CN101407761A - 酵母融合菌、白地霉菌和根霉菌液体菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

酵母融合菌、白地霉菌和根霉菌液体菌剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明主要涉及微生物的发酵方法，尤其涉及利用食品行业产生的废液制备酵母融合菌(F306)、白地霉菌(G361)和根霉菌(R)三菌组合的液体菌剂的方法和应用。其主要特点在于由酵母融合菌、白地霉菌(Geotrichum Candidum Link)、根霉菌(Rhizopus)和液体培养基组成，其三种菌株的重量百分比为酵母融合菌为55～65％、白地霉菌为30～35％、根霉菌5～10％，所述的微生物液体菌剂的液体培养基包括有在1升新鲜豆腐废水或粉丝废水或玉米淀粉废水或洋芋淀粉废水中加入硫酸铵1－2g，磷酸0.5－1ml，用1％的石灰水调pH 5.5－6.5。所述的酵母融合菌、白地霉菌和根霉菌液体菌剂在处理有机废水时有很好的应用效果。

Description

酵母融合菌、白地霉菌和根霉菌液体菌剂及其制备方法和应用
技术领域：
本发明主要涉及微生物的发酵方法，尤其涉及利用食品行业产生的废液制备酵母融合菌(F306)、白地霉菌(G361)和根霉菌(R)三菌组合的FGR液体菌剂的方法和在处理有机废水的应用。
背景技术：
传统的微生物液体菌剂的制备方法，所用原料是葡萄糖、蛋白胨、糖蜜、牛肉膏、维生素，无机盐和水配制成液体培养基，从试管斜面菌种上刮取菌苔接种在液体培养基中，经好氧或厌氧培养制备成液体菌剂，其缺点是：所用原料成本高，生产工艺复杂，不能节约能源。
传统的微生物液体菌剂制备所采用的微生物菌种大多是：从国家或地方菌种库或直接从自然界分离筛选出的菌种，其缺点是：1.微生物菌种的活性差；2.对有机物分解转化能力弱；3.这些菌种所制备的菌剂活细胞数少，大多数在108个/克。
混合菌剂传统做法，是将各种不同的菌种(好氧和厌氧)在各自不同的生长环境中培养菌种，然后从每个菌种的培养物中刮取菌苔制取每个菌的液体菌悬液，再转种于各自的液体培养液经通气或厌氧发酵培养后离心制取活性细胞菌，将沉淀物喷雾干燥制成粉剂，制成多菌的混合。其缺点是：制备工艺复杂，发酵周期长，成本高，应用受到限制。
发明内容：
本发明的目的在于避免现有微生物液体菌剂生产技术不足之处而提供一种酵母融合菌、白地霉菌和根霉菌液体菌剂及其制备方法和应用。
使用酵母融合菌与白地霉菌和根霉菌科学配伍，以新鲜豆腐或粉丝或玉米或洋芋淀粉产生的废水为原料，添加少量无机盐制备酵母融合菌、白地霉菌和根霉菌液固体菌剂。该方法是利用食品行业产生的废液为原料，生产过程无“三废”污染，生产工艺简单，操作方便，节省人力，节省能源，其液体菌剂，即可用于有机废水净化剂，又可作为微生物饲料和微生物肥料，也可以用于石油开采、食品工业、环境工程、医疗和精细化工等行业。
本发明的目的可以通过采用以下技术方案实现：一种酵母融合菌、白地霉菌和根霉菌液体菌剂，其特点在于由酵母融合菌、白地霉菌(Geotrichum Candidum Link)、根霉菌(Rhizopus)和液体培养基组成，其三种菌株的重量百分比为酵母融合菌为55～65％、白地霉菌为30～35％、根霉菌5～10％，所述的酵母融合菌的保藏号为CGMCC 2461，保藏日期为2008年04月21日，分类命名为酿酒酵母(Saccharomyces CerevisiaeHansen)。白地霉菌(Geotrichum Candidum Link)是中国科学院微生物菌种中心保存的安全菌种，编号为AS.2.361，根霉菌(Rhizopus)是市场公开销售菌种。
所述的液体培养基包括有在1升新鲜豆腐废水或粉丝废水或玉米淀粉废水或洋芋淀粉废水中加入硫酸铵1-2g，磷酸0.5-1ml，用1％的石灰水调pH 5.5-6.5。
所述的酵母融合菌、白地霉菌和根霉菌液体菌剂的制备方法，其特点是有如下步骤：
A.琼脂斜面培养基的制备及菌种的培养：
a.琼脂斜面培养基的制备：麦芽汁0.5-2％、葡萄糖0.5-2％、蛋白胨0.2-0.6％、琼脂粉1-3％、无菌水80-120ml，加热溶解后，用1％的氢氧化钠调pH值至5.5-6.5，经110-114℃，30-35分钟蒸汽灭菌，然后在无菌条件下分装于15×1.5cm的干燥灭菌的试管摆成斜面待凝固后备用；
b.菌种的培养：分别取酵母融合菌、白地霉菌和根霉菌的母种琼脂斜面菌，在无菌条件下，转种于上述制备的琼脂斜面培养基上，经28-32℃、24-48小时培养，即得琼脂斜面菌种，为一级菌种；
B液体培养基的制备及液体菌种的培养：
a.液体培养基的制备：在1升新鲜豆腐废水或粉丝废水或玉米淀粉废水或洋芋淀粉废水中加入硫酸铵1-2g，磷酸0.5-1ml，用1％的石灰水调pH 5.5-6.5，分装于500ml三角烧瓶中，分装量为瓶子容量的1/4，然后经110-112℃，30-35分钟高压灭菌，冷却后备用；
b.分别取酵母融合菌、白地霉菌和根霉菌的一级菌种，在无菌条件下，接种于液体培养液中，经28-32℃、24-48小时培养，其培养液为二级菌种；
c.分别取酵母融合菌、白地霉菌和根霉菌的二级菌种再扩大培养，上摇床振荡培养，经振幅100～120r/min、温度28～32℃、18～24小时培养，其菌液为三级菌种；
d.分别将重量百分比为酵母融合菌为55～65％、白地霉菌为30～35％、根霉菌为5～10％三级菌种再扩大培养，培养液可以不灭菌，三种菌在同一个发酵罐，经28-32℃、18-24小时的通气搅拌发酵培养，其菌液为酵母融合菌、白地霉菌和根霉菌混合菌剂分装，即为四级菌种，然后继续逐级扩大培养。
所述的酵母融合菌的制备有如下步骤：将酒精酵母菌(Saecharomycescervsiar)作母种的斜面转种和培养，在液体振荡培养14小时后，用EDTA-巯基乙醇进行预处理，使用1％的纤维素酶和1％蜗牛酶进行酶解脱壁，时间为2小时，温度33℃，得到酒精酵母原生质体；将热带假丝酵母菌(Saecharomycescervsiar)作母种的斜面转种和培养，在液体振荡培养14小时后，用EDTA-巯基乙醇进行预处理，使用1.5％的纤维素酶和0.5％的蜗牛酶进行酶解脱壁，时间为2.5小时，温度33℃，得到热带假丝酵母原生质体；将热带假丝酵母原生质体经0.1％碘乙酸灭活，与酒精酵母原生质体以1∶1混合，将沉淀悬于35％聚乙二醇(PEG)的促溶剂中，30℃水浴静止处理，pH 6.0，时间为40min，融合菌液经高渗磷酸缓冲液(PBS)液反复冲洗，涂布于高渗选择型培养基(MMS)和高渗完全培养基(YPDS)平板培养基上，经30℃、7天培养，平板生长出酵母融合菌。
所述的酵母融合菌的培养基为：麦芽汁0.5-2％、葡萄糖0.5-2％、蛋白胨0.2-0.6％、琼脂粉1-3％、无菌水80-120ml，加热溶解后，用1％的氢氧化钠调pH值至5.5-6.5，经110-114℃，30-35分钟蒸汽灭菌，然后在无菌条件下分装于15×1.5cm的干燥灭菌的试管摆成斜面待凝固后备用。
所述的酵母融合菌、白地霉菌和根霉菌液体菌剂在处理有机废水上的应用，其特点在于：所述的处理有机废水的方法为，将有机废水放入调节池(1)，按每升有机废水中加入硫酸铵1-2g，磷酸0.5-1ml，用1％的石灰水调pH 5.5～6.5，经酵母融合菌贮藏器(9)加入8-12％的酵母融合菌、白地霉菌和根霉菌的混合菌剂；然后进入曝气池(2)中曝气并保证处理温度28-32℃，pH 4～5；然后经第一贮水池(3)进入离心机(4)，离心机(4)使多余的菌体进入酵母融合菌贮藏器(9)；再经第二贮水池(5)进入接触氧气池(6)，然后经过滤池(7)过滤后进入沉淀池(8)，过滤池(7)内的pH值为7.0沉淀池(8)的沉淀污泥回流至曝气池(2)，其处理工艺参数为：处理温度，28-32℃；反应器中溶解氧≥2mg/L；菌体浓度，2-10g/L。
所述的有机废水为新鲜豆腐废水或粉丝废水或玉米淀粉废水或洋芋淀粉废水。
我们采用先进的单亲灭活原生质体融合技术，对热带假丝酵母(Candidatropicalis)968和酒精酵母(Saecharomycescervsiar)2.399两亲本菌株做融合，构建新的基因工程菌，这些融合菌即具有双亲的生物特性，又具有优于双亲的活性酶，絮凝性和耐高温的生物特性。能充分利用豆腐、粉丝和玉米洋芋淀粉废水中有机物的营养物质进行生长繁殖，并能很好的去除废水中有机物CODcr，去除率为84.9％，利用酵母融合菌(F306)配伍白地霉菌(G361)和根霉菌(R)三菌组合制备酵母融合菌、白地霉菌和根霉菌液体菌剂。G361白地霉菌是一种很粗生营养价值类似产肮假丝酵母的微生物，又能利用硫酸铵和尿素合成蛋白质，纯菌体蛋白质含量高达40％以上，根霉菌能分泌活性强的糖化酶，能将淀粉结构中的a-1，a-4和a-6键打断，而完成将淀粉转化为纯度高的葡萄糖供酵母融合菌和白地霉菌利用，三菌的科学配比和独特的发酵工艺，使其在生长过程中产生的有用物质及其分泌物质成为各自或相互生长的基料和原料，通过三菌相互间的这种共生增殖关系，形成了一个复杂而稳定的微生态系统，发挥了多功能的优势。
酵母融合菌、白地霉菌和根霉菌三菌在新鲜的豆腐、粉丝、玉米、洋芋淀粉产生的废水中，添加少量的无机盐，直接发酵制备酵母融合菌、白地霉菌和根霉菌液体菌剂，既节省了培养基的原料，减少原料配制和高压灭菌的工序，节省了能源，也解决了这些行业治污的难题，是一项变废为宝，一举多得的生物技术。
酵母融合菌、白地霉菌和根霉菌菌剂即可作为有机废水处理净化剂，又可在农、林、牧、渔业上应用，也可作为生物絮凝剂，表面活性剂，生物吸附剂等应用于石油开采、食品工业、环境工程、医疗和精细化工等行业，具有较广的应用价值。
本发明的效果：酵母融合菌、白地霉菌和根霉菌液体菌剂在处理有机废水时的应用效果：
a.在豆腐废水中，经30℃通气发酵培养24小时，其有机物CODcr去除率为84.9％，絮凝性为43.1％，生物量为18800mg/L。
b.在玉米淀粉废水中，经30℃通气发酵培养24小时，其有机物CODcr去除率为41.63％，生物量为5500mg/L。
c.在粉丝废水中，经30℃通气发酵培养24小时，其有机物CODcr去除率为52.2％，絮凝性为58％，生物量为10500mg/L。
附图说明：
图1为本发明的制备工艺流程示意图；
图2为本发明处理有机废水工艺流程示意图。
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明：
见图1，实施例1
(1)试管液体菌种的培养，取新鲜豆腐废水经煮沸10分钟自然沉淀取上清液100ml，加入(NH4)2SO4 0.1g，H3PO4 0.05ml，充分溶解后调节PH至5.5～6.5，分装于15×1.5cm的干燥试管中，经112℃，30分钟高压灭菌，冷却至32℃，分别接种F306酵母融合菌、G361白地霉菌、和R根霉菌于试管液体培养基中，经28～32℃培养24～48小时，即为试管液体菌种(一级菌种)
(2)三角烧瓶液体菌种的培养
取新鲜豆腐废水经煮沸10分钟自然沉淀取上清液1000ml，加入(NH4)2SO4 1g，H3PO40.5ml，充分溶解后调节PH至5.5～6.5，分装于500ml三角烧瓶中，分装量为瓶子总量的1/4，然后经112℃，30分钟高压灭菌，冷却至32℃，将试管液体菌种接种在液体三角烧瓶培养基中，经28～32℃培养24～48小时，即为液体三角烧瓶菌种(二级菌种)
(3)液体扩大培养生产菌种
取新鲜豆腐废水经煮沸10分钟自然沉淀取上清液10000ml，加入(NH4)2SO4 10g，H3PO4 5ml，充分溶解后调节PH至5.5～6.5，分装于500ml三角烧瓶中，分装量为瓶子总量的1/4，然后经112℃，30分钟高压灭菌，冷却至32℃，将二级菌种接种在液体三角烧瓶培养基中，上摇床振荡培养，振幅为100～120r/min，经温度28～32℃培养18～24小时发酵培养，其培养液为三级菌种。
(4)取三级菌种再扩大培养，上发酵罐，所用新鲜豆腐废水不灭菌，将重量百分比为55％的F306酵母融合菌、35％的G361白地霉菌、和10％的R根霉菌三菌培养液接入后，经28～32℃培养18～24小时，通气搅拌发酵培养，其发酵液即为F306酵母融合菌、G361白地霉菌、和R根霉菌液体菌剂，活细胞数为1.0～2.0×1010个/ml；
(5)根据需要可逐级扩大产量。
实施例2
(1)试管液体菌种的培养，取新鲜粉丝废水100ml，加入(NH4)2SO4 0.1g，H3PO4 0.05ml，充分溶解后调节PH至5.5～6.5，分装于15×1.2cm的干燥试管中，经112℃，30分钟高压灭菌，冷却至32℃，分别接种F306酵母融合菌、G361白地霉菌、和R根霉菌于试管液体培养基中，经28～32℃培养24～48小时，即为试管液体菌种(一级菌种)
(2)三角烧瓶液体菌种的培养
取新鲜粉丝废水1000ml，加入(NH4)2SO4 1g，H3PO4 0.5ml，充分溶解后调节PH至5.5～6.5，分装于500ml三角烧瓶中，分装量为瓶子总量的1/4，然后经112℃，30分钟高压灭菌，冷却至32℃，将试管液体菌种接种在液体三角烧瓶培养基中，经28～32℃培养24～48小时，即为液体三角烧瓶菌种(二级菌种)。
(3)液体扩大培养生产菌种：
取新鲜粉丝废水10000ml，加入(NH4)2SO4 10g，H3PO4 5ml，充分溶解后调节PH至5.5～6.5，分装于500ml三角烧瓶中，分装量为瓶子总量的1/4，然后经112℃，30分钟高压灭菌，冷却至32℃，将二级菌种接种在液体三角烧瓶培养基中，上摇床振荡培养，振幅为100～120r/min，经温度28～32℃培养18～24小时发酵培养，其培养液为三级菌种。
(4)取三级菌种再扩大培养，上发酵罐，所用新鲜粉丝废水不灭菌，将重量百分比为65％的F306酵母融合菌、30％的G361白地霉菌、和5％的R根霉菌三菌培养液接入后，经28～32℃培养18～24小时，通气搅拌发酵培养，其成熟的发酵液即为F306酵母融合菌、G361白地霉菌、和R根霉菌液体菌剂，活细胞数为0.8～1.8×1010个/ml；
(5)根据需要可逐级扩大产量。
实施例3
(1)试管液体菌种的培养，取新鲜玉米淀粉废水，经煮沸10分钟自然沉淀取上清液100ml，加入(NH4)2SO4 0.1g，H3PO4 0.05ml，充分溶解后调节PH至5.5～6.5，分装于15×1.2cm的干燥试管中，经112℃，30分钟高压灭菌，冷却至32℃，分别接种F306酵母融合菌、G361白地霉菌、和R根霉菌于试管液体培养基中，经28～32℃培养24～48小时，即为试管液体菌种(一级菌种)
(2)三角烧瓶液体菌种的培养
取新鲜玉米淀粉废水，经煮沸10分钟自然沉淀取上清液1000ml，加入(NH4)2SO4 1g，H3PO4 0.5ml，充分溶解后调节PH至5.5～6.5，分装于500ml三角烧瓶中，分装量为瓶子总量的1/4，然后经112℃，30分钟高压灭菌，冷却至32℃，将试管液体菌种接种在液体三角烧瓶培养基中，经28～32℃培养24～48小时，即为液体三角烧瓶菌种(二级菌种)
(3)液体扩大培养生产菌种
取新鲜玉米淀粉废水，经煮沸10分钟自然沉淀取上清液10000ml，加入(NH4)2SO410g，H3PO4 5ml，充分溶解后调节PH至5.5～6.5，分装于500ml三角烧瓶中，分装量为瓶子总量的1/4，然后经112℃，30分钟高压灭菌，冷却至32℃，将二级菌种接种在液体三角烧瓶培养基中，上摇床振荡培养，振幅为100～120r/min，经温度28～32℃培养18～24小时发酵培养，其培养液为三级菌种。
(4)取三级菌种再扩大培养，上发酵罐，所用新鲜粉丝废水不灭菌，将重量百分比为60％的F306酵母融合菌、32％的G361白地霉菌、和8％的R根霉菌三菌培养液接入后，经28～32℃培养18～24小时，通气搅拌发酵培养，其成熟的发酵液即为F306酵母融合菌、G361白地霉菌、和R根霉菌液体菌剂，活细胞数为1.2～2.2×1010个/ml；
(5)根据需要可逐级扩大产量。
实施例4
(1)试管液体菌种的培养，取新鲜洋芋淀粉废水，经煮沸10分钟自然沉淀取上清液100ml，加入(NH4)2SO4 0.1g，H3PO4 0.05ml，充分溶解后调节PH至5.5～6.5，分装于15×1.2cm的干燥试管中，经112℃，30分钟高压灭菌，冷却至32℃，分别接种F306酵母融合菌、G361白地霉菌、和R根霉菌于试管液体培养基中，经28～32℃培养24～48小时，即为试管液体菌种(一级菌种)。
(2)三角烧瓶液体菌种的培养：
取新鲜洋芋淀粉废水，经煮沸10分钟自然沉淀取上清液1000ml，加入(NH4)2SO4 1g，H3PO4 0.5ml，充分溶解后调节PH至5.5～6.5，分装于500ml三角烧瓶中，分装量为瓶子总量的1/4，然后经112℃，30分钟高压灭菌，冷却至32℃，将试管液体菌种接种在液体三角烧瓶培养基中，经28～32℃培养24～48小时，即为液体三角烧瓶菌种(二级菌种)
(3)液体扩大培养生产菌种：
取新鲜洋芋淀粉废水，经煮沸10分钟自然沉淀取上清液10000ml，加入(NH4)2SO410g，H3PO4 5ml，充分溶解后调节PH至5.5～6.5，分装于500ml三角烧瓶中，分装量为瓶子总量的1/4，然后经112℃，30分钟高压灭菌，冷却至32℃，将二级菌种接种在液体三角烧瓶培养基中，上摇床振荡培养，振幅为100～120r/min，经温度28～32℃培养18～24小时发酵培养，其培养液为三级菌种。
(4)取三级菌种再扩大培养，上发酵罐，所用新鲜粉丝废水不灭菌，将重量百分比为60％的F306酵母融合菌、35％的G361白地霉菌、和5％的R根霉菌三菌培养液接入后，经28～32℃培养18～24小时，通气搅拌发酵培养，其成熟的发酵液即为F306酵母融合菌、G361白地霉菌、和R根霉菌液体菌剂，活细胞数为1.2～2.2×1010个/ml；
(5)根据需要可逐级扩大产量。
实施例5
一种酵母融合菌的制备有如下步骤：将酒精酵母菌(Saecharomycescervsiar)作母种的斜面转种和培养，在液体振荡培养14小时后，用EDTA-巯基乙醇进行预处理，使用1％的纤维素酶和1％蜗牛酶进行酶解脱壁，时间为2小时，温度33℃，得到酒精酵母原生质体；将热带假丝酵母菌(Saecharomycescervsiar)作母种的斜面转种和培养，在液体振荡培养14小时后，用EDTA-巯基乙醇进行预处理，使用1.5％的纤维素酶和0.5％的蜗牛酶进行酶解脱壁，时间为2.5小时，温度33℃，得到热带假丝酵母原生质体；将热带假丝酵母原生质体经0.1％碘乙酸灭活，与酒精酵母原生质体以1∶1混合，将沉淀悬于35％聚乙二醇(PEG)的促溶剂中，30℃水浴静止处理，pH 6.0，时间为40min，融合菌液经高渗磷酸缓冲液(PBS)液反复冲洗，涂布于高渗选择型培养基(MMS)和高渗完全培养基(YPDS)平板培养基上，经30℃、7天培养，平板生长出酵母融合菌。
所述的酵母融合菌的培养基为：麦芽汁0.5-2％、葡萄糖0.5-2％、蛋白胨0.2-0.6％、琼脂粉1-3％、无菌水80-120ml，加热溶解后，用1％的氢氧化钠调pH值至5.5-6.5，经110-114℃，30-35分钟蒸汽灭菌，然后在无菌条件下分装于15×1.5cm的干燥灭菌的试管摆成斜面待凝固后备用。
实施例6，
见图2，酵母融合菌、白地霉菌和根霉菌液体菌剂处理有机废水的方法，将有机废水放入调节池1，按每升有机废水中加入硫酸铵1-2g，磷酸0.5-1ml，用1％的石灰水调pH 5.5～6.5，经酵母融合菌贮藏器9加入8-12％的酵母融合菌、白地霉菌和根霉菌的混合菌剂；然后进入曝气池2中曝气并保证处理温度28-32℃，pH 4～5；然后经第一贮水池3进入离心机4，离心机4使多余的菌体进入酵母融合菌贮藏器9；再经第二贮水池5进入接触氧气池6，然后经过滤池7过滤后进入沉淀池8，过滤池7内的pH值为7.0沉淀池8的沉淀污泥回流至曝气池2，其处理工艺参数为：处理温度，28-32℃；反应器中溶解氧≥2mg/L；菌体浓度，2-10g/L。

Claims (6)

1.一种酵母融合菌、白地霉菌和根霉菌液体菌剂，其特征在于由酵母融合菌、白地霉菌(Geotrichum Candidum Link)、根霉菌(Rhizopus)和液体培养基组成，其三种菌株的重量百分比为酵母融合菌为55～65％、白地霉菌为30～35％、根霉菌5～10％，所述的酵母融合菌的保藏号为CGMCC 2461。
2.如权利要求1所述的酵母融合菌、白地霉菌和根霉菌液体菌剂，其特征在于所述的液体培养基包括有在1升新鲜豆腐废水或粉丝废水或玉米淀粉废水或洋芋淀粉废水中加入硫酸铵1-2g，磷酸0.5-1ml，用1％的石灰水调pH 5.5-6.5。
3.如权利要求1所述的酵母融合菌、白地霉菌和根霉菌液体菌剂的制备方法，其特征在于有如下步骤：
A.琼脂斜面培养基的制备及菌种的培养：
a.琼脂斜面培养基的制备：麦芽汁0.5-2％、葡萄糖0.5-2％、蛋白胨0.2-0.6％、琼脂粉1-3％、无菌水80-120ml，加热溶解后，用1％的氢氧化钠调pH值至5.5-6.5，经110-114℃，30-35分钟蒸汽灭菌，然后在无菌条件下分装于15×1.5cm的干燥灭菌的试管摆成斜面待凝固后备用；
b.菌种的培养：分别取酵母融合菌、白地霉菌和根霉菌的母种琼脂斜面菌，在无菌条件下，转种于上述制备的琼脂斜面培养基上，经28-32℃、24-48小时培养，即得琼脂斜面菌种，为一级菌种；
B液体培养基的制备及液体菌种的培养：
a.液体培养基的制备：在1升新鲜豆腐废水或粉丝废水或玉米淀粉废水或洋芋淀粉废水中加入硫酸铵1-2g，磷酸0.5-1ml，用1％的石灰水调pH 5.5-6.5，分装于500ml三角烧瓶中，分装量为瓶子容量的1/4，然后经110-112℃，30-35分钟高压灭菌，冷却后备用；
b.分别取酵母融合菌、白地霉菌和根霉菌的一级菌种，在无菌条件下，接种于液体培养液中，经28-32℃、24-48小时培养，其培养液为二级菌种；
c.分别取酵母融合菌、白地霉菌和根霉菌的二级菌种再扩大培养，上摇床振荡培养，经振幅100～120r/min、温度28～32℃、18～24小时培养，其菌液为三级菌种；
d.分别将重量百分比为酵母融合菌为55～65％、白地霉菌为30～35％、根霉菌为5～10％三级菌种再扩大培养，三种菌在同一个发酵罐，经28-32℃、18-24小时的通气搅拌发酵培养，其菌液为酵母融合菌、白地霉菌和根霉菌混合菌剂分装，即为四级菌种，然后继续逐级扩大培养。
4.如权利要求3所述的酵母融合菌、白地霉菌和根霉菌液体菌剂的制备方法，其特征在于所述的酵母融合菌的制备有如下步骤：将酒精酵母菌(Saecharomycescervsiar)作母种的斜面转种和培养，在液体振荡培养14小时后，用EDTA-巯基乙醇进行预处理，使用1％的纤维素酶和1％蜗牛酶进行酶解脱壁，时间为2小时，温度33℃，得到酒精酵母原生质体；将热带假丝酵母菌(Saecharomycescervsiar)作母种的斜面转种和培养，在液体振荡培养14小时后，用EDTA-巯基乙醇进行预处理，使用1.5％的纤维素酶和0.5％的蜗牛酶进行酶解脱壁，时间为2.5小时，温度33℃，得到热带假丝酵母原生质体；将热带假丝酵母原生质体经0.1％碘乙酸灭活，与酒精酵母原生质体以1∶1混合，将沉淀悬于35％聚乙二醇的促溶剂中，30℃水浴静止处理，pH 6.0，时间为40min，融合菌液经高渗磷酸缓冲液反复冲洗，涂布于高渗选择型培养基和高渗完全培养基平板培养基上，经30℃、7天培养，平板生长出酵母融合菌。
5.如权利要求4所述的酵母融合菌、白地霉菌和根霉菌液体菌剂的制备方法，其特征在于所述的酵母融合菌的培养基为：麦芽汁0.5-2％、葡萄糖0.5-2％、蛋白胨0.2-0.6％、琼脂粉1-3％、无菌水80-120ml，加热溶解后，用1％的氢氧化钠调pH值至5.5-6.5，经110-114℃，30-35分钟蒸汽灭菌，然后在无菌条件下分装于15×1.5cm的干燥灭菌的试管摆成斜面待凝固后备用。
6.如权利要求1所述的酵母融合菌、白地霉菌和根霉菌液体菌剂在处理有机废水上的应用，其特征在于：所述的处理有机废水的方法为，将有机废水放入调节池(1)，按每升有机废水中加入硫酸铵1-2g，磷酸0.5-1ml，用1％的石灰水调pH 5.5～6.5，经酵母融合菌贮藏器(9)加入8-12％的酵母融合菌、白地霉菌和根霉菌的混合菌剂；然后进入曝气池(2)中曝气并保证处理温度28-32℃，pH 4～5；然后经第一贮水池(3)进入离心机(4)，离心机(4)使多余的菌体进入酵母融合菌贮藏器(9)；再经第二贮水池(5)进入接触氧气池(6)，然后经过滤池(7)过滤后进入沉淀池(8)，过滤池(7)内的pH值为7.0沉淀池(8)的沉淀污泥回流至曝气池(2)，其处理工艺参数为：处理温度，28-32℃；反应器中溶解氧≥2mg/L；菌体浓度，2-10g/L。
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