
(1)动物模型的建立及分组
40只体重为180-200g的雄性SD大鼠经过7d适应性喂养后，随机分为6组，每组8只。分组处理如下：正常组、高尿酸血症模型组、高尿酸血症模型组+低浓度菌株干预组(LD)、高尿酸血症模型组+中浓度菌株干预组(MD)、高尿酸血症模型组+高浓度菌株干预组(HD)、高尿酸血症模型组+别嘌呤醇组。连续14d按300mg/kg体重腹腔注射氧嗪酸钾CMC-Na混悬液，同时辅以高嘌呤鼠粮，自由饮水，持续14d。氧嗪酸钾腹腔注射后2小时进行药物灌胃。菌株剂量组于第8d开始，建模两小时后，每只大鼠分别灌胃1.0ml低浓度菌悬液(LD)、1.0ml中浓度菌悬液(MD)、1.0ml高浓度菌悬液(HD)浓度分别为1.0×108、1.0×109、1.0×1010CFU/mL，持续14d。对照组和模型组灌胃等剂量灭菌生理盐水。实验结束后，取各组大鼠取血，3000r/min离心15min，收集血清。
(2)血尿酸含量的测定
短乳杆菌(Lactobacillus brevis)PDD-5菌株对高尿酸血症大鼠血尿酸的影响，结果如下表3所示，表3
如表3所述，本发明的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)PDD-5菌株在14天测得大鼠体内的血尿酸含量与喂养7天的含量有显著性差异，短乳杆菌(Lactobacillus brevis)PDD-5菌的中低剂量组与模型组相比都显著降低了高尿酸血症大鼠体内的血尿酸含量(P＜0.05)，PDD-5菌的高剂量组的血尿酸含量明显低于模型组(P＜0.0001)，说明本发明的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)PDD-5菌株具有明显降低高尿酸血症大鼠血尿酸含量的作用。且本发明的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)PDD-5菌株效果与阳性药物效果相近。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一株具有降尿血酸功能的乳酸菌，其特征在于：该乳酸菌分类命名为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)PDD-5株，于2020年8月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20573。
2.一种权利要求1所述的具有降尿血酸功能的乳酸菌在制备大肠杆菌或/和金黄色葡萄球菌抗菌剂方面的应用。
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