CN101407774A - 一种光合细菌制剂的制备工艺 - Google Patents

Abstract

本发明提出一种光合细菌制剂的制备工艺，该工艺方法用沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)菌种经斜面种子活化培养、摇床种子培养和通气发酵罐培养等培养步骤，采用的培养基包括基本培养基和促生长剂。基本培养基按质量比含有：葡萄糖0.9～1.1％、脲0.04～0.06％、磷酸氢二钾0.02～0.03％、磷酸二氢钾0.02～0.03％、硫酸镁0.02～0.03％、氯化钠0.20～0.30％、氯化钙0.03～0.05％、水98.40～98.77％。促生长剂是以基本培养基的质量为基准添加黄腐酸0.10～0.30％。本工艺获得的光合细菌制剂的菌液浓度可达40～60亿个/ml，菌剂可用于水产养殖、废水处理、种植业等多个领域。

Description

一种光合细菌制剂的制备工艺

技术领域：

本发明属于生物技术领域，涉及一种光合细菌制剂的制备工艺。

背景技术：

光合细菌是一群能在厌氧光照或好氧黑暗条件下利用有机物作供氧体兼碳源的细菌。光合细菌在水产养殖、废水处理、种植业等领域具有广泛应用。目前已开发出多种培养光合细菌的方法和装置，这些方法主要是基于光合细菌是能在厌氧光照条件下生长的原理而开发的，其设施通常是玻璃容器、塑料薄膜袋等，设施简单，投资较小，存在的问题主要是培养时间长(一般要4-7天)、生产效率低、培养液含菌量较小(一般只能到30亿个/mL)，容易染菌，产品质量不稳定。虽然已经有人进行了用通气式发酵培养光合细菌的试验，但由于培养基配方、培养工艺条件等技术不够完善的原因，仍难于使光合细菌制剂生产的标准化、规模化和产业化。

发明内容：

本发明的目的是提供了一种应用通气式发酵培养光合细菌以制备光合细菌制剂的新工艺，克服了现有技术的不足之处，以期实现光合细菌制剂生产的标准化、规模化和产业化。

本发明是通过以下技术方案实现的：

采用沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)作为出发菌种，该菌种是红假单胞菌属的沼泽红假单胞菌，为杆状、光能异养菌，革蓝氏阴性，这种细菌在文献中已公开记载(1.顾祖宜，戚蓓静，翁稣颖.沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)的分离与鉴定.华东师范大学学报(自然科学版)，1982，(4)：77-84；2.郭庆文，吉海平.紫色非硫光合细菌的研究.饲料工业，1994，15(3)：36-39；3祝国琴，姜静颖，刘卫，等.高活性光合细菌的分离培养及应用.水产科学，1994，13(1)：6-9.)。申请号为200410026930.0，名称为“一种用于控制河道底泥二次污染的固定化复合菌剂的制备方法”也公开记载了该细菌。上述微生物菌种在国内许多微生物保藏机构有保藏并出售(例如广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心GIMCC)，可通过市购获得，并且该微生物菌种本发明人也持有，保证可以在本发明申请日起的20年内提供。

本发明用沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)菌种按以下步骤进行培养：

(1)斜面种子活化培养：将沼泽红假单胞菌菌种接种到斜面固体培养基上进行活化；

(2)摇床种子培养：将活化的菌种接种到液体培养基中，温度32℃～34℃，培养为36～48小时，获得种子培养液；

(3)通气发酵罐培养：将含菌量为6亿～10亿个/ml的种子培养液，按质量分数10％～12％的接种量接入含有液体培养基的通气发酵罐中培养，在黑暗条件下，温度32℃～34℃，溶解氧1.0～2.0mg/l，培养36～48小时，即得光合细菌制剂。

所述的摇床种子培养和通气发酵罐培养使用的液体培养基的配方按质量分数计为：葡萄糖0.9％～1.1％、脲0.04％～0.06％、磷酸氢二钾(K₂HPO₄)0.02％～0.03％、磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.02％～0.03％、硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.02％～0.03％、氯化钠(NaCl)0.20％～0.30％、氯化钙(CaCl₂)0.03％～0.05％、水98.40％～98.77％，然后以上述培养基的总质量为基准添加黄腐酸0.10％～0.30％。

斜面种子活化培养所使用的培养基是在摇床种子培养和通气发酵罐培养使用的液体培养基中加入常量的琼脂后而形成的固体培养基。

本发明的有益效果如下：

(1)本发明采用优化的培养基配方，较廉价的黄腐酸作为光合细菌促生长剂，并采用合理的通气搅拌条件，与厌氧光照培养相比，缩短了生产时间，只需36～48小时就可获得40～60亿个/ml的光合细菌沼泽红假单胞菌制剂，提高了生长效率，降低了生产成本。

(2)本发明采用通气式发酵罐培养获得高浓度光合细菌沼泽红假单胞菌，提高沼泽红假单胞菌制剂生产效率、产品质量及稳定性，有助于光合细菌制剂生产的标准化和规模化。

本方法培养的光合细菌制剂可用于水产养殖、废水处理、种植业等多个领域。

具体实施方式：

实施例1：

培养基的配制：

按照下述成份和配比(质量比)制备摇床培养和通气发酵罐培养好氧培养的培养基：

葡萄糖0.9％，脲0.04％，磷酸氢二钾(K₂HPO₄)0.02％，磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.02％，硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.02％，氯化钠(NaCl)0.20％，氯化钙(CaCl₂)0.03％，水98.77％。然后以上述培养基的总重量为基准，添加黄腐酸0.20％。

用于斜面种子培养的培养基，是在摇床培养和通气发酵罐培养基的基础上，添加1.5％琼脂(质量比)，制作成的固体培养基。

所有培养基经过灭菌处理。

制备工艺过程：

将沼泽红假单胞菌菌种接种到斜面固体培养基上进行活化，斜面培养温度33℃，培养48小时，得到斜面种子，将经活化的斜面种子接入已灭菌处理的含有培养基的三角瓶中，在摇床上培养，培养温度33℃，培养48小时，得到种子培养液。然后将含菌量为6亿个/ml种子培养液接种到10L的通气发酵罐培养，接种量12％，在黑暗条件下，温度33℃，控制罐中溶解氧1.5mg/L，培养48小时，获得菌液浓度为50亿个/ml的光合细菌制剂。

实施例2：

培养基的配制：

按照下述成份和配比(质量比)制备摇床培养和通气发酵罐培养好氧培养的培养基：

葡萄糖1.0％，脲0.06％，磷酸氢二钾(K₂HPO₄)0.025％，磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.025％，硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.025％，氯化钠(NaCl)0.25％，氯化钙(CaCl₂)0.03％，水98.58％。以上述培养基的总重量为基准，添加黄腐酸0.10％黄腐酸。

用于斜面种子培养的培养基，是在摇床培养和通气发酵罐培养基的基础上，添加1.5％琼脂(重量比)，制作成斜面培养的固体培养基。

所有培养基经过灭菌处理。

制备工艺工程：

将沼泽红假单胞菌菌种接种到斜面固体培养基上进行活化，斜面培养温度34℃，培养48小时，得到斜面种子，将经活化的斜面种子接入已灭菌处理的含有液体培养基的三角瓶中，在摇床上培养，黑暗条件下，培养温度34℃，培养48小时，得到种子培养液，然后将含菌量为8亿个/ml接种到10L的含有液体培养基的通气发酵罐培养，接种量10％，黑暗条件下，温度34℃，控制罐中溶解氧1.0mg/l，培养时间36小时，获得菌液浓度为42亿个/ml的光合细菌制剂。

实施例3：

培养基的配制：

按照下述成份和配比(质量比)制备摇床培养和通气发酵罐培养好氧培养的培养基：

葡萄糖1.1％，脲0.06％，磷酸氢二钾(K₂HPO₄)0.03％，磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.03％，硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.03％，氯化钠(NaCl)0.3％，氯化钙(CaCl₂)0.05％，水98.40％。以上述培养基的重量为基准，添加黄腐酸0.30％(重量比)作为促生长剂。

用于斜面种子培养的培养基，是在摇床培养和通气发酵罐培养基的基础上，添加1.5％琼脂(重量比)，制作成斜面培养的固体培养基。

所有培养基经过灭菌处理。

制备工艺过程：

将沼泽红假单胞菌菌种接种到斜面固体培养基上进行活化，斜面培养温度32℃，培养48小时，得到斜面种子，将经活化的斜面种子接入已灭菌处理的含有液体培养基的三角瓶中，在摇床上培养，黑暗条件下，培养温度32℃，培养48小时，得到种子培养夜，然后将含菌量为10亿个/ml种子培养夜接种到10L的含有液体培养基的通气发酵罐中培养，接种量12％，温度32℃，控制罐中溶解氧2.0mg/l，培养48小时，获得菌液浓度为60亿个/ml的光合细菌制剂。

Claims (1)

1、一种光合细菌制剂的制备工艺，其特征在于：

采用沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)菌种按以下步骤进行培养：

(1)斜面种子活化培养：将沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)菌种接种到斜面固体培养基上进行活化；

(2)摇床种子培养：将活化的菌种接种到液体培养基中，温度32℃～34℃，培养36～48小时，获得种子培养液；

(3)通气发酵罐培养：将含菌量为6亿～10亿个/毫升的种子培养液，按质量分数10％～12％的接种量接入含有液体培养基的通气发酵罐中培养，在黑暗条件下，温度32℃～34℃，溶解氧1.0～2.0mg/L，培养36～48小时，即得光合细菌制剂；

所述的摇床种子培养和通气发酵罐培养使用的液体培养基的配方按质量分数计为：葡萄糖0.9％～1.1％、脲0.04％～0.06％、磷酸氢二钾(K₂HPO₄)0.02％～0.03％、磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.02％～0.03％、硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.02％～0.03％、氯化钠(NaCl)0.20％～0.30％、氯化钙(CaCl₂)0.03％～0.05％、水98.40％～98.77％，然后以上述培养基的总质量为基准添加黄腐酸0.10％～0.30％；

斜面种子活化培养所使用的培养基是在摇床种子培养和通气发酵罐培养使用的液体培养基中加入常量的琼脂后而形成的固体培养基。