CN112831448B - 用于筛选肠道降解尿酸菌株的高尿酸培养基及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物分离技术领域，具体涉及用于筛选肠道降解尿酸菌株的高尿酸培养基及其制备方法。该方法包括如下步骤：S1、将尿酸与水混合，并加入丙三醇，调节pH，混匀；S2、向混合溶液中依次加入丙三醇和水，调节pH，混匀直至尿酸完全溶解；本步骤丙三醇和水的体积均为S1中丙三醇和水体积的1/5；S3、对S2所得溶液进行定容及最终pH值调节；S4、将BHI干粉或MRS干粉与尿酸溶液混合，高压蒸汽灭菌，得所述培养基。该培养基可以在适宜肠道菌群培养的pH条件下提供高浓度尿酸，除甘油和磷酸二氢钾外在不引入其他外源性物质条件下可做到稳定、简易且适合常规实验室配置等特点，可用于高效降解尿酸肠道菌株的筛选，结果准确、可信度好。
Description
技术领域
本发明属于生物分离技术领域，具体涉及用于筛选肠道降解尿酸菌株的高尿酸培养基及其制备方法。
背景技术
尿酸(uric acid,UA)是嘌呤代谢的最终产物，其化学名为2,6,8三羟基嘌呤。正常人血尿酸水平男性不超过419umol/L，女性不超过359umol/L。尿酸代谢紊乱可直接导致高尿酸血症、痛风以及肾功能衰竭等疾病发生的风险，而且还与糖脂代谢、肥胖和胰岛素抵抗等疾病在遗传和病理机制上有密切的联系。
尿酸的代谢途径主要通过肾脏和肠道2个途径。通过肾脏途径达到降尿酸目的的方法主要为抑制关键酶如：黄嘌呤氧化酶和腺苷脱氨酶等的活性；促进尿酸的排泄及抑制肾脏对尿酸的重吸收；促进尿酸及其前体物质分解等。通过肠道途径达到降尿酸目的的方法主要为调节肠道菌群和工程菌的驯化等方式筛选出能够抑制黄嘌呤氧化酶活性的细菌；能够分解尿酸前体物质的细菌；以及能够直接分解尿酸的工程菌。目前通过肾脏途径降解尿酸的研究已经较为成熟，但通过肠道途径降解尿酸的研究较少。通过肠道途径体外驯化具有降解尿酸功能的工程菌成为目前行之有效的办法之一。体外驯化正常肠道菌使之具备尿酸分解功能需要提供高浓度尿酸环境，目前已报道的相关尿酸溶液浓度最高在30mmolL氨丁三醇(Tris)中为23.20mmol/L，在14.80mg/L蕲艾油中溶解度为0.07mmol/L。经测量30mmol/L Tris其pH值为9.5，而蕲艾油作为强刺激性具有杀菌活性对油性物质，二者均不适宜肠道微生物的生长。另外，尿酸还可溶解于强酸或者强碱溶液中，人体肠道pH在4.8-8.5之间，而肠道微生物最适宜生长环境要求pH值在6.5-7.5之间。因此，适合肠道微生物培养的高浓度尿酸溶液的获得是筛选和驯化高效降解尿酸菌株的关键。
发明内容
本发明的目的在于提供用于筛选肠道降解尿酸菌株的高尿酸培养基及其制备方法，该培养基适用于筛选和驯化高效降解尿酸肠道微生物，可以提供稳定、操作简易且适合常规实验室配置等特点，可用于筛选具有高效降解尿酸功能的肠道微生物培养，可信度大，重复率好。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
用于筛选肠道降解尿酸菌株的高尿酸培养基的制备方法，包括如下步骤：
S1、将尿酸与水混合，并加入丙三醇，调节混合溶液pH值至7.2-7.5，然后混匀；
所述尿酸、水和丙三醇的质量体积比为：1.65-1.7g：500mL：50mL；
S2、向S1的混合溶液中依次加入丙三醇和水，调节pH值至7.2-7.5，混匀直至尿酸完全溶解；本步骤加入的丙三醇和水体积均为S1中丙三醇和水体积的1/5；
S3、对S2所得溶液进行定容并调节pH值至7.2-7.5，得尿酸溶液；
S4、将BHI干粉或MRS干粉与10mmol的S3所得尿酸溶液混合，高压蒸汽灭菌，得所述培养基。
优选的，S1、S2和S3中，均采用1mol/L的磷酸二氢钾调节pH。
优选的，S2中，尿酸完全溶解以溶液中不再有有形物质存在，且静止30min不再有晶体析出为标准。
优选的，S4中，BHI干粉与尿酸溶液的质量体积比为2.8-3.9g：20-80mL，加水补齐至100mL。
优选的，S4中，MRS干粉与尿酸溶液的质量体积比为5.2-5.4g：20-80mL，加水补齐至100mL。
优选的，S4中，高压蒸汽灭菌具体条件为：121.3℃，103.4kPa，30min。
本发明还提供了所述制备方法制备的用于筛选肠道降解尿酸菌株的高尿酸培养基。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)使用传统方法溶解高浓度尿酸所需pH值不适高效降解尿酸肠道微生物的筛选和驯化，本发明所述方法可使得高浓度尿酸溶液pH值适宜肠道微生物生长。
(2)使用传统方法溶解高浓度尿酸在常温下容易出现晶体析出溶解度下降等现象，本发明所述方法常温及高温高压条件下均较为稳定。
(3)使用传统方法溶解高浓度尿酸溶液时添加强酸、强碱等物质存在一定的安全隐患，本发明所述方法只需添加甘油和1mol/L磷酸氢钾即可完成配制，相对较为安全。
(4)本发明所述方法不需特殊实验条件，操作简便在常规实验室即可完成配制。
附图说明
图1为根据尿酸测定试剂盒提供的标准品所测标准曲线。
图2为不同处理方法对尿酸溶液理论浓度与实际浓度的影响。
图3为高效降解尿酸菌株在高浓度尿酸BHI、MRS培养基中降解尿酸作用，a为高效降解尿酸菌株在高浓度尿酸BHI培养基中尿酸降解效果；b为高效降解尿酸菌株在高浓度尿酸MRS培养基中尿酸降解效果；*为P<0.05，**为P<0.01。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
根据尿酸测定试剂盒提供的标准品所测标准曲线(如图1所示)，由标准曲线可得吸光度(x)与尿酸浓度(Y)相关方程为Y＝0.000174x+0.045589，由软件计算R2＝0.997。符合尿酸测定标准规定的最低标准(R2＝0.950)。高压后尿酸溶液尿酸浓度可达8.04±0.34mmol/L，未高压尿酸溶液尿酸浓度可达7.77±0.88mmol/L，滤过尿酸溶液尿酸浓度可达6.29±0.30mmol/L。
实施例1
用于筛选肠道降解尿酸菌株的高尿酸培养基
1、制备方法(1)精确称量尿酸1.6811g加入500mL超纯水中，并加入50mL丙三醇，使用1mol/L磷酸二氢钾调节pH值为7.2，将上述溶液置于超声震荡仪中100Hz震荡5min。
(2)向步骤(1)得到的溶液中加入10mL丙三醇和100mL超纯水，使用1mol/L磷酸二氢钾调节pH值，并超声震荡6min。
(3)重复步骤(2)4次直至尿酸完全溶解。尿酸完全溶解以溶液中不再有有形物质存在，且静止30min不再有晶体析出为标准。
(4)对步骤(3)所得溶液进行定容及最终pH值(7.2)调节。
(5)分别称取3.85g BHI干粉(北京华越洋生物)置于5个100mL容量瓶中，并向容量瓶中分别加入0mL、20mL、40mL、60mL、80mL已配制好的10mmol尿酸溶液，剩余液体用超纯水补齐。所得BHI尿酸培养液中尿酸浓度分别为0mmol/L、2mmol/L、4mmolL、6mmol/L、8mmol/L。
(6)各取上述液体50mL置于高压蒸汽灭菌锅中121.3℃103.4kPa高压30min，得到所述培养基。为对照不同灭菌方法对本发明所实施高浓度尿酸溶液经未高压、高压及0.22μm滤膜过滤处理后尿酸浓度的理论浓度与实际浓度测量，结果如图2所示，由线性关系可得：高压后尿酸溶液浓度高于未高压尿酸溶液，未高压后尿酸溶液浓度高于过滤处理后尿酸溶液，因此，确定采用高压灭菌。
2、降解实验
(1)将具备尿酸降解功能的细菌(浓度为1*107CFU的大肠杆菌，ATCC25922)100μL接种于5mL含有不同尿酸浓度的BHI培养基中，37℃，220rpm/min震荡培养48h，作为实验组，并设置未接种细菌相同条件的BHI培养基进行对照，作为对照组(每个浓度梯度设置3个平行样)。
(2)对(1)中培养基进行12 000g离心1min取上清稀释100倍后用尿酸试剂盒测定尿酸浓度，将所得数据经SPSS 23.0进行配对t检验。
结果：如图3a所示，根据计算可得高浓度尿酸BHI培养基48h培养后尿酸终浓度分别为：0.04±0.01mmol/L(0mmol/L)、1.47±0.18mmol/L(2mmol/L)、2.74±0.21mmol/L(4mmol/L)、3.46±0.19mmol/L(6mmol/L)、4.18±0.05mmol/L(8mmol/L)。高效降解尿酸菌株在高浓度尿酸BHI中培养48h培养后尿酸终浓度分别为：0.04±0.02mmol/L(0mmol/L)、1.11±0.43mmol/L(2mmol/L)、1.37±0.28mmol/L(4mmol/L)、1.83±0.28mmol/L(6mmol/L)、1.58±0.41mmol/L(8mmol/L)，降解效率为分别为：24.57％(2mmol/L)、50.01％(4mmol/L)、47.03％(6mmol/L)、62.10％(8mmol/L)。
实施例2
用于筛选肠道降解尿酸菌株的高尿酸培养基的制备
1、制备方法(1)精确称量尿酸1.6811g加入500mL超纯水中，并加入50mL丙三醇，使用1mol/L磷酸二氢钾调节pH值使之保持在7.2，将上述溶液置于超声震荡仪中100Hz震荡5min；
(2)向步骤(1)得到的溶液中加入10mL丙三醇和100mL超纯水，使用1mol/L磷酸二氢钾调节pH值，并超声震荡10min；
(3)重复步骤(2)4次直至尿酸完全溶解；尿酸完全溶解以溶液中不再有有形物质存在，且静止30min不再有晶体析出为标准。
(4)对步骤(3)所得溶液进行定容及最终pH值(7.2)调节。
(5)分别称取5.30g MRS琼脂干粉(北京蓝博斯特生物技术有限公司)置于5个100mL容量瓶中，并向容量瓶中分别加入0mL、20mL、40mL、60mL、80mL已配制好的10mmol尿酸溶液，剩余液体用超纯水补齐。所得MRS尿酸培养液中尿酸浓度分别为0mmol/L、2mmol/L、4mmolL、6mmol/L、8mmol/L。
(6)各取上述液体50mL置于高压蒸汽灭菌锅中121.3℃103.4kPa高压30min，得到所述培养基。
2、降解实验
(1)将具备尿酸降解功能的细菌(浓度为1*107CFU的大肠杆菌，ATCC25922)100μL接种于5mL含有不同尿酸浓度的MRS培养基中，37℃，220rpm/min震荡培养48h，作为实验组，并设置未接种细菌相同条件的MRS培养基进行对照，作为对照组(每个浓度梯度设置3个平行样)。
(2)对(1)中培养基进行12000g离心1min取上清稀释100倍后用尿酸试剂盒测定尿酸浓度，将所得数据经SPSS 23.0进行配对t检验，结果如图3b所示。
结果：如图3b所示，根据计算可得高浓度尿酸MRS培养基48h培养后尿酸终浓度分别为：0.05±0.03mmol/L(0mmol/L)、1.47±0.12mmol/L(2mmol/L)、3.05±0.20mmol/L(4mmol/L)、4.24±0.37mmol/L(6mmol/L)、5.49±0.30mmol/L(8mmol/L)。高效降解尿酸菌株在高浓度尿酸MRS中培养48h培养后尿酸终浓度分别为：0.04±0.02mmol/L(0mmol/L)、0.76±0.13mmol/L(2mmol/L)、1.65±0.31mmol/L(4mmol/L)、1.96±0.56mmol/L(6mmol/L)、1.34±0.46mmol/L(8mmol/L)，降解效率为分别为：48.79％(2mmol/L)、45.81％(4mmol/L)、53.72％(6mmol/L)、75.59％(8mmol/L)。
需要说明的是，本发明权利要求书中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (7)
1.用于筛选肠道降解尿酸菌株的高尿酸培养基的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将尿酸与水混合，并加入丙三醇，调节混合溶液pH值至7.2-7.5，混匀；
所述尿酸、水和丙三醇的质量体积比为：1.65-1.7g：500mL：50mL；
S2、向S1的混合溶液中依次加入丙三醇和水，调节pH值至7.2-7.5，混匀直至尿酸完全溶解；本步骤加入的丙三醇和水体积均为S1中丙三醇和水体积的1/5；
S3、对S2所得溶液进行定容并调节pH值至7.2-7.5，得尿酸溶液；
S4、将BHI干粉或MRS干粉与10mmol的S3所得尿酸溶液混合，高压蒸汽灭菌，得所述培养基。
2.根据权利要求1所述的用于筛选肠道降解尿酸菌株的高尿酸培养基的制备方法，其特征在于，S1、S2和S3中，均采用1mol/L的磷酸二氢钾调节pH。
3.根据权利要求1所述的用于筛选肠道降解尿酸菌株的高尿酸培养基的制备方法，其特征在于，S2中，尿酸完全溶解以溶液中不再有有形物质存在，且静止30min不再有晶体析出为标准。
4.根据权利要求1所述的用于筛选肠道降解尿酸菌株的高尿酸培养基的制备方法，其特征在于，S4中，BHI干粉与尿酸溶液的质量体积比为2.8-3.9g：20-80mL，加水补齐至100mL。
5.根据权利要求1所述的用于筛选肠道降解尿酸菌株的高尿酸培养基的制备方法，其特征在于，S4中，MRS干粉与尿酸溶液的质量体积比为5.2-5.4g：20-80mL，加水补齐至100mL。
6.根据权利要求1所述的所述的用于筛选肠道降解尿酸菌株的高尿酸培养基的制备方法，S4中，高压蒸汽灭菌具体条件为：121.3℃，103.4kPa，30min。
7.如权利要求1所述制备方法制备的用于筛选肠道降解尿酸菌株的高尿酸培养基。
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