CN105219680A - 一种光合细菌菌剂的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种光合细菌菌剂的制备方法，包括a）菌种活化，b）种子液制备和c）发酵培养，还公开了其应用于水产养殖水体施用以净化水质，本光合细菌菌剂在光合作用下，能够利用污水中的有机质作为营养物质迅速生长繁殖，而在连续光照作用下,光合作用消耗CO₂的速率远大于其呼吸作用产生CO₂的速率,导致CO₃ ^-2/？HCO₃ ^-值增大,因此pH值持续上升，而较高的pH值有利于降低系统中磷的可溶性和生物有效性，因此对有机物污染的水体中的氨氮及亚硝酸盐均具有良好的降解效果，对污水具有较强的净化效果，增加了水中的含氧量，在水产养殖中具有良好的水质调节作用。

Description

一种光合细菌菌剂的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于水体净化领域，具体涉及一种用于净化养殖水体水质的光合细菌菌剂的制备方法，以及这种细菌菌剂的应用。

背景技术

在集约化养殖水体中，水产动物放养密度高、投喂饵料量大，养殖水体中极易蓄积大量的残饵、动植物排泄物、死亡残体等含氮有机物。加之，未经处理的养殖废水和工业、生活污水被排放或被雨水冲刷进入养殖水体，导致养殖水体中氨氮和亚硝酸盐严重超标。高浓度的氨氮或亚硝酸盐易导致有害细菌和条件致病菌大量滋生，鱼、虾等养殖动物的体质下降，抗应激能力差，易受病原茵的侵袭，引起水产动物疾病的大面积爆发。

生物修复是国内外近10年发展起来的最新环境工程技术，已被成功地应用于土壤、城市河湖、地下水、近海洋面、农业、畜牧业等多个领域，并成为21世纪环境科技发展最快的高新技术领域之一。与传统掠夺式养殖模式不同，生物修复技术应用于水产养殖，并非通过大量使用高营养的饵料和抗生素提高养殖产量，而主要通过生物-生态措施，修复受损的池塘生态系统，加速生态系统的物质循环和能量循环，增加水体溶氧，改善水质和池塘自净能力，提高水产养殖的产量和品质。把生物修复技术应用到水产养殖环境修复中，对恢复和优化水产养殖环境，推动水产养殖业的可持续发展具有重大意义。

光合细菌（PhotosyntheticBacteria，PSB）是一类在厌氧条件下进行光合作用的细菌总称。在水产养殖业中，光合细菌可改善水质，稳定养殖环境，增进鱼虾的免疫力，预防疾病。同时，光合细菌的菌体蛋白质含量高达65%以上，各种维生素、辅酶等生物活性物质含量丰富，可以作为鱼虾的饵料及饵料添加剂。

随着微生物水处理技术的兴起和发展，开发和利用新型的光合细菌来解决池塘养殖水体在养殖中后期氨氮、亚硝酸盐升高的问题，已受到了人们的普遍关注。

发明内容

本发明为解决现有技术的不足，其主要发明目的是提供一种有效净化水体、增强水产对象抗病能力的光合细菌菌剂的制备方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种光合细菌菌剂的制备方法，包括以下步骤

a）、菌种活化采用硅胶塞封口的试管作为培养容器，加入液体活化培养基，其总体积占容器有效容积的70—80%，将在冷冻室中低温保存的光合细菌菌种接种于液体活化培养基中静置培养，接种量1毫升，培养温度30—35℃，培养时间5—7天，即得到光合细菌一级种子；

b）、种子液制备在无菌的操作台上，将光合细菌一级种子接种到250毫升液体种子培养基中，接种量为20—25毫升，拧紧瓶盖后放于自然光下培养，温度30—35℃，培养周期5—7天，得到光合细菌二级种子液；

c）、发酵培养向5升可密封的塑料桶中加入发酵培养基，按照20—50%比例接入光合细菌二级种子液，拧紧桶盖后露天放置，在光照下发酵，检测发酵液中菌体数量，待菌体数量达到100亿/毫升时即可停止发酵。

所述的一种光合细菌菌剂的制备方法，其步骤a）中液体活化培养基的pH值为7.2，含有以下重量百分比的物质：蛋白胨0.6%，柠檬酸钠0.6%，酵母浸粉0.2%，碳酸氢钠0.2%，氯化钠0.2%，氯化铵0.2%，七水硫酸镁0.2%，磷酸二氢钾0.2%和余量的水。

所述的一种光合细菌菌剂的制备方法，其步骤b）中液体种子培养基的pH值为7.2，含有以下重量百分比的物质：蛋白胨0.6%，柠檬酸钠0.6%，酵母浸粉0.2%，碳酸氢钠0.2%，氯化钠0.2%，氯化铵0.2%，七水硫酸镁0.2%，磷酸二氢钾0.2%和余量的水。

所述的一种光合细菌菌剂的制备方法，其步骤c）中发酵培养基含有以下重量百分比的物质：醋酸钠0.1%—0.2%，酵母膏0.1%，氯化铵0.1%，氯化钠0.01%，碳酸氢钠0.3%，七水硫酸镁0.04%，磷酸氢二钾0.6%，微量元素母液0.1%，水余量。

所述的一种光合细菌菌剂的制备方法，其微量元素母液含有以下重量百分比的物质：乙二胺四乙酸二钠0.25%，硫酸锌1.0%，硫酸镁0.2%，硫酸铜0.04%，氯化钴0.02%，硫酸亚铁0.7%，水余量。

所述的一种光合细菌菌剂的制备方法，其步骤c）中的发酵过程在室外自然光或室内钨丝灯光源下进行，每天摇动培养容器2—3次。

所述的一种光合细菌菌剂的制备方法，其步骤c）中菌体数量的检测采用双层琼脂检测法。

本发明的又一目的是提供一种上述光合细菌菌剂的应用。

主要用途：应用于水产养殖水体施用以净化水质；可针对水体污染、氨氮及亚硝酸盐含量过高的养殖水体，也可针对受污染的非养殖水体中使用；使用时按照0.5—1升/亩的用量直接撒入水中。

本发明的有益效果是：光合细菌菌剂在光合作用下，能够利用污水中的有机质作为营养物质迅速生长繁殖，而在连续光照作用下，光合作用消耗CO₂的速率远大于其呼吸作用产生CO₂的速率,导致CO₃ ^-2/HCO₃ ^-值增大，因此pH值持续上升，而较高的pH值有利于降低系统中磷的可溶性和生物有效性，因此对有机物污染的水体中的氨氮及亚硝酸盐均具有良好的降解效果，对污水具有较强的净化效果，增加了水中的含氧量，在水产养殖中具有良好的水质调节作用。

具体实施方式

本发明作为一种光合细菌菌剂，包含光合细菌菌体及发酵液，活性组分为光合细菌的一种或几种，有效活菌数不低于100亿/毫升，发酵成熟的菌剂为深红色菌剂，培养容器内壁有菌体附着。使用沼泽红假单孢菌作为菌种时，发酵时间为3—5天，有效活菌数达到100亿/毫升。

应用于水产养殖水体施用以净化水质时，可针对水体污染、氨氮及亚硝酸盐含量过高的养殖水体，也可针对受污染的非养殖水体中使用，使用时按照0.5—1升/亩的用量直接撒入水中。

制备方法如下：

a）、菌种活化

采用硅胶塞封口的试管作为培养容器，加入液体活化培养基，其总体积占容器有效容积的70—80%，将在冷冻室中低温保存的光合细菌菌种接种于液体活化培养基中静置培养，接种量1毫升，培养温度30—35℃，培养时间5—7天，即得到光合细菌一级种子。

液体活化培养基的pH值为7.2，含有以下重量百分比的物质：蛋白胨0.6%，柠檬酸钠0.6%，酵母浸粉0.2%，碳酸氢钠0.2%，氯化钠0.2%，氯化铵0.2%，七水硫酸镁0.2%，磷酸二氢钾0.2%，培养基基质为水，培养基在121℃条件下灭菌20min，然后降温再使用。

b）、种子液制备

在无菌的操作台上，将光合细菌一级种子接种到250毫升液体种子培养基中，接种量为20—25毫升，拧紧瓶盖后放于自然光下培养，温度30—35℃，培养周期5—7天，得到光合细菌二级种子液。

液体种子培养基的pH值为7.2，含有以下重量百分比的物质：蛋白胨0.6%，柠檬酸钠0.6%，酵母浸粉0.2%，碳酸氢钠0.2%，氯化钠0.2%，氯化铵0.2%，七水硫酸镁0.2%，磷酸二氢钾0.2%，培养基基质为水。

c）、发酵培养

向5升可密封的塑料桶中加入发酵培养基，按照20—50%比例接入光合细菌二级种子液，拧紧桶盖后露天放置，在在室外自然光或室内钨丝灯光源下进行发酵，每天摇动培养容器2—3次，采用双层琼脂检测法检测发酵液中菌体数量，待菌体数量达到100亿/毫升时即可停止发酵。发酵培养5—7天后形成深红色发酵液。

发酵培养基含有以下重量百分比的物质：醋酸钠0.1%—0.2%，酵母膏0.1%，氯化铵0.1%，氯化钠0.01%，碳酸氢钠0.3%，七水硫酸镁0.04%，磷酸氢二钾0.6%，微量元素母液0.1%，水余量。

其中，所述的微量元素母液为微量元素混合液，含有以下重量百分比的物质：乙二胺四乙酸二钠0.25%，硫酸锌1.0%，硫酸镁0.2%，硫酸铜0.04%，氯化钴0.02%，硫酸亚铁0.7%，基质为水。

实施例1本发明光合细菌菌剂对鱼塘水氨氮和亚硝酸盐处理的室内试验

在养殖池塘水中主要的化学指标有氨态氮、硫化氢、溶解氧、pH、亚硝酸盐和有机物耗氧量等，其中以氨态氮和亚硝酸盐尤为重要，因为这两种物质是养殖池中的主要有害物质。氨通常是由含氮有机物分解而产生的，如沉入池底的饲料、鱼排泄物、肥料和动植物死亡的遗骸，或者是氨基酸经微生物氨化作用脱氨基生成，另外鱼类的代谢终产物多数也以氨的形式排出。一般情况下，池水中氨的含量较低，水生生物和鱼类排泄的氨被大量池水稀释，同时硝化细菌将其转化为硝酸盐，因此对鱼类不会产生多大影响，但在缺氧或高密度养殖和大量投喂饵料时，氨的浓度就会升高。当氨氮的积累在水中达到一定的浓度时就会使鱼中毒，水中NH4+-N含量超过0.2mg/L时，就会直接危害鱼类生存，使鱼中毒，减少摄食，生长缓慢；当水中NH4+-N含量超过0.6mg/L时，鱼就会死亡，因此氨成为限制放养密度的因素之一。亚硝酸盐是氨转化为硝酸盐过程中的中间产物，在水体缺氧条件下，氨在水体中硝化细菌的作用下，逐步氧化经亚硝酸盐再转化成硝酸盐，这一过程称为硝化作用。硝化作用一旦受阻，结果就会引起硝化的中间产物亚硝酸盐再水体内的大量积累。氨含量越高，溶氧水平越低，pH值越低，水温越低，则亚硝酸盐的水平越高。亚硝酸盐对鱼类具有一定的毒性，会导致鱼类的生理功能紊乱，严重影响生长而且发病率高。亚硝酸盐主要是通过鱼虾的呼吸作用，由鳃丝进入血液，一般情况下，当水中亚硝酸盐浓度在0.1mg/L以下时，水生动物可以正常生长；但亚硝酸盐浓度达到0.1mg/L时，随着浓度的升高，鱼虾红细胞数量和血红蛋白数量逐渐减少，血液载氧能力逐渐减低，出现组织缺氧。亚硝酸盐对虾、蟹的毒性更大，主要表现为对肝脏的损害，虾、蟹中毒时鳃受损变黑，最后死亡。因此，必须定期监测鱼塘水中氨氮和亚硝酸盐含量，并加以去除和控制。

为了解光合细菌菌剂对鱼塘水氨氮和亚硝酸盐等有机物的降解效果，进行光合细菌降解鱼塘水的室内实验。

1材料与方法

1.1材料

采集鱼塘排污口污水，光合细菌采用5升塑料桶发酵培养制得（其PSB细菌体浓度为大于100亿/ml）。

1.2方法

在6个2L烧杯中各装1L污水，分别定为A0、A1、A2、A3、A4、A5，其中A0为空白对照。将光合细菌液分别以0、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%的比例投到烧杯中，放置于室外。投放第7天测定未加菌液的污水浓度及加菌液的污水浓度，并作比较。pH值由pH计测定，氨氮、亚硝酸盐采用奥克丹W-Ⅰ水质分析仪测定，测定前将光合细菌以3000r/min去除。

主要试验设备：2L烧杯、pH计（pHS-25型pH计）、氨氮测定的仪器和试剂、分光光度计。结果见表1。

表1用光合细菌处理鱼塘水NH₄ ⁺-N和亚硝酸盐的含量变化（mg/L）

2结果与分析

从表1看出，随着光合细菌投放量的增加，鱼塘水中的氨态氮和亚硝酸盐含量呈现下降趋势，当其投放量达到1.5%时，氨态氮含量和亚硝酸盐含量分别为0.03、0.05，已达到了渔业水质标准（GB11607-89），当投放量达到2.5%时，氨态氮和亚硝酸盐含量下降变化不明显。

3小结与讨论

（1）氨态氮和亚硝酸盐是水产养殖业最主要的两种有毒物质，这两种物质在水中溶解氧低，pH＞7或水温偏高等情况下容易产生。

（2）光合细菌对鱼塘水氨态氮、亚硝酸盐有明显的去除作用，其投放量5%时效果最好。由此推知，用光合细菌处理生活污水和高浓度有机废水，对去除氨态氮和亚硝酸盐也应有较好的效果。

（3）施用光合细菌，投放时应选择阳光充足的晴天进行。

实施例2本发明光合细菌菌剂对鱼塘水氨氮和亚硝酸盐处理的水面试验

为了解光合细菌对鱼塘水中氨氮和亚硝酸盐等有机物的降解效果，特进行水面试验。

1材料与方法

1.1材料

养殖户谌厚发的鱼塘连年养殖，采用猪粪肥水，水体水质不好，死鱼较多，特选择此鱼塘为本试验鱼塘，鱼塘位于湖北省武汉市江夏区山坡乡程墩村，北纬30°3'3.93"，东经14°19'5.70"。光合细菌采用5升塑料桶发酵培养制得（其PSB细菌体浓度为大于100亿/ml）。鱼塘水深2m，水面20亩，按照每亩1L的用量施用光合菌液，同时在投放菌液前取水样现场检测水质，投放后从第1天到第7天连续取水样，进行现场测定水质，并作比较。pH值由pH计测定，氨氮、亚硝酸盐采用奥克丹W-Ⅰ水质分析仪现场测定。

主要试验设备：烧杯、pH计（pHS-25型pH计）、氨氮测定的仪器和试剂、分光光度计。结果见表2。

表2用光合细菌处理鱼塘水NH₄ ⁺-N和亚硝酸盐的含量变化（mg/L）

2结果与分析

从表2看出，随着投放天数的增加，鱼塘水中的氨态氮和亚硝酸盐含量呈现下降趋势，投放第6天时，氨态氮含量和亚硝酸盐含量分别为0.07、0.07，已达到了渔业水质标准（GB11607-89），投放第6天和第7天，鱼塘水的氨氮与亚硝酸盐含量变化不大，趋于稳定。

3小结与讨论

（1）氨态氮和亚硝酸盐是水产养殖业最主要的两种有毒物质，这两种物质在水中溶解氧低，pH＞7或水温偏高等情况下容易产生。

（2）光合细菌对鱼塘水氨态氮、亚硝酸盐有明显的去除作用，投放第2天即产生了明显的效果。由此推知，用光合细菌处理生活污水和高浓度有机废水，对去除氨态氮和亚硝酸盐也应有较好的效果。

（3）施用光合细菌，投放时应选择阳光充足的晴天进行，保证投放后，能收到良好的光照，能充分发挥光合细菌的作用。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，以及部分运用的实施例，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种光合细菌菌剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤

a）、菌种活化

采用硅胶塞封口的试管作为培养容器，加入液体活化培养基，其总体积占容器有效容积的70—80%，将在冷冻室中低温保存的光合细菌菌种接种于液体活化培养基中静置培养，接种量1毫升，培养温度30—35℃，培养时间5—7天，即得到光合细菌一级种子；

b）、种子液制备

在无菌的操作台上，将光合细菌一级种子接种到250毫升液体种子培养基中，接种量为20—25毫升，拧紧瓶盖后放于自然光下培养，温度30—35℃，培养周期5—7天，得到光合细菌二级种子液；

c）、发酵培养

向5升可密封的塑料桶中加入发酵培养基，按照20—50%比例接入光合细菌二级种子液，拧紧桶盖后露天放置，在光照下发酵，检测发酵液中菌体数量，待菌体数量达到100亿/毫升时即可停止发酵。

2.根据权利要求1所述的一种光合细菌菌剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤a）中液体活化培养基的pH值为7.2，含有以下重量百分比的物质：蛋白胨0.6%，柠檬酸钠0.6%，酵母浸粉0.2%，碳酸氢钠0.2%，氯化钠0.2%，氯化铵0.2%，七水硫酸镁0.2%，磷酸二氢钾0.2%和余量的水。

3.根据权利要求1所述的一种光合细菌菌剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤b）中液体种子培养基的pH值为7.2，含有以下重量百分比的物质：蛋白胨0.6%，柠檬酸钠0.6%，酵母浸粉0.2%，碳酸氢钠0.2%，氯化钠0.2%，氯化铵0.2%，七水硫酸镁0.2%，磷酸二氢钾0.2%和余量的水。

4.根据权利要求1所述的一种光合细菌菌剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤c）中发酵培养基含有以下重量百分比的物质：醋酸钠0.1%—0.2%，酵母膏0.1%，氯化铵0.1%，氯化钠0.01%，碳酸氢钠0.3%，七水硫酸镁0.04%，磷酸氢二钾0.6%，微量元素母液0.1%，水余量。

5.根据权利要求4所述的一种光合细菌菌剂的制备方法，其特征在于，所述的微量元素母液含有以下重量百分比的物质：乙二胺四乙酸二钠0.25%，硫酸锌1.0%，硫酸镁0.2%，硫酸铜0.04%，氯化钴0.02%，硫酸亚铁0.7%，水余量。

6.根据权利要求1至5任意一项所述的一种光合细菌菌剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤c）中的发酵过程在室外自然光或室内钨丝灯光源下进行，每天摇动培养容器2—3次。

7.根据权利要求6所述的一种光合细菌菌剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤c）中菌体数量的检测采用双层琼脂检测法。

8.一种如权利要求1所述光合细菌菌剂的应用，其特征在于，应用于水产养殖水体施用以净化水质。

9.根据权利要求8所述光合细菌菌剂的应用，其特征在于，针对水体污染、氨氮及亚硝酸盐含量过高的养殖水体或受污染的非养殖水体中使用。

10.根据权利要求9所述光合细菌菌剂的应用，其特征在于，使用时按照0.5—1升/亩的用量直接撒入水中。