CN105053567A - 一种利用啤酒废液生产酵母发酵态铜饲料添加剂的方法 - Google Patents
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Abstract
一种利用啤酒废液生产酵母发酵态铜饲料添加剂的方法，其步骤包括培养基制备以及微生物培养、制备基础液体培养基与铜梯度培养基、微生物梯度培养、制备种子培养基、制备发酵种子、制备发酵液、微生物发酵、制作酵母发酵态铜饲料添加剂与包装。本发明提供了一种利用啤酒生产过程中糖化废水和发酵废水生产酵母发酵态铜饲料添加剂的处理方法，方法简单，容易操作，效果理想，既提高了资源利用效率，降低了生产成本，又可以对啤酒生产中的废水进行生物处理，减少了环境污染，并且，所制备的酵母发酵态铜饲料添加剂具有较高的生物有效性。
Description
技术领域
本发明属于饲料添加剂及生物技术领域，尤其是一种利用啤酒废液生产酵母发酵态铜饲料添加剂的方法。
背景技术
铜是动物体必需的微量矿物元素之一，其在动物体内的含量约2~3mg/kg。铜主要作为金属酶组成部分直接参与体内代谢。此外，铜还参与铜的吸收以及骨骼的形成与发育。缺铜会引起动物骨骼发育受阻、贫血、皮毛发育不良及神经障碍等。动物缺铜可导致采食量下降、生长减慢、饲料利用率降低、骨骼异常、共济失调及繁殖功能异常等。日粮添加一定量铜是满足动物体铜需要的重要措施。目前，铜的主要添加形式为含结晶水的硫酸铜，该铜化合物吸收率低，毒性大，环境污染严重。研发毒性低、利用率高的有机态铜制剂对改善铜在动物饲料中的添加利用具有重要意义。
我国是啤酒生产消费大国，在其生产过程中会产生20-30倍的废水，其中糖化废水和发酵废水中有机养分含量丰富。研究表明，糖化和发酵后排放的废水COD浓度在2000~4000mg/L，并且以可溶态的糖类、氨基酸、醇类、维生素等为主。因此，通过对其营养成分调控后，能够作为微生物的营养基质来生产一系列微生物发酵类产品。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用啤酒废液生产酵母发酵态铜饲料添加剂的方法，将啤酒生产过程中的废液（糖化废液和发酵废液）经过适当理化性质调控后作为发酵液，以酵母菌作为发酵菌种，对无机铜盐进行发酵处理，研制酵母发酵态的铜饲料添加剂，从而达到提高铜的生物利用率、降低添加量、减少环境污染的目的。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种利用啤酒废液生产酵母发酵态铜饲料添加剂的方法，所用的发酵菌种为啤酒酵母和产朊假丝酵母，所用的铜为可溶解在稀酸溶液中的无机铜化合物，具体制备步骤如下：
（1）培养基制备以及微生物培养
取葡萄糖20g、蛋白胨20g、酵母浸膏10g、琼脂20g，用蒸馏水溶解、定容至1000mL，用高压锅在121℃灭菌20min-30min，调pH至5.0~5.5，制得培养基，然后将啤酒酵母和产朊假丝酵母从冰箱取出复苏，培养于该培养基上24h，以获得复活的啤酒酵母和产朊假丝酵母；
（2）基础液体培养基与铜梯度培养基制备
基础液体培养基的制法为：依次向1000ml蒸馏水中加入葡萄糖20g、蛋白胨20g以及酵母浸膏10g，并搅拌混匀，调整pH至5.0~5.2，备用；
铜梯度培养基的制法为：在上述基础液体培养基中加入可溶解在稀酸溶液中的无机铜化合物，得到铜含量分别为50mg/L、100mg/L、150mg/L、300mg/L、500mg/L、800mg/L、1000mg/L的培养基，并与铜含量为0mg/L的基础液体培养基构成铜梯度培养基，备用；
（3）微生物梯度培养
将步骤（1）处理所获得的啤酒酵母和产朊假丝酵母分别依次培养于步骤（2）所制得铜梯度培养基中，培养时间为24h，培养温度为30.5℃；
（4）种子培养基的制备
获取啤酒生产过程中新鲜的糖化废液，在4000r/min转速下离心5~10min，然后按照重量比添加3.5%的蔗糖、0.3%的尿素、0.25%的食盐、0.02%的硫化钠，混匀后121℃灭菌15~20min，并调pH至5.0~5.5，即制成种子培养基，并将其平均分做两份，备用；
（5）发酵种子的制备
将经过步骤（3）处理的啤酒酵母和产朊假丝酵母按照10%的接种比例分别接种于步骤（4）所制备的两份种子培养基中，一份种子培养基接种一种酵母菌，将接种后的培养基放置于30.5℃的恒温培养箱内培养24h，即获得啤酒酵母发酵种子和产朊假丝酵母发酵种子；
（6）发酵液的制备
发酵液是利用啤酒生产过程中的糖化废液或发酵废液制成的，具体制备方法如下：
a、利用糖化废液制作发酵液：取啤酒生产过程中新鲜的糖化废液，在3500~4000r/min转速下离心5~10min，然后按照重量比依次加入1.0%的蔗糖、20%的玉米面、0.3%的尿素、0.25%的食盐以及0.02%的硫化钠，并于121℃灭菌15~20min，调整pH至5.0~5.5，即可制成发酵液；
b、利用发酵废液制作发酵液：取啤酒生产过程中新鲜的发酵废液，在3500~4000r/min转速下离心5~10min，再在60~65℃水浴锅内水浴加热30~40min，加热期间不断用灭菌的玻璃棒搅拌，使发酵废液中残留的乙醇挥发，同时达到灭菌效果，然后按照重量比，向灭菌后的发酵废液中加入2.0%的蔗糖、20%的玉米面、0.5%的尿素、0.25%的食盐以及0.02%的硫化钠，并调整pH至5.0~5.5，即可制成发酵液；
（7）微生物发酵
将待发酵的无机铜化合物按照重量取其中的20%混合在步骤（6）所制得发酵液中，置于发酵容器内，并按照10%的接种比例向发酵容器内的发酵液中接种步骤（5）所制得的啤酒酵母发酵种子和产朊假丝酵母发酵种子，然后调节温度至30.5℃进行发酵，2h后，向发酵容器内再次加入20%的待发酵的无机铜化合物，并搅拌均匀，再继续发酵至6h后，再次加入20%的待发酵的无机铜化合物，搅拌均匀，使发酵液中铜含量达到1200mg/L，继续发酵至12h后，加入剩余的40%的待发酵的无机铜化合物，搅拌均匀，继续发酵24h后，完成发酵过程；
（8）酵母发酵态铜饲料添加剂的制作
将步骤（7）所得的发酵产物进行过滤，收取固体物，所得滤液在3500~4000r/min条件下离心10min，获得固体沉淀物，然后将过滤所得的固体物和离心所得的固体沉淀物混合均匀，置于65℃电热恒温干燥箱内进行干燥处理，干燥后用粉碎机将其粉碎并过60目筛，从而获得酵母发酵态铜饲料添加剂；
（9）包装
以1000g为单位，将步骤（8）所获得的酵母发酵态铜饲料添加剂用复合薄膜进行真空包装，真空度为0.085~0.095Mpa。
本发明的有益效果是：
第一，本发明提供了一种利用啤酒生产过程中糖化废水和发酵废水生产酵母发酵态铜饲料添加剂的处理方法，方法简单，容易操作，效果理想，既提高了资源利用效率，降低了生产成本，又可以对啤酒生产中的废水进行生物处理，减少了环境污染；
第二，本发明提供的酵母发酵态铜的生物有效性高，采用Caco-2细胞模型分析表明，其生物有效性是五水硫酸铜的8.03倍；
第三，本发明采用啤酒酵母与产朊假丝酵母联合发酵铜的方法，并提供了一种少量多次加入无机铜盐的发酵方法，而非一次性加入待发酵的铜盐，因而避免了大量无机铜盐对微生物的毒性，提高了发酵效率。
附图说明
图1是试验例中Caco-2细胞单层对铜的转运量对比。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步的说明。
实施例1：一种利用啤酒废液生产酵母发酵态铜饲料添加剂的方法，酵母菌选择市售的啤酒酵母和产朊假丝酵母，铜源选择五水硫酸铜，具体制备步骤如下：
（1）培养基制备以及微生物培养
取葡萄糖20g、蛋白胨20g、酵母浸膏10g、琼脂20g，用蒸馏水溶解、定容至1000mL，用高压锅在121℃灭菌20min，调pH至5.0，制得培养基，然后将啤酒酵母和产朊假丝酵母从冰箱取出复苏，培养于该培养基上24h，以获得复活的啤酒酵母和产朊假丝酵母；
（2）基础液体培养基与铜梯度培养基制备
基础液体培养基的制法为：依次向1000ml蒸馏水中加入葡萄糖20g、蛋白胨20g以及酵母浸膏10g，并搅拌混匀，调整pH至5.0，备用；
铜梯度培养基的制法为：在上述基础液体培养基中加入五水硫酸铜，得到铜含量分别为50mg/L、100mg/L、150mg/L、300mg/L、500mg/L、800mg/L、1000mg/L的培养基，并与铜含量为0mg/L的基础液体培养基构成铜梯度培养基，备用；
（3）微生物梯度培养
将步骤（1）处理所获得的啤酒酵母和产朊假丝酵母分别依次培养于步骤（2）所制得铜梯度培养基中，培养时间为24h，培养温度为30.5℃，从而使啤酒酵母和产朊假丝酵母对铜有较强的适应能力；
（4）种子培养基的制备
获取啤酒生产过程中新鲜的糖化废液，在4000r/min转速下离心5min，经过测定其COD浓度在2800mg/L，然后按照重量比添加3.5%的蔗糖、0.3%的尿素、0.25%的食盐、0.02%的硫化钠，混匀后121℃灭菌15min，并调pH至5.0，即制成种子培养基，并将其平均分做两份，备用；
（5）发酵种子的制备
将经过步骤（3）处理的啤酒酵母和产朊假丝酵母按照10%的接种比例分别接种于步骤（4）所制备的两份种子培养基中，将接种后的培养基放置于30.5℃的恒温培养箱内培养24h，即获得啤酒酵母发酵种子和产朊假丝酵母发酵种子；
（6）发酵液的制备
发酵液是利用啤酒生产过程中的糖化废液制成的，具体制备方法如下：
取啤酒生产过程中新鲜的糖化废液，在3500r/min转速下离心5min，然后按照重量比依次加入1.0%的蔗糖、20%的玉米面、0.3%的尿素、0.25%的食盐以及0.02%的硫化钠，并于121℃灭菌15min，调整pH至5.0，即可制成发酵液；
（7）微生物发酵
取待发酵的五水硫酸铜重量的20%混合在步骤（6）所制得发酵液中，置于发酵容器内，并按照10%的接种比例向发酵容器内的发酵液中接种步骤（5）所制得的啤酒酵母发酵种子和产朊假丝酵母发酵种子，然后调节温度至30.5℃进行发酵，2h后，向发酵容器内再次加入20%的待发酵的五水硫酸铜，并搅拌均匀，再继续发酵至6h后，再次加入20%的待发酵的五水硫酸铜，搅拌均匀，继续发酵至12h后，加入剩余的40%的待发酵的五水硫酸铜，搅拌均匀，使发酵液中铜含量达到1200mg/L，继续发酵24h，即合计发酵时间36h后，完成发酵过程；
（8）酵母发酵态铜饲料添加剂的制作
将步骤（7）所得的发酵产物使用双层纱布进行过滤，收取纱布上的固体物，所得滤液在3500r/min条件下离心10min，获得固体沉淀物，然后将过滤所得的固体物和离心所得的固体沉淀物混合均匀，置于65℃电热恒温干燥箱内进行干燥处理，至物料水分损失至10%左右即为干燥，干燥后用粉碎机将其粉碎并过60目筛，从而获得酵母发酵态铜饲料添加剂；
（9）包装
以1000g为单位，将步骤（8）所获得的酵母发酵态铜饲料添加剂用复合薄膜进行真空包装，真空度为0.085Mpa。
在酵母发酵态铜饲料添加剂制备好之后，采用原子吸收光谱法对添加剂中铜含量分析，发现铜含量为7.58g/kg。
实施例2：一种利用啤酒废液生产酵母发酵态铜饲料添加剂的方法，酵母菌选择市售的啤酒酵母和产朊假丝酵母，铜源选择五水硫酸铜，具体制备步骤如下：
（1）培养基制备以及微生物培养
取葡萄糖20g、蛋白胨20g、酵母浸膏10g、琼脂20g，用蒸馏水溶解、定容至1000mL，用高压锅在121℃灭菌30min，调pH至5.5，制得培养基，然后将所购买的啤酒酵母和产朊假丝酵母从冰箱取出复苏，培养于该培养基上24h，以获得复活的啤酒酵母和产朊假丝酵母；
（2）基础液体培养基与铜梯度培养基制备
基础液体培养基的制法为：依次向1000ml蒸馏水中加入葡萄糖20g、蛋白胨20g以及酵母浸膏10g，并搅拌混匀，调整pH至5.2，备用；
铜梯度培养基的制法为：在上述基础液体培养基中加入五水硫酸铜，得到铜含量分别为50mg/L、100mg/L、150mg/L、300mg/L、500mg/L、800mg/L、1000mg/L的培养基，并与铜含量为0mg/L的基础液体培养基构成铜梯度培养基，备用；
（3）微生物梯度培养
将步骤（1）处理所获得的啤酒酵母和产朊假丝酵母分别依次培养于步骤（2）所制得铜梯度培养基中，培养时间为24h，培养温度为30.5℃，从而使啤酒酵母和产朊假丝酵母对铜有较强的适应能力；
（4）种子培养基的制备
获取啤酒生产过程中新鲜的糖化废液，在4000r/min转速下离心10min，经过测定其COD浓度在2800mg/L，然后按照重量比添加3.5%的蔗糖、0.3%的尿素、0.25%的食盐、0.02%的硫化钠，混匀后121℃灭菌20min，并调pH至5.5，即制成种子培养基，并将其平均分做两份，备用；
（5）发酵种子的制备
将经过步骤（3）处理的啤酒酵母和产朊假丝酵母按照10%的接种比例分别接种于步骤（4）所制备的两份种子培养基中，将接种后的培养基放置于30.5℃的恒温培养箱内培养24h，即获得啤酒酵母发酵种子和产朊假丝酵母发酵种子；
（6）发酵液的制备
发酵液是利用啤酒生产过程中的发酵废液制成的，具体制备方法如下：
取啤酒生产过程中新鲜的发酵废液，在4000r/min转速下离心10min，再在65℃水浴锅内水浴加热40min，加热期间不断用灭菌的玻璃棒搅拌，使发酵废液中残留的乙醇挥发，同时达到灭菌效果，然后按照重量比，向灭菌后的发酵废液中加入2.0%的蔗糖、20%的玉米面、0.5%的尿素、0.25%的食盐以及0.02%的硫化钠，并调整pH至5.5，即可制成发酵液；
（7）微生物发酵
取五水硫酸铜重量的20%混合在步骤（6）所制得发酵液中，置于发酵容器内，并按照10%的接种比例向发酵容器内的发酵液中接种步骤（5）所制得的啤酒酵母发酵种子和产朊假丝酵母发酵种子，然后调节温度至30.5℃进行发酵，2h后，向发酵容器内再次加入20%的五水硫酸铜，并搅拌均匀，再继续发酵至6h后，再次加入20%的五水硫酸铜，搅拌均匀，继续发酵至12h后，加入剩余的40%的五水硫酸铜，搅拌均匀，使发酵液中铜含量达到1200mg/L，继续发酵24h，即一共合计发酵36h后，完成发酵过程；
（8）酵母发酵态铜饲料添加剂的制作
将步骤（7）所得的发酵产物用双层纱布进行过滤，收取纱布上的固体物，所得滤液在4000r/min条件下离心10min，获得固体沉淀物，然后将过滤所得的固体物和离心所得的固体沉淀物混合均匀，置于65℃电热恒温干燥箱内进行干燥处理，至物料水分损失至10%左右即为干燥，干燥后用粉碎机将其粉碎并过60目筛，从而获得酵母发酵态铜饲料添加剂；
（9）包装
以1000g为单位，将步骤（8）所获得的酵母发酵态铜饲料添加剂用复合薄膜进行真空包装，真空度为0.095Mpa。
在酵母发酵态铜饲料添加剂制备好之后，采用原子吸收光谱法对添加剂中铜含量分析，发现铜含量为7.58g/kg。
实施例3：一种利用啤酒废液生产酵母发酵态铜饲料添加剂的方法，酵母菌选择市售的啤酒酵母和产朊假丝酵母，铜源选择五水硫酸铜，具体制备步骤如下：
（1）培养基制备以及微生物培养
取葡萄糖20g、蛋白胨20g、酵母浸膏10g、琼脂20g，用蒸馏水溶解、定容至1000mL，用高压锅在121℃灭菌25min，调pH至5.3，制得培养基，然后将所购买的啤酒酵母和产朊假丝酵母从冰箱取出复苏，培养于该培养基上24h，以获得复活的啤酒酵母和产朊假丝酵母；
（2）基础液体培养基与铜梯度培养基制备
基础液体培养基的制法为：依次向1000ml蒸馏水中加入葡萄糖20g、蛋白胨20g以及酵母浸膏10g，并搅拌混匀，调整pH至5.0，备用；
铜梯度培养基的制法为：在上述基础液体培养基中加入五水硫酸铜，得到铜含量分别为50mg/L、100mg/L、150mg/L、300mg/L、500mg/L、800mg/L、1000mg/L的培养基，并与铜含量为0mg/L的基础液体培养基构成铜梯度培养基，备用；
（3）微生物梯度培养
将步骤（1）处理所获得的啤酒酵母和产朊假丝酵母分别依次培养于步骤（2）所制得铜梯度培养基中，培养时间为24h，培养温度为30.5℃，从而使啤酒酵母和产朊假丝酵母对铜有较强的适应能力；
（4）种子培养基的制备
获取啤酒生产过程中新鲜的糖化废液，在4000r/min转速下离心7min，经过测定其COD浓度在2800mg/L，然后按照重量比添加3.5%的蔗糖、0.3%的尿素、0.25%的食盐、0.02%的硫化钠，混匀后121℃灭菌18min，并调pH至5.2，即制成种子培养基，并将其平均分做两份，备用；
（5）发酵种子的制备
将经过步骤（3）处理的啤酒酵母和产朊假丝酵母按照10%的接种比例分别接种于步骤（4）所制备的两份种子培养基中，将接种后的培养基放置于30.5℃的恒温培养箱内培养24h，即获得啤酒酵母发酵种子和产朊假丝酵母发酵种子；
（6）发酵液的制备
发酵液是利用啤酒生产过程中的糖化废液制成的，具体制备方法如下：
取啤酒生产过程中新鲜的糖化废液，在3500r/min转速下离心7min，然后按照重量比依次加入1.0%的蔗糖、20%的玉米面、0.3%的尿素、0.25%的食盐以及0.02%的硫化钠，并于121℃灭菌18min，调整pH至5.2，即可制成发酵液；
（7）微生物发酵
取五水硫酸铜重量的20%混合在步骤（6）所制得发酵液中，置于发酵容器内，并按照10%的接种比例向发酵容器内的发酵液中接种步骤（5）所制得的啤酒酵母发酵种子和产朊假丝酵母发酵种子，然后调节温度至30.5℃进行发酵，2h后，向发酵容器内再次加入20%的五水硫酸铜，并搅拌均匀，再继续发酵至6h后，再次加入20%的五水硫酸铜，搅拌均匀，继续发酵至12h后，加入剩余的40%的五水硫酸铜，搅拌均匀，使发酵液中铜含量达到1200mg/L，继续发酵24h，合计一共发酵36h后，完成发酵过程；
（8）酵母发酵态铜饲料添加剂的制作
将步骤（7）所得的发酵产物进行过滤，收取固体物，所得滤液在3500r/min条件下离心10min，获得固体沉淀物，然后将过滤所得的固体物和离心所得的固体沉淀物混合均匀，置于65℃电热恒温干燥箱内进行干燥处理，至物料水分损失至10%左右即为干燥，干燥后用粉碎机将其粉碎并过60目筛，从而获得酵母发酵态铜饲料添加剂；
（9）包装
以1000g为单位，将步骤（8）所获得的酵母发酵态铜饲料添加剂用复合薄膜进行真空包装，真空度为0.09Mpa。
在酵母发酵态铜饲料添加剂制备好之后，采用原子吸收光谱法对添加剂中铜含量分析，发现铜含量为7.58g/kg。
本发明所制得的酵母发酵态铜饲料添加剂在动物饲料中的推荐添加量为400~800g/100kg全价料。
试验案例
1、试验样品处理：
胃蛋白酶溶液（pepsinsolution），简称胃液：每100mL的0.1N盐酸中含2.5g胃蛋白酶，加入阳离子交换树脂（Chelex-100）5g，室温振荡反应30min，离心或过滤移出树脂以去除试剂中含有的铜。此溶液胃蛋白酶浓度25mg/mL，pH2.0。置于玻璃血清瓶中4℃冰箱保存，于一个星期内使用完。
胰液－胆盐悬浮液（pancreatin-bilesuspension），简称胰液：每100mL的0.1M碳酸氢钠溶液中含有0.2g胰蛋白酶及1.0g胆汁萃取物，加入阳离子交换树脂15g，室温振荡反应30min，离心或过滤移出树脂以去除试剂中的铜，此溶液每毫升含2mg胰蛋白酶和10mg胆汁萃取物，pH7.0。置玻璃血清瓶中，贮存于4℃冰箱，一周内用完。
分别准确称取一定量的五水硫酸铜和本发明所制备的发酵态铜，溶解于5mL胃液，pH2.0，于37℃恒温振荡器，55oscillation/min振荡60min。然后，用1mol/L的NaHCO3溶液调pH值至6.0，加入25mL胰液-胆汁悬浮液，用1mol/L的NaHCO3溶液调pH值至7.0，于37℃恒温振荡器上，55oscillation/min振荡120min。将消化液用pH7.0的120mmol/LNaCl和5mmol/LKCl混合溶液稀释，稀释后的消化溶液于4000rpm，4℃下离心5min，获取消化上清液，从而分别制得铜浓度为20μmol/L的五水硫酸铜和发酵态铜试验液。
2、铜生物有效性试验：
该试验采用的模型为Caco-2细胞转运模型，即细胞培养于插入槽上的聚碳酸酯膜上，从而把培养孔分为上下2部分，细胞上部为顶部（相当于肠道肠腔侧），细胞下部为基底部（相当于浆膜层或血液侧）。分别取五水硫酸铜和发酵态铜试验液1.5mL加入细胞顶部，同时在基底部加入2.5mL不含铜的D-Hank’s液，将细胞培养于37℃恒温振荡器上，55oscillation/min振荡24h。试验结束后，取基底部D-Hank’s液，用电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）测定其中铜含量。
3、结果：
图1显示的为Caco-2细胞单层对五水硫酸铜和发酵态铜的转运量。结果表明，发酵态铜转运铜量为2.62μg，是五水硫酸铜的8.03倍，这一结果说明本发明所制备的发酵态铜生物学有效性显著高于五水硫酸铜。
Claims (1)
1.一种利用啤酒废液生产酵母发酵态铜饲料添加剂的方法，所用的发酵菌种为啤酒酵母和产朊假丝酵母，所用的铜为可溶解在稀酸溶液中的无机铜化合物，其特征在于：包括如下步骤：
（1）培养基制备以及微生物培养
取葡萄糖20g、蛋白胨20g、酵母浸膏10g、琼脂20g，用蒸馏水溶解、定容至1000mL，用高压锅在121℃灭菌20min-30min，调pH至5.0~5.5，制得培养基，然后将啤酒酵母和产朊假丝酵母从冰箱取出复苏，培养于该培养基上24h，以获得复活的啤酒酵母和产朊假丝酵母；
（2）基础液体培养基与铜梯度培养基制备
基础液体培养基的制法为：依次向1000ml蒸馏水中加入葡萄糖20g、蛋白胨20g以及酵母浸膏10g，并搅拌混匀，调整pH至5.0~5.2，备用；
铜梯度培养基的制法为：在上述基础液体培养基中加入可溶解在稀酸溶液中的无机铜化合物，得到铜含量分别为50mg/L、100mg/L、150mg/L、300mg/L、500mg/L、800mg/L、1000mg/L的培养基，并与铜含量为0mg/L的基础液体培养基构成铜梯度培养基，备用；
（3）微生物梯度培养
将步骤（1）处理所获得的啤酒酵母和产朊假丝酵母分别依次培养于步骤（2）所制得铜梯度培养基中，培养时间为24h，培养温度为30.5℃；
（4）种子培养基的制备
获取啤酒生产过程中新鲜的糖化废液，在4000r/min转速下离心5~10min，然后按照重量比添加3.5%的蔗糖、0.3%的尿素、0.25%的食盐、0.02%的硫化钠，混匀后121℃灭菌15~20min，并调pH至5.0~5.5，即制成种子培养基，并将其平均分做两份，备用；
（5）发酵种子的制备
将经过步骤（3）处理的啤酒酵母和产朊假丝酵母按照10%的接种比例分别接种于步骤（4）所制备的两份种子培养基中，一份种子培养基接种一种酵母菌，将接种后的培养基放置于30.5℃的恒温培养箱内培养24h，即获得啤酒酵母发酵种子和产朊假丝酵母发酵种子；
（6）发酵液的制备
发酵液是利用啤酒生产过程中的糖化废液或发酵废液制成的，具体制备方法如下：
a、利用糖化废液制作发酵液：取啤酒生产过程中新鲜的糖化废液，在3500~4000r/min转速下离心5~10min，然后按照重量比依次加入1.0%的蔗糖、20%的玉米面、0.3%的尿素、0.25%的食盐以及0.02%的硫化钠，并于121℃灭菌15~20min，调整pH至5.0~5.5，即可制成发酵液；
b、利用发酵废液制作发酵液：取啤酒生产过程中新鲜的发酵废液，在3500~4000r/min转速下离心5~10min，再在60~65℃水浴锅内水浴加热30~40min，加热期间不断用灭菌的玻璃棒搅拌，使发酵废液中残留的乙醇挥发，同时达到灭菌效果，然后按照重量比，向灭菌后的发酵废液中加入2.0%的蔗糖、20%的玉米面、0.5%的尿素、0.25%的食盐以及0.02%的硫化钠，并调整pH至5.0~5.5，即可制成发酵液；
（7）微生物发酵
将待发酵的无机铜化合物按照重量取其中的20%混合在步骤（6）所制得发酵液中，置于发酵容器内，并按照10%的接种比例向发酵容器内的发酵液中接种步骤（5）所制得的啤酒酵母发酵种子和产朊假丝酵母发酵种子，然后调节温度至30.5℃进行发酵，2h后，向发酵容器内再次加入20%的待发酵的无机铜化合物，并搅拌均匀，再继续发酵至6h后，再次加入20%的待发酵的无机铜化合物，搅拌均匀，使发酵培养基中铜含量达到1200mg/L，继续发酵至12h后，加入剩余的40%的待发酵的无机铜化合物，搅拌均匀，继续发酵24h后，完成发酵过程；
（8）酵母发酵态铜饲料添加剂的制作
将步骤（7）所得的发酵产物进行过滤，收取固体物，所得滤液在3500~4000r/min条件下离心10min，获得固体沉淀物，然后将过滤所得的固体物和离心所得的固体沉淀物混合均匀，置于65℃电热恒温干燥箱内进行干燥处理，干燥后用粉碎机将其粉碎并过60目筛，从而获得酵母发酵态铜饲料添加剂；
（9）包装
以1000g为单位，将步骤（8）所获得的酵母发酵态铜饲料添加剂用复合薄膜进行真空包装，真空度为0.085~0.095Mpa。
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