CN104651281A - 一种改善水生动物产量和/或质量的光合细菌的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种改善水生动物产量和/或质量的光合细菌的制备方法，具体是一种足以控制、减少或消除水体硫化氢的光合细菌制剂的制备方法。采用紫硫光合细菌中的沙氏外硫红螺菌经种子活化培养，种子培养，厌氧发酵罐光照培养等培养步骤，得到高浓度光合细菌制剂，该光合细菌制剂可以在水生和海生环境中高效降解水体中硫化氢，从而减少或消除水体硫化氢以提高水生和海生动物的产量和/或质量。

Description

一种改善水生动物产量和/或质量的光合细菌的制备方法
技术领域
本发明属于一种功能性微生物制剂技术范围，具体的说是涉及到一种改善水生动物产量和/或质量的光合细菌的制备方法。
背景技术
许多水生和海生的环境，诸如鱼场，水池，池塘，湖泊，河口湾以及海洋在水柱中含有一个或者多处好氧区以及一个或多个厌氧区。在靠近水柱表面的有氧区，空气和风引入氧气，而好氧细菌产生磷酸盐，二氧化碳和氨气等。在靠近水柱底部的厌氧区，厌氧微生物倾向于产生硫化氢，氨气和甲烷等。在厌氧区及其下沉积物中硫化氢的积聚是有毒的和不受欢迎的，因为它们给水生和海生动物群体带来压力。在某些情况下，比如在商业化的鱼塘和虾塘中，群体生活在水体底部或者靠近水体底部的地方，处于厌氧区之中或者接近该区，硫化氢的积聚会减少该群体的产量和/或其个体的质量。
在本领域中对于与厌氧区相关的问题已知若干解决方法。例如，可将化学氧化剂，诸如臭氧、二氧化氯、各过氧化氢、过氧化钙或过氧化镁，添加入水体中以缓解厌氧的状况，尽管这些方法可能有效，但是它们可能是昂贵的，迫使使用者尽可能减少添加入水体的氧化剂的量。这种对节约的需要，若导致剂量不足，则可能是有害的。剂量不足会带来问题，因为它会造成不充分氧化或部分氧化，产生气味问题。当将二氧化氯添加至有机酸时，不充分氧化会导致氯乙酸的生成，氯乙酸在非常低的浓度下有可察觉的恶臭。然而这些步骤是设计有来消除气味的，而可能对环境中的水生和海生动物（如鱼或虾）有害。
其他已知的控制硫化氢的方法包括用硫氧化细菌来处理，如专利200880020095.6公开了一种降硫化氢的硫氧化学细菌，副球菌属中泛养副球菌，能降解水体中的硫化氢，以改善水生或海生动物的产量与质量，但没有公开其具体的制备方法。而光合细菌中的紫色硫细菌也是一类具有较强降解硫化氢能力的硫氧化细菌，国内对紫色硫细菌的研究仅见于少数几篇文献，对光合细菌在水处理的研究也主要侧重于氨氮和COD，而对于硫化物处理方面的研究较少，紫色非硫细菌对硫化物利用的能力很差，只有当硫化物的浓度保持在较低水平时，硫化物才能较好的抑制，而紫色硫细菌对硫化物具有较高的耐受性，能在厌氧条件下以硫化氢等无机物作电子供体还原二氧化碳，合成有机物从而起到去除硫化物的作用。
沙氏外硫红螺菌，专性自养菌，厌氧菌，相对地耐氧，在空气中驯化可生长，单个细胞无色，细胞悬液的颜色最初呈显黄色到橙棕色，后来为棕红色到粉红色。PH最适范围：8-8.5，最适生长温度30-35℃；沙氏外硫红螺菌有较大的适应范围，10-40℃、500-6000lux和PH7-9.5，均能适应生长，在微好氧黑暗状态下也能生存，条件不适时，该菌的生长处于抑制状态，一旦条件允许，又能继续生长。光合电子供体：硫化物，硫、硫代硫酸盐，分子氢、醋酸盐、丁酸盐、丙酸盐、苹果酸盐、乳酸盐。能进行同化型的硫酸盐还原作用。氮源：铵盐、谷氨酸盐、天门冬氨酸盐。在有硫化氢时，能进行光合作用，其时他们产生元素硫，作为中间氧化物，并呈球状沉积于细胞外的培养基中。其具有较强的降解硫化氢的能力。而到目前为止，还未见有关沙氏外硫红螺菌制备方法技术方案公开。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种沙氏外硫红螺菌生长速度快，菌体含量高，培养时间短，能快速降低水体硫化氢从而改善水生动物产量或质量的光合细菌制剂的制备方法。
本发明所采用的技术方案是：采用光合细菌中的外硫红螺菌属的沙氏外硫红螺菌菌种按以下步骤进行培养：
、双层平板种子活化培养：将沙氏外硫红螺菌菌种在下层固体光合细菌培养基中划线后，再在上面倒一层琼脂培养基，25-35℃光照培养4-5天，待划线的菌落变红并长出菌苔，即可为活化的菌种；
、种子培养：将活化的菌种接种至种子液体培养基中，温度30-35℃，光照强度为：1000-5000lux，光照厌氧培养6-10天，检测种子的OD660≥1.5，即为种子培养液；
、发酵培养：将种子培养液与发酵培养基以1：4-1：5的接种量接种，在光照培养罐中厌氧培养5-7天，培养温度30-35℃，光照强度为：1000-6000lux，搅拌速度为100转/分钟，待检测其OD660≥3，活菌数≥20亿cfu/ml即可放罐，灌装，包装成品。
其中，所述的下层固体光合细菌培养基为：氯化铵0.4-0.8g/L，谷氨酸钠0.2-0.8g/L，磷酸二氢钾0.5-1g/L，氯化镁0.1-0.5g/L，醋酸钠1-2 g/L，丙酸钠 0.5-1 g/L，苹果酸钠0.5-1.5g/L，微量元素1-5ml,九水硫化钠0.1-1g/L，琼脂8-10g/L， 115℃灭菌30分钟，用醋酸调PH至8.0-8.2,其中九水硫化钠先配制成0.1g/mL单独灭菌；
其中，所述的上层琼脂培养基为：琼脂20克，水1L，115℃灭菌30分钟；
其中，所述的种子液体培养基为：氯化铵0.4-0.8g/L，谷氨酸钠0.2-0.8g/L，磷酸二氢钾0.5-1g/L，氯化镁0.1-0.5g/L，醋酸钠1-2 g/L，丙酸钠0.5-1.5g/L，微量元素1-5ml,九水硫化钠0.1-1g/L，用醋酸调PH至8.0-8.2,其中九水硫化钠先配制成0.1g/mL单独灭菌；
其中，所述的发酵培养基：氯化铵0.95g/L，谷氨酸钠0.3g/L，磷酸二氢钾0.8g/L，氯化镁0.4g/L，醋酸钠6 g/L，乳酸钠2g/L，硫代硫酸钠2g/L,氯化钠1 g/L,酵母膏0.2g/L微量元素1mL,115℃灭菌30分钟， 用灭菌的乳酸调PH至7.5-8.0
其中，所述的微量元素组成为：EDTA二钠0.14g，硫酸亚铁0.5g，浓硫酸0.05ml，硫酸锌10mg，氯化锰3mg，硼酸30mg，氯化钴20mg，氯化铜1mg，氯化镍2mg，钼酸钠3mg，蒸馏水1000毫升，PH3-4，121℃灭菌15分钟。
本光合细菌制剂含有的沙氏外硫红螺菌，专性自养菌，厌氧菌，相对地耐氧，在空气中驯化可生长，单个细胞无色，细胞悬液的颜色最初呈显黄色到橙棕色，后来为棕红色到粉红色。PH最适范围：8-8.5，最适生长温度30-35℃；沙氏外硫红螺菌也有较大的适应范围，10-40℃、500-6000lux和PH7-9.5，均能适应生长，在微好氧黑暗状态下也能生存，条件不适时，该菌的生长处于抑制状态，一旦条件允许，又能继续生长。光合电子供体：硫化物，硫、硫代硫酸盐，分子氢、醋酸盐、丁酸盐、丙酸盐、苹果酸盐、乳酸盐。能进行同化型的硫酸盐还原作用。氮源：铵盐、谷氨酸盐、天门冬氨酸盐。在有硫化氢时，能进行光合作用，其时他们产生元素硫，作为中间氧化物，并呈球状沉积于细胞外的培养基中。其具有较强的降解硫化氢的能力。
本发明的紫硫光合细菌—沙氏外硫红螺菌是从湖南50多处池塘底泥，河涌底泥，猪粪水处理池，污水处理厂，光合细菌样品，垃圾处理滤池中分离得到的200多株光合细菌中筛选出来的，沙氏外硫红螺菌对硫化氢降解效率明显，0.4克/升的硫化氢含量经过48小时后即可全部降解，具有较强的COD，氨氮降解能力。该光合细菌制剂的各级培养基是经过多年的优化试验得到的，特别是其发酵培养基，是考察了沙氏外硫红螺菌相关的20多种光合细菌培养基成份中筛选出来的，并充分考虑到了各个培养基成份相互影响，采用正交试验进行多次优化培养基与培养条件，优化后培养总菌数超过20亿/毫升。
采用上述技术方案的有益效果：本发明沙氏外硫红螺菌种子培养基采用的双层平板进行活化以及下层固体培养基中含硫化钠，能尽快使其形成无氧环境，从而能够快速促进沙氏外硫红螺菌的生长，而发酵培养基中用硫代硫酸钠代替硫化物，以减少光合菌液中的硫化物带入到水体中而加重硫化氢对水产动物的毒性。
本发明对培养沙氏外硫红螺菌的培养基配方与培养条件进行多次优化，大大缩短了了培养时间，只需发酵4-6天即可获得20亿/毫升以上的光合细菌制剂，提高了生产效率，降低了生产成本。
本光合细菌制剂泼到水池以后，利用光能，吸收CO2，氨态氮，硫化氢，低分子有机物大量繁殖，从而体现出它在水产养殖中的作用。
下面结合试验说明本发明光合菌制剂净化水质的效果
一、净化水质、降解硫化氢，增加溶氧、提高养殖密度
1、试验地点：广州市番禺区海鸥岛；养殖品种：南美白对虾；面积：十二亩； 养殖类型：土塘混养； 放养天数： 60天；
2、问题描述：虾吃料慢，有偷死，虾有红体，PH8.5，溶氧3.5mg/L,氨氮1.2mg/L,亚硝酸盐0.4mg/L，硫化氢0.25mg/L；
3、问题分析：水老化，溶氧低，氨氮，亚硝酸盐，硫化氢，都超标，严重影响对虾的生存，易引起应激，但全池增氧机都已经打开，施入增氧剂效果也不明显；
4、解决方法：每亩使用本复合光合菌制剂2000ml；
5、结果：本复合光光合细菌制剂使用后，24小时后，偷死明显减少，水质指标为：PH8.5，溶氧4.0mg/L,氨氮0.8mg/L,亚硝酸盐0.2mg/L，硫化氢0.05mg/L；48小时后，虾体色变好，水质指标为：PH8.4，溶氧4.4mg/L,氨氮0.5mg/L,亚硝酸盐0.1mg/L，硫化氢0mg/L；第三天后，水质正常，虾体色恢复，无偷死,水色呈黄绿色；从试验结果可以看出，本光合细菌具有较好的净化水质、降解硫化氢，增加溶氧、提高养殖密度的能力。
二、营养丰富，增重促长，增强免疫，防治病害，提高鱼类成活率
 1、试验地点：湖南省常德市某草鱼苗场；养殖品种：草鱼；面积：两个两亩池塘；
2、试验方法：以30万水花/亩的放养量，试验塘每天拌喂8L本复合光合菌制剂，其它与对照组相同操作；
3、结果：试验塘的浮游动物明显较对照塘多，水色一直维持在黄绿色，试验组成活率达到86%，而对照组只有56%。拌喂光合细菌的试验组的成活率显著高于对照组。
具体实施方式
本发明实质性特点可从下述实施例中得以体现，但这些实施例仅作为说明，而不是对本发明进行限制。
实例1
一种改善水生动物产量和/或质量的光合细菌的制备方法，采用光合细菌中的外硫红螺菌属的沙氏外硫红螺菌菌种按以下步骤进行培养：
、双层平板种子活化培养：将沙氏外硫红螺菌菌种在下层固体光合细菌培养基中划线后，再在上面倒一层琼脂培养基，30℃光照培养5天，待划线的菌落变红并长出菌苔，即可为活化的菌种；
、种子培养：将活化的菌种接种至种子液体培养基中，温度30℃，光照强度为：3000lux，光照厌氧培养7天，检测种子的OD660为1.8，即为种子培养液；
、发酵培养：将种子培养液与发酵培养基以1：4的接种量接种，在光照培养罐中厌氧培养6天，培养温度30℃，光照强度为：3000lux，搅拌速度为100转/分钟，检测其OD660为3.5，活菌数为24亿cfu/ml，放罐，灌装，包装成品；
其中，所述的下层固体光合细菌培养基为：氯化铵0.6g/L，谷氨酸钠0.4g/L，磷酸二氢钾0.6g/L，氯化镁0.2g/L，醋酸钠2 g/L，丙酸钠 0.8 g/L，苹果酸钠0.8g/L，微量元素2ml,九水硫化钠0.5g/L，琼脂9g/L， 115℃灭菌30分钟，用醋酸调PH至8.0-8.2,其中九水硫化钠先配制成0.1g/mL单独灭菌；
其中，所述的上层琼脂培养基为：琼脂20克，水1L，115℃灭菌30分钟；
其中，所述的种子液体培养基为：氯化铵0.6g/L，谷氨酸钠0.4g/L，磷酸二氢钾0.6g/L，氯化镁0.3g/L，醋酸钠2 g/L，丙酸钠0.8g/L，微量元素1ml,九水硫化钠0.2g/L，用醋酸调PH至8.0-8.2,其中九水硫化钠先配制成0.1g/mL单独灭菌；
其中，所述的发酵培养基：氯化铵0.95g/L，谷氨酸钠0.3g/L，磷酸二氢钾0.8g/L，氯化镁0.4g/L，醋酸钠6 g/L，乳酸钠2g/L，硫代硫酸钠2g/L,氯化钠1 g/L,酵母膏0.2g/L微量元素1mL,115℃灭菌30分钟， 用灭菌的乳酸调PH至7.5-8.0；
其中，所述的微量元素组成为：EDTA二钠0.14g，硫酸亚铁0.5g，浓硫酸0.05ml，硫酸锌10mg，氯化锰3mg，硼酸30mg，氯化钴20mg，氯化铜1mg，氯化镍2mg，钼酸钠3mg，蒸馏水1000毫升，PH3-4，121℃灭菌15分钟。
实例2
一种改善水生动物产量和/或质量的光合细菌的制备方法，采用光合细菌中的外硫红螺菌属的沙氏外硫红螺菌菌种按以下步骤进行培养：
、双层平板种子活化培养：将沙氏外硫红螺菌菌种在下层固体光合细菌培养基中划线后，再在上面倒一层琼脂培养基，30℃光照培养5天，待划线的菌落变红并长出菌苔，即可为活化的菌种；
、种子培养：将活化的菌种接种至种子液体培养基中，温度30℃，光照强度为：3000lux，光照厌氧培养9天，检测种子的OD660为2.1，即为种子培养液；
、发酵培养：将种子培养液与发酵培养基以1：5的接种量接种，在光照培养罐中厌氧培养6天，培养温度30℃，光照强度为：3000lux，搅拌速度为100转/分钟，检测其OD660为3.6，活菌数为25亿cfu/ml，放罐，灌装，包装成品；
其中，所述的下层固体光合细菌培养基为：氯化铵0.6g/L，谷氨酸钠0.4g/L，磷酸二氢钾0.6g/L，氯化镁0.2g/L，醋酸钠2 g/L，丙酸钠 0.8 g/L，苹果酸钠0.8g/L，微量元素2ml,九水硫化钠0.5g/L，琼脂9g/L， 115℃灭菌30分钟，用醋酸调PH至8.0-8.2,其中九水硫化钠先配制成0.1g/mL单独灭菌；
其中，所述的上层琼脂培养基为：琼脂20克，水1L，115℃灭菌30分钟；
其中，所述的种子液体培养基为：氯化铵0.8g/L，谷氨酸钠0.4g/L，磷酸二氢钾0.6g/L，氯化镁0.3g/L，醋酸钠2 g/L，丙酸钠0.8g/L，微量元素1ml,九水硫化钠0.2g/L，用醋酸调PH至8.0-8.2,其中九水硫化钠先配制成0.1g/mL单独灭菌；
其中，所述的发酵培养基：氯化铵0.95g/L，谷氨酸钠0.3g/L，磷酸二氢钾0.8g/L，氯化镁0.4g/L，醋酸钠6 g/L，乳酸钠2g/L，硫代硫酸钠2g/L,氯化钠1 g/L,酵母膏0.2g/L微量元素1mL,115℃灭菌30分钟， 用灭菌的乳酸调PH至7.5-8.0
其中，所述的微量元素组成为：EDTA二钠0.14g，硫酸亚铁0.5g，浓硫酸0.05ml，硫酸锌10mg，氯化锰3mg，硼酸30mg，氯化钴20mg，氯化铜1mg，氯化镍2mg，钼酸钠3mg，蒸馏水1000毫升，PH3-4，121℃灭菌15分钟。

Claims (6)

1.一种改善水生动物产量和/或质量的光合细菌的制备方法，其特征在于：
采用光合细菌中的外硫红螺菌属的沙氏外硫红螺菌菌种按以下步骤进行培养：
、双层平板种子活化培养：将沙氏外硫红螺菌菌种在下层固体光合细菌培养基中划线后，再在上面倒一层琼脂培养基，25-35℃光照培养4-5天，待划线的菌落变红并长出菌苔，即可为活化的菌种；
、种子培养：将活化的菌种接种至种子液体培养基中，温度30-35℃，光照强度为：1000-5000lux，光照厌氧培养6-10天，检测种子的OD660≥1.5，即为种子培养液；
、发酵培养：将种子培养液与发酵培养基以1：4-1：5的接种量接种，在光照培养罐中厌氧培养5-7天，培养温度30-35℃，光照强度为：1000-6000lux，搅拌速度为100转/分钟，待检测其OD660≥3，活菌数≥20亿cfu/ml即可放罐，灌装，包装成品。
2.根据权利要求1所述的一种改善水生动物产量和/或质量的光合细菌的制备方法，其特征在于所述的下层固体光合细菌培养基为：氯化铵0.4-0.8g/L，谷氨酸钠0.2-0.8g/L，磷酸二氢钾0.5-1g/L，氯化镁0.1-0.5g/L，醋酸钠1-2 g/L，丙酸钠 0.5-1 g/L，苹果酸钠0.5-1.5g/L，微量元素1-5ml,九水硫化钠0.1-1g/L，琼脂8-10g/L， 115℃灭菌30分钟，用醋酸调PH至8.0-8.2,其中九水硫化钠先配制成0.1g/mL单独灭菌。
3.根据权利要求1所述的一种改善水生动物产量和/或质量的光合细菌的制备方法，其特征在于所述的上层琼脂培养基为：琼脂20克，水1L，115℃灭菌30分钟。
4.根据权利要求1所述的一种改善水生动物产量和/或质量的光合细菌的制备方法，其特征在于所述的种子液体培养基为：氯化铵0.4-0.8g/L，谷氨酸钠0.2-0.8g/L，磷酸二氢钾0.5-1g/L，氯化镁0.1-0.5g/L，醋酸钠1-2 g/L，丙酸钠0.5-1.5g/L，微量元素1-5ml,九水硫化钠0.1-1g/L，用醋酸调PH至8.0-8.2,其中九水硫化钠先配制成0.1g/mL单独灭菌。
5.根据权利要求1所述的一种改善水生动物产量和/或质量的光合细菌的制备方法，其特征在于所述的发酵培养基：氯化铵0.95g/L，谷氨酸钠0.3g/L，磷酸二氢钾0.8g/L，氯化镁0.4g/L，醋酸钠6 g/L，乳酸钠2g/L，硫代硫酸钠2g/L,氯化钠1 g/L,酵母膏0.2g/L微量元素1mL,115℃灭菌30分钟， 用灭菌的乳酸调PH至7.5-8.0。
6.根据权利要求1所述的一种改善水生动物产量和/或质量的光合细菌的制备方法，其特征在于所述的微量元素组成为：EDTA二钠0.14g，硫酸亚铁0.5g，浓硫酸0.05ml，硫酸锌10mg，氯化锰3mg，硼酸30mg，氯化钴20mg，氯化铜1mg，氯化镍2mg，钼酸钠3mg，蒸馏水1000毫升，PH3-4，121℃灭菌15分钟。
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