CN104651282B - 一种复合光合细菌制剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种复合光合细菌制剂的制备方法，主要是提供一种保存时间长，快速降解养殖水体中氨态氮，硫化氢等有害物质的复合光合细菌制剂的制备方法。采用紫硫光合细菌中的桃红荚硫菌与紫色非硫光合细菌中的万尼氏红微菌经种子活化培养，种子培养，厌氧发酵罐光照培养等培养步骤，得到桃红荚硫菌与万尼氏红微菌的高浓度复合光合细菌制剂，该复合光合细菌制剂可以在水生和海生环境中快速降解水体中氨态氮，硫化氢，从而送减少或消除水体氨态氮，硫化氢以提高水生和海生动物的产量和/或质量。
Description
技术领域
本发明属于一种功能性微生物制剂技术范围，具体的说是涉及到一种保存时间长，快速降解养殖水体中氨态氮，硫化氢等有害物质的复合光合细菌制剂的制备方法。
背景技术
许多水生和海生的环境，诸如鱼场，水池，池塘，湖泊，河口湾以及海洋在水柱中含有一个或者多处好氧区以及一个或多个厌氧区。在靠近水柱表面的有氧区，空气和风引入氧气，而好氧细菌产生磷酸盐，二氧化碳和氨气等。在靠近水柱底部的厌氧区，厌氧微生物倾向于产生硫化氢，氨气和甲烷等。在厌氧区及其下沉积物中硫化氢与氨态氮的积聚是有毒的和不受欢迎的，因为它们给水生和海生动物群体带来压力。在某些情况下，比如在商业化的鱼塘和虾塘中，群体生活在水体底部或者靠近水体底部的地方，处于厌氧区之中或者接近该区，硫化氢的积聚会减少应该群体的产量和/或其个体的质量。
在本领域中对于与厌氧区相关的问题已知若干解决方法。例如，可将化学氧化剂，诸如臭氧、二氧化氯、各过氧化氢、过氧化钙或过氧化镁，添加入水体中以缓解厌氧的状况，尽管这些方法可能有效，但是它们可能是昂贵的，迫使使用者尽可能减少添加入水体的氧化剂的量。这种对节约的需要若导致剂量不足，则可能是有害的。剂量不足会带来问题，因为它会造成不充分氧化或部分氧化，产生气味问题。当将二氧化氯添加至有机酸时，不充分氧化会导致氯乙酸的生成，氯乙酸在非常低的浓度下有可察觉的恶臭。然而这些步骤是设计有来消除气味的，而可能对环境中的水生和海生动物（如鱼或虾）有害。
其他已知的控制硫化氢的方法包括用硫氧化细菌来处理，如专利200880020095.6公开了一种降硫化氢的硫氧化学细菌，副球菌属中泛养副球菌，能降解水体中的硫化氢，以改善水生或海生动物的产量与质量，但没有公开其具体的制备方法。而光合细菌中的紫色硫细菌也是一类具有较强降解硫化氢与氨态氮能力的硫氧化细菌，但现如今光合细菌的研究和应用大部分集中在紫色非硫细菌上，如专利201110077489.9“一种高浓度光合细菌的简易培养方法”使用的菌种为沼泽红假单胞菌，专利号200810219265.5“一种光合细菌制剂的制备工艺”，使用的菌种为沼泽红假单胞菌进行通气培养；专利号200910039525.5“一种农用光合细菌制剂的生产方法”使用的菌种为沼泽红假单胞菌和球形红细菌。专利号201210255225.2“高活菌数光合细菌原代菌种的制种方法”使用的菌种为沼泽红假单胞菌。专利号200410048678.3“高浓度光合细菌制剂的制备方法”使用的菌种为沼泽红假单胞菌，荚膜红假单胞菌和球形红假单胞菌，而我们一般认为，沼泽红假单胞菌，荚膜红假单胞菌，球形红假单胞菌等紫色非硫光合细菌是具有较强降解氨态氮的能力，但不能直接利用硫化氢，且有些对硫化氢比较敏感，尽管李秀珠分离到一株紫色非硫光合细菌在对虾养殖中能对抑制硫化物的产生一定效果，但其分析认为池塘底质中乳酸，醋酸等几种短碳链挥发性脂肪酸是有助于硫酸盐还原菌生长的，由于光合细菌对这些脂肪酸的利用，可能对硫酸盐还原菌有抑制作用，从而可以抑制硫化氢的产生，并不能完全证明这些紫色非硫光合细菌能直接利用，氧化硫化氢。
国内对紫色硫细菌的研究仅见于少数几篇文献，对光合细菌在水处理的研究也主要侧重于氨氮和COD，而对于硫化物处理方面的研究较少，紫色非硫细菌对硫化物利用的能力很差，只有当硫化物的浓度保持在较低水平时，硫化物才能较好的抑制，而紫色硫细菌对硫化物具有较高的耐受性，能在厌氧条件下以硫化氢等无机物作电子供体还原二氧化碳，合成有机物从而起到去除硫化物的作用。
桃红荚硫菌：细胞球形，直径1.2-3微米，一般为1.5微米，单个细胞通常被一层粘的荚膜包住，常见有双球形聚合体，四联体和不规则的堆，它们通常被粘液层所包围。厌氧的光能自养菌：有果糖、甘油或有机酸时所有菌株都能在微好氧到好氧的黑暗条件下生长。光合电子供体：硫化物，硫代硫酸盐，硫和分子氢。可光合同化醋酸盐、果糖、延胡索酸盐、甘油、苹果酸盐、丙酮酸和琥珀酸盐。大多数菌株具有同化型硫酸盐还原作用。桃红荚硫菌生活在光线能及的滞水和污泥中，尤其是在含硫化物丰富的环境中。环境条件对桃红荚硫菌的影响较大，25-30℃、1000-3000lux或更强的光照，PH值7.0-7.5的厌氧环境最适合该菌的生长和氧化作用，在偏离最适条件下，桃红荚硫菌也有较大的适应范围，10-40℃、500-6000lux和PH5-9，均能适应生长，在微好氧黑暗状态下也能生存，条件不适时，该菌的生长处于抑制状态，一旦条件允许，又能继续生长。四川大学的冯甦对紫硫细菌中的桃红荚硫菌进行了研究，认为桃红荚硫菌适于应用到制作菌肥和处理含硫污染物方面。但要投入实际运用，还需注意以下几点：第一，桃红荚硫菌的生长速度缓慢，一般要培养两周以后才会有明显的生长趋势，较长的生长周期不利于大规模的应用；第二，桃红荚硫菌在纯培养情况下生长不如与其它菌株混合培养好。当培养物中同时存在其它种类的光合细菌，如紫色非硫细菌、绿硫细菌或其它菌种时，桃红荚硫菌生长要快得多，所以在生产上使用时，可考虑多种菌类混合培养与处理。而到目前为止，还未见有关桃红荚硫菌具体制备方法技术方案公开。
而且从现有文献上来看，大部份复合光合细菌只是对红螺菌科内的菌进行混合培养，还未有报道红螺菌科与着色菌科的菌之间进行混合培养。
另外，一般的光合细菌是营养态细胞，不易保存，一般常温下，最长保存时间为3-6个月，超过保存时间，存活率很少，这也是光合细菌在水产应用上一个大缺点。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种紫硫光合细菌中的桃红荚硫菌与紫色非硫细菌中的万尼氏红微菌混合培养，菌体生长速度快，菌体含量高，培养时间短，而且保存时间长，能快速降解水体硫化氢与氨态氮的复合光合细菌制剂的制备方法。
本发明所采用的技术方案是：采用紫硫光合细菌中的桃红荚硫菌菌种与紫色非硫光合细菌中的万尼氏红微菌按以下步骤进行培养：
、桃红荚硫菌半固体种子活化培养：将桃红荚硫菌种穿刺在半固体桃红荚硫菌培养基中，25-30℃光照培养7-10天，待穿刺的菌线变红并长出菌苔，即可为活化的桃红荚硫菌种；
、万尼氏红微菌平板活化：将万尼氏红微菌菌种在平板上划线活化，温度25-35℃活化培养3-5天，挑取大个菌落作为活化种子；
、桃红荚硫菌种子培养：将活化的菌种接种至桃红荚硫菌种子液体培养基中，温度25-35℃，光照强度为：1000-3000lux，光照厌氧培养7-10天，检测种子的OD650≥1.2，活菌数≥6亿cfu/ml即为种子培养液；
、万尼氏红微菌种子培养：将挑取大个万尼氏红微菌菌落作为活化种子接种到万尼氏红微菌种子培养基中，温度25-35℃，光照强度为：1000-3000lux，光照静置培养3-5天，检测种子的OD660≥1.2，活菌数≥8亿cfu/ml即为种子培养液；
、发酵培养：将桃红荚硫菌种子培养液与发酵培养基以1：3-1：5的接种量接种，同时将万尼氏红微菌种子培养液与发酵培养基按1：6-1：10的接种量接入，在光照培养罐中厌氧培养，培养温度25-35℃，光照强度为：1000-4000lux，搅拌速度为120转/分钟，待培养至第三天，开始流加300 g/L的硫代硫酸钠至硫代硫酸钠的浓度至1-3 g/L，继续培养4-5天，待检测其OD650≥7，活菌数≥60亿cfu/ml，其中桃红荚硫菌不低于25亿cfu/ml，万尼氏红微菌不低于30亿cfu/ml，即可放罐，灌装，包装成品。
所述的半固体桃红荚硫菌培养基为：硫酸铵0.8-2.0g/L，磷酸二氢钾0.5-1g/L，二水氯化钙0.05-0.2g/L，氯化镁0.1-0.5g/L，琥珀酸钠1-3 g/L,醋酸钠2-5g/L，九水硫化钠0.1-1g/L，琼脂8-10g/L，氯化钠0.5-4g/L, 121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2,其中九水硫化钠先配制成0.1g/mL单独灭菌；
所述的桃红荚硫菌种子液体培养基为：硫酸铵0.8-2.0g/L，磷酸二氢钾0.5-1g/L，二水氯化钙0.05-0.2g/L，氯化镁0.1-0.5g/L， 醋酸钠2-10 g/L, 琥珀酸钠1-3g/L，九水硫化钠0.1-1g/L，氯化钠0.5-4g/L,121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2,其中九水硫化钠先配制成0.1g/mL单独灭菌；
所述的万尼氏红微菌种子液体培养基为: 硫酸铵0.8-2.0g/L，磷酸二氢钾0.5-1g/L，二水氯化钙0.05-0.2g/L，氯化镁0.1-0.5g/L，醋酸钠2-10 g/L,琥珀酸钠1-3g/L，氯化钠1-2g/L, 121℃灭菌15分钟，用灭菌醋酸调PH至6.0-6.2；
所述的万尼氏红微菌平板固体培养基为种子液体培养基加入20 g/L的琼脂形成的；
所述的发酵培养基： 硫酸铵1.8g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，二水氯化钙0.1g/L，氯化镁0.2g/L，醋酸钠6 g/L，琥珀酸钠4g/L， 氯化钠2g/L,121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至6.2-6.4。
本复合光合细菌制剂含有紫色非硫细菌中的万尼氏红微菌。万尼氏红微菌：成熟细胞卵形到柠檬状，1-1.2×2-2.8微米，有些菌丝的细胞可长至4微米。年幼细胞球形，它们在宽约0.3微米，长为母细胞的一到几倍的丝状体，顶端的芽上长出。根据条件，成熟的芽可以保留在丝状体上，并在相反的一端形成另一个丝状体；也可以与丝状体分开，成为一个能运动，周生鞭毛的游动细胞。一个成熟细胞可以形成多至三个子细胞：一个是在细胞顶端初生丝状体上形成的，一个或二个以上的子细胞是着生在第一个子细胞的初生丝状体的侧生新丝状体上形成的。在一定条件（如高PH值）下，因为细胞趋向保留在丝状体上，以致主要的生长匀性是形成含量有许多细胞的聚合体。除正常的细胞之外，几个菌株可形成特征性的多角细胞，直径1-1.5微米并具有3-5个球面体；在一个丝状体末端的同一个分枝点上可有1-4个这样的芽状细胞，它们的抗热性，保存时间高于普通的营养细胞。
万尼氏红微菌是光能异养菌：兼性微好氧到好氧，有的菌株能在光下厌氧生长或在黑暗下微好氧到好氧生长。有分子氢进，光合自养生长。在含有简单有机底物和碳酸氢盐的矿物培养基中生长；不需要有机的生长因子。PH范围：5.2-8.0；最适PH6-7。最适生长温度28-32℃。光同化的有机底物：乙酸盐、丁醇、丁酸盐、已酸盐、乙醇、反丁烯二酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、丙醇、丙酸盐、琥珀酸盐和戊酸盐。不利用：柠檬酸盐，甲酸盐、果糖、葡萄糖、甘露糖、甘露醇、酒石酸盐，硫化物。万尼氏红微菌在对降解养鱼废水中的氨态氮，磷酸盐，COD有明显的作用。
而桃红荚硫菌为光能自养菌：有果糖、甘油或有机酸时所有菌株都能在微好氧到好氧的黑暗条件下生长。光合电子供体：硫化物，硫代硫酸盐，硫和分子氢。可光合同化醋酸盐、果糖、延胡索酸盐、甘油、苹果酸盐、丙酮酸和琥珀酸盐。大多数菌株具有同化型硫酸盐还原作用，具有较强的硫化氢的降解能力。
本发明的紫硫光合细菌--桃红荚硫菌是从全国各地300多处池塘底泥，河涌底泥，猪粪水处理池，污水处理厂，垃圾处理滤池中分离得到的1000多株光合细菌中筛选出来的，桃红荚硫菌对硫化氢降解效率明显，0.5克/升的硫化氢含量经过48小时后即可全部降解，该桃红荚硫菌由本人保藏在中国普通微生物菌种中心，编号为CGMCC NO.10344。保藏日期为2015年1月12日。万尼氏红微菌具有较强的COD，氨氮降解能力，能形成芽状态细胞，可以延长保存活性，且能够与该桃红荚硫菌共生共存，互相促进生长。该万尼氏红微菌从美国微生物菌种中心购置，编号为ATCC 17100。该复合光合细菌制剂的各级培养基是经过多年的优化试验得到的，特别是其发酵培养基，是考察了50多种光合细菌培养基成份中筛选出来的，并充分考虑到了各个培养基成份相互影响，采用正交试验进行多次优化培养基与培养条件，优化后培养总菌数超过60亿cfu/ml，桃红荚硫菌的浓度超过25亿cfu/ml，万尼氏红微菌浓度超过30亿cfu/ml，远远高于现有桃红荚硫菌与万尼氏红微菌的培养浓度。
采用上述技术方案的有益效果：本发明桃红荚硫菌种子培养基采用的半固体含硫化钠的培养基，不仅硫化钠可以消耗培养基中的残留氧气以致能尽快使期形成无氧环境，而且能够作为供氢体，快速促进桃红荚硫菌的生长，而发酵培养基中用硫代硫酸钠代替硫化钠，并以流加的方式加入，以减少光合菌液中的硫代硫酸钠对万尼氏红微菌的抑制作用。将两种菌种接入发酵培养基的后，前期由于发酵培养基的PH比较低，适合万尼氏红微菌的生长，万尼氏红微菌的前期延滞期短，能快速繁殖，经过两至三天的生长，菌含量已经达到较高浓度，同时由于碳源中的醋酸钠中的醋酸的利用，而使得培养液的PH上升到桃红荚硫菌最适范围，而同时桃红荚硫菌经过两至三天的延滞期，在万尼氏红微菌的刺激下，特别是流加入硫代硫代硫酸钠后，桃红荚硫菌也在后期快速繁殖起来。从而可达到两种菌体浓度较高的复合型的光合菌制剂。
另外，发酵培养基的主要碳源为醋酸钠与琥珀酸钠，在菌体生长的同时，发酵液的PH在缓慢升高，等到流加入硫代硫酸钠后，桃红荚硫菌快速繁殖起来后，PH会进一步升高，导致万尼氏红微菌大量形成芽状态细胞，从而能够延长复合光合菌制剂的保存时间。
本发明对培养桃红荚硫菌与万尼氏红微菌的混合培养的，菌种的配比，培养基配方与培养条件进行多次优化才能获得60亿cfu/ml以上的光合细菌桃红荚硫菌菌与万尼氏红微菌光合菌制剂，提高了生产效率，降低了生产成本。
本复合光合细菌制剂结合了万尼氏红微菌菌能快速繁殖，降解COD，利用氨态氮，低分子有机质与桃红荚硫菌具有超强的降解硫化氢的能力，在水产养殖中的作用原理及主要功能表现如下: 本复合光合细菌制剂泼到水池以后，利用光能，吸收CO2，氨态氮，硫化氢，低分子有机物大量繁殖，从而体现出它在水产养殖中的作用。
下面结合试验说明本发明复合光合菌制剂净化水质与延长保质期的效果。
一、净化水质、降解硫化氢，增加溶氧、提高养殖密度
1、试验地点：湛江市雷州市纪家镇；养殖品种：南美白对虾；面积：十亩； 养殖类型：土塘混养； 放养天数： 85天；
2、问题描述：虾吃料慢，偷死严重，虾有红体，PH8.0，溶氧3.6mg/L,氨氮1.0mg/L,亚硝酸盐0.4mg/L，硫化氢0.25mg/L；
3、问题分析：水老化，溶氧低，氨氮，亚硝酸盐，硫化氢，都超标，严重影响对虾的生存，易引起应激，但全池增氧机都已经打开，施入增氧剂效果也不明显；
4、解决方法：每亩使用本复合光合菌制剂2000ml；
5、结果：本复合光光合细菌制剂使用后，24小时后，偷死明显减少，水质指标为：PH8.0，溶氧4.1mg/L,氨氮0.6mg/L,亚硝酸盐0.1mg/L，硫化氢0.05mg/L；48小时后，虾体色变好，水质指标为：PH8.0，溶氧4.5mg/L,氨氮0.3mg/L,亚硝酸盐0.1mg/L，硫化氢0mg/L；第三天后，水质正常，虾体色恢复，无偷死,水色呈黄绿色；
分析：当前高密度水产养殖的水体中含有大量的鱼虾类粪便和残饵，以及渔药残留物，使微生物大量繁殖，消耗水中大量氧气，很容易在水体底部形成无氧环境，致使硫酸盐还原菌大量繁殖，产生有毒害作用的硫化氢，氨态氮等。而此复合光合细菌制剂正好适合在这种环境中生长，它能够有效地将氨态氮，硫化氢等有害物质吸收组成菌体本身，从而提高水体中溶有氧含量，调节PH，抑制其它病原菌的生长，并降低水体中的氨氮，亚硝酸态氨，硝酸态氮含量，有益于藻类、微生物数量的增加。大幅度降低水域中COD、BOD等污染指标，抑制蓝藻等有害藻类的过度繁殖，达到改善水质的目的，进而为水生生物(包括鱼类)创造良好的生态环境。
二、营养丰富，增重促长，增强免疫，防治病害，提高鱼类成活率
1、试验地点：广西壮族自治区钦州市某罗非鱼苗场；养殖品种：罗非鱼；面积：两个四亩池塘；
2、试验方法：以10万水花/亩的放养量，试验塘每天拌喂8L本复合光合菌制剂，其它与对照组相同操作；
3、结果：试验塘的浮游动物明显较对照塘多，水色一直维持在黄绿色，试验组成活率达到96%，而对照组只有67%；
4、分析：研究表明，光合细菌的菌体无毒，营养丰富，蛋白质含量高达64.1%-66%，脂肪7.18%，粗纤维2.78%，碳水化合物23.0%，灰分4.28%，每克干菌体相当于21KJ热量。不仅蛋白质丰富，而且氨基酸组成齐全，是水体中枝角类和轮虫等饵料生物最适宜的饵料之一。因此，光合细菌可直接或间接用作鱼、虾蟹类育苗中的初期饵料光合细菌含有多种鱼类所需的营养成份，还含有一些生理活性因子，可促进蛋白酶活性、有效地促进动物肠胃对营养成份的吸收。 增强免疫，防治病害，提高鱼类成活率。 一方面，光合细菌富含生物素，如维生素B12和辅酶Q10具有多种生理功能，可明显提高人和动物的免疫能力。光合细菌中的促免疫因子可使动物免疫球蛋白数量大幅度提高(可提高10倍以上)，强化其免疫功能提高抗病能力，减少疾病感染和蔓延机会例如虾烂尾、鲤鱼烂鳃病等。，大幅度提高成活率。另一方面，光合细菌是对鱼类有益的细菌，由于它的大量繁殖，使有益菌占优势，成为优势种群，抑制其他危害鱼类健康的有害菌的繁殖。因而若长期坚持使用，可大大减少鱼类细菌性疾病的发生，可不再施用其他抗菌性化学药物(如石灰、漂白物等)。外用内服都可对防治肠炎病、赤皮病、烂锶病、打印病、水霉病等有良好效果。网箱养鱼一般都采用拌饵内服。施用光合细菌的池塘，其放线菌/细菌的比例会明显增大，推测其原因认为是由于光合细菌促进了放线菌的生长，而放线菌抑制了病菌的活动,从而达到防病的目的，光合细菌在水中繁殖时，能释放出一种具有抗病性的酵素-胰凝乳蛋白分解酶，该酶能防止疾病的发生，由于光合细菌分泌大量的叶酸，长期使用光合细菌也可避免鱼类贫血症的发生. 用光合细菌预防鱼病，完成右克服消毒杀菌剂的缺点，它不仅可降解或清除水体中包括鱼药在内的有害化学物质，占绝对优势的光合细菌还可与病原微生物争夺营养、空间、使其无法形成致病的环境条件，不会对水体及养殖对象造成污染和伤害，在无公害水产养殖中具有极大的实用价值。
三、复合光合细菌菌剂保质期试验
将本复合光合细菌菌剂放在常温室内包装好后，每隔三个月检测一次活菌，结果为：初始菌数为55亿cfu/ml，三个月后总菌数为53亿cfu/ml，六个月后总菌数为50亿cfu/ml，九个月后总菌数为45亿cfu/ml，一年后总菌数为38亿cfu/ml，两年后总菌数为15亿cfu/ml。
具体实施方式
本发明实质性特点可从下述实施例中得以体现，但这些实施例仅作为说明，而不是对本发明进行限制。
实施例1
一种复合光合细菌制剂的制备方法，采用紫硫光合细菌中的桃红荚硫菌菌种与紫色非硫光合细菌中的万尼氏红微菌按以下步骤进行培养：
、桃红荚硫菌半固体种子活化培养：将桃红荚硫菌种穿刺在半固体桃红荚硫菌培养基中， 30℃光照培养8天，待穿刺的菌线变红并长出菌苔，即可为活化的桃红荚硫菌种；
、万尼氏红微菌平板活化：将万尼氏红微菌菌种在平板上划线活化，温度30℃活化培养4天，挑取大个菌落作为活化种子；
、桃红荚硫菌种子培养：将活化的菌种接种至桃红荚硫菌种子液体培养基中，温度30℃，光照强度为： 3000lux，光照厌氧培养8天，检测种子的OD650为1.4，活菌数为7亿cfu/ml即为种子培养液；
、万尼氏红微菌种子培养：将挑取大个万尼氏红微菌菌落作为活化种子接种到万尼氏红微菌种子培养基中，温度30℃，光照强度为： 3000lux，光照静置培养4天，检测种子的OD660为1.3，活菌数为8.6亿cfu/ml即为种子培养液；
、发酵培养：将桃红荚硫菌种子培养液与发酵培养基以1：4的接种量接种，同时将万尼氏红微菌种子培养液与发酵培养基按1：10的接种量接入，在光照培养罐中厌氧培养，培养温度30℃，光照强度为：3000lux，搅拌速度为120转/分钟，待培养至第三天，开始流加300 g/L的硫代硫酸钠至硫代硫酸钠的浓度至1.5 g/L，继续培养4天，待检测其OD650为7.4，活菌数为63亿cfu/ml，其中桃红荚硫菌为28亿cfu/ml，万尼氏红微菌为35亿cfu/ml，放罐，灌装，包装成品；
所述的半固体桃红荚硫菌培养基为：硫酸铵1g/L，磷酸二氢钾0.6g/L，二水氯化钙0.1g/L，氯化镁0.2g/L，琥珀酸钠2 g/L,醋酸钠3g/L，九水硫化钠0.5g/L，琼脂10g/L，氯化钠2g/L, 121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2,其中九水硫化钠先配制成0.1g/mL单独灭菌；
所述的桃红荚硫菌种子液体培养基为：硫酸铵1g/L，磷酸二氢钾0.6g/L，二水氯化钙0.1g/L，氯化镁0.2g/L， 醋酸钠4 g/L, 琥珀酸钠2g/L，九水硫化钠0.2g/L，氯化钠2g/L,121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2,其中九水硫化钠先配制成0.1g/mL单独灭菌；
所述的万尼氏红微菌种子液体培养基为: 硫酸铵1g/L，磷酸二氢钾0.6g/L，二水氯化钙0.1g/L，氯化镁0.3g/L，醋酸钠4 g/L,琥珀酸钠2g/L，氯化钠1g/L, 121℃灭菌15分钟，用灭菌醋酸调PH至6.0-6.2；
所述的万尼氏红微菌平板固体培养基为种子液体培养基加入20 g/L的琼脂形成的；
所述的发酵培养基： 硫酸铵1.8g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，二水氯化钙0.1g/L，氯化镁0.2g/L，醋酸钠6 g/L，琥珀酸钠4g/L， 氯化钠2g/L,121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至6.2-6.4。
实施例2
一种复合光合细菌制剂的制备方法，采用紫硫光合细菌中的桃红荚硫菌菌种与紫色非硫光合细菌中的万尼氏红微菌按以下步骤进行培养：
、桃红荚硫菌半固体种子活化培养：将桃红荚硫菌种穿刺在半固体桃红荚硫菌培养基中， 30℃光照培养10天，待穿刺的菌线变红并长出菌苔，即可为活化的桃红荚硫菌种；
、万尼氏红微菌平板活化：将万尼氏红微菌菌种在平板上划线活化，温度30℃活化培养4天，挑取大个菌落作为活化种子；
、桃红荚硫菌种子培养：将活化的菌种接种至桃红荚硫菌种子液体培养基中，温度30℃，光照强度为： 3000lux，光照厌氧培养10天，检测种子的OD650为1.6，活菌数为8亿cfu/ml即为种子培养液；
、万尼氏红微菌种子培养：将挑取大个万尼氏红微菌菌落作为活化种子接种到万尼氏红微菌种子培养基中，温度30℃，光照强度为： 3000lux，光照静置培养4天，检测种子的OD660为1.3，活菌数为8.5亿cfu/ml即为种子培养液；
、发酵培养：将桃红荚硫菌种子培养液与发酵培养基以1：5的接种量接种，同时将万尼氏红微菌种子培养液与发酵培养基按1：10的接种量接入，在光照培养罐中厌氧培养，培养温度30℃，光照强度为：3000lux，搅拌速度为120转/分钟，待培养至第三天，开始流加300 g/L的硫代硫酸钠至硫代硫酸钠的浓度至1.5 g/L，继续培养5天，待检测其OD650为7.6，活菌数为65亿cfu/ml，其中桃红荚硫菌为30亿cfu/ml，万尼氏红微菌为35亿cfu/ml，放罐，灌装，包装成品；
所述的半固体桃红荚硫菌培养基为：硫酸铵1g/L，磷酸二氢钾0.6g/L，二水氯化钙0.1g/L，氯化镁0.2g/L，琥珀酸钠2 g/L,醋酸钠3g/L，九水硫化钠0.5g/L，琼脂10g/L，氯化钠2g/L, 121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2,其中九水硫化钠先配制成0.1g/mL单独灭菌
所述的桃红荚硫菌种子液体培养基为：硫酸铵1g/L，磷酸二氢钾0.6g/L，二水氯化钙0.1g/L，氯化镁0.2g/L， 醋酸钠4 g/L, 琥珀酸钠3g/L，九水硫化钠0.2g/L，氯化钠2g/L,121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2,其中九水硫化钠先配制成0.1g/mL单独灭菌
所述的万尼氏红微菌种子液体培养基为: 硫酸铵1g/L，磷酸二氢钾0.6g/L，二水氯化钙0.1g/L，氯化镁0.3g/L，醋酸钠4 g/L,琥珀酸钠3g/L，氯化钠1g/L, 121℃灭菌15分钟，用灭菌醋酸调PH至6.0-6.2；
所述的万尼氏红微菌平板固体培养基为种子液体培养基加入20 g/L的琼脂形成的；
所述的发酵培养基： 硫酸铵1.8g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，二水氯化钙0.1g/L，氯化镁0.2g/L，醋酸钠6 g/L，琥珀酸钠4g/L， 氯化钠2g/L,121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至6.2-6.4。
Claims (1)
1.一种复合光合细菌制剂的制备方法，其特征在于：采用紫硫光合细菌中的桃红荚硫菌菌种与紫色非硫光合细菌中的万尼氏红微菌按以下步骤进行培养：
A、桃红荚硫菌半固体种子活化培养：将桃红荚硫菌种穿刺在半固体桃红荚硫菌培养基中，25-30℃光照培养 7-10 天，待穿刺的菌线变红并长出菌苔，即可为活化的桃红荚硫菌种；
B、万尼氏红微菌平板活化：将万尼氏红微菌菌种在平板上划线活化，温度 25-35℃活化培养 3-5 天，挑取大个菌落作为活化种子；
C、桃红荚硫菌种子培养：将活化的菌种接种至桃红荚硫菌种子液体培养基中，温度25-35℃，光照强度为：1000-3000lux，光照厌氧培养 7-10 天，检测种子的 OD650 ≥1.2，活菌数≥ 6亿 cfu/mL即为种子培养液；
D、万尼氏红微菌种子培养：将挑取大个万尼氏红微菌菌落作为活化种子接种到万尼氏红微菌种子培养基中，温度 25-35℃，光照强度为：1000-3000lux，光照静置培养 3-5 天，检测种子的 OD660 ≥1.2，活菌数≥8亿 cfu/mL即为种子培养液；
E、发酵培养：将桃红荚硫菌种子培养液与发酵培养基以 1 ：3-1 ：5 的接种量接种，同时将万尼氏红微菌种子培养液与发酵培养基按 1 ：6-1 ：10 的接种量接入，在光照培养罐中厌氧培养，培养温度 25-35℃，光照强度为：1000-4000lux，搅拌速度为 120 转/分钟，待培养至第三天，开始流加 300 g/L 的硫代硫酸钠至硫代硫酸钠的浓度至 1-3 g/L，继续培养 4-5天，待检测其OD650 ≥7，活菌数≥60亿cfu/mL，其中桃红荚硫菌不低于25亿cfu/mL，万尼氏红微菌不低于 30 亿 cfu/mL，即可放罐，灌装，包装成品；
所述的半固体桃红荚硫菌培养基为：硫酸铵 0.8-2.0g/L，磷酸二氢钾0.5-1g/L，二水氯化钙0.05-0.2g/L，氯化镁0.1-0.5g/L，琥珀酸钠1-3 g/L，醋酸钠2-5g/L，九水硫化钠0.1-1g/L，琼脂 8-10g/L，氯化钠 0.5-4g/L，121℃灭菌 15 分钟，用醋酸调 pH 至 7.0-7.2,其中九水硫化钠先配制成 0.1g/mL 单独灭菌；
所述的桃红荚硫菌种子液体培养基为：硫酸铵 0.8-2.0g/L，磷酸二氢钾 0.5-1g/L，二水氯化钙 0.05-0.2g/L，氯化镁 0.1-0.5g/L，醋酸钠 2-10 g/L，琥珀酸钠 1-3g/L，九水硫化钠 0.1-1g/L，氯化钠 0.5-4g/L，121℃灭菌 15 分钟，用醋酸调 pH 至 7.0-7.2，其中九水硫化钠先配制成 0.1g/mL 单独灭菌；
所述的万尼氏红微菌种子液体培养基为: 硫酸铵0.8-2.0g/L，磷酸二氢钾0.5-1g/L，二水氯化钙 0.05-0.2g/L，氯化镁 0.1-0.5g/L，醋酸钠 2-10 g/L，琥珀酸钠 1-3g/L，氯化钠 1-2g/L，121℃灭菌 15 分钟，用灭菌醋酸调 pH 至 6.0-6.2；
所述的万尼氏红微菌平板固体培养基为万尼氏红微菌种子液体培养基加入 20 g/L的琼脂形成的；
所述的发酵培养基：硫酸铵 1.8g/L，磷酸二氢钾 0.5g/L，二水氯化钙 0.1g/L，氯化镁0.2g/L，醋酸钠 6 g/L，琥珀酸钠 4g/L，氯化钠 2g/L，121℃灭菌 15 分钟，用醋酸调 pH至6.2-6.4；
所述桃红荚硫菌种保藏在中国普通微生物菌种中心，编号为 CGMCC NO.10344；
所述万尼氏红微菌种从美国微生物菌种中心购置，编号为 ATCC 17100。
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