CN101691550A - 改善水体和生物肠道菌落结构的菌剂及制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种改善水体和生物肠道菌落结构的菌剂及制备方法与应用。本发明通过将蛭弧菌、光合细菌、乳酸链球菌、保加利亚乳杆菌和水产生物肠道有益菌株混合，得到所述的改善水体和生物肠道菌落结构的菌剂。将所述的改菌剂应用于淡水养殖过程中，能有效改善水产养殖环境和养殖生物肠道菌群结构。这是由于本发明利用了蛭弧菌对致病菌的趋向性和裂解能力，同时利用能定殖于养殖生物肠道的细菌及其他有益菌来填补致病菌留下的空缺的生态灶，从而实现改善水产养殖环境和养殖生物肠道菌群结构的目的。本发明所述的菌剂有效、环保、不产生病原菌抗性，应用前景良好。

Description

改善水体和生物肠道菌落结构的菌剂及制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种改善水体和生物肠道菌落结构的菌剂及制备方法与应用。

背景技术

目前，水产养殖业迅猛发展，集约化高密度养殖规模日益扩大，导致病原微生物种类增多和传播速度加快，养殖生物病害发生日益严重，从而造成水产养殖业的严重损失。

迄今，国内外在水产养殖动物的疾病防治中，仍然主要使用抗生素等制剂。然而，抗生素大量滥用，会导致一些副作用的产生，如药物残留、病原菌的抗药性、抑制有益菌群等。而生物防治的方法则具有强大的优越性，引起各方的关注。

蛭弧菌自1963年被发现以来，由于其具有寄生型特性和宿主菌范围广特点，倍受人们关注。在食品安全或防治水产养殖病害领域，利用蛭弧菌消除或者抑制致病菌的方法，与容易引起很多副作用的抗生素灭菌的方法相比，前者更具有优越性。

申请号为200610039346.8的国家专利申请“一种噬菌体蛭弧菌制剂的生产方法”公开了一种噬菌蛭弧菌制剂的制备方法，但该方法用于培养蛭弧的菌宿主菌制剂为有益菌，这会导致蛭弧菌对有益菌裂解能力提升和对真正有害菌裂解能力钝化的潜在结果，而且不能解决有害菌死亡后在养殖水体和养殖生物肠道留下空缺的生态灶(niche)的问题。申请号为200710031166.X的国家专利申请“高密度蛭弧菌游泳体的发酵培养技术”公开了一种高密度蛭弧菌游泳体的发酵培养技术，不涉及制剂配制的问题。专利号为ZL 02145249.0的国家发明专利“微生物养殖水体改良剂及制作方法”公开了能分解养殖水域底部积累残余饵料、排泄废物、动植物残体以及有害气体，净化水质，提高养殖物的成活率的微生物养殖水体改良剂及其制备方法。但是这种微生物养殖水体改良剂没有解决养殖水体和养殖生物肠道致病菌的问题。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有微生物制剂不能同时改善水产养殖环境和养殖生物肠道环境的不足之处，提供一种能同时改善水体和生物肠道菌落结构的菌剂。

本发明的另一目的在于提供所述菌剂的制备方法。

本发明的再一目的在于提供所述菌剂的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种改善水体和生物肠道菌落结构的菌剂，包含蛭弧菌菌液和有益菌菌液；

所述有益菌菌液由光合细菌、乳酸链球菌(Streptococcus lactis)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)和水产生物肠道有益菌；

所述水产生物肠道的有益菌为菌株H₂菌液或菌株3y621菌液中的一种或两种；

所述H₂为本实验室从养殖生物肠道分离得到的革兰氏阳性菌[参考文献：钟雄明，蔡俊鹏。大闸蟹肠道中产酶菌株及其胞外酶的研究。水利渔业，2007，27(1)：91-92]，为短杆菌，成单或成对，链状较少，无荚膜，无芽孢，极生单鞭毛；30℃恒温培养24h，营养琼脂平板表面菌落圆形，湿润，灰白色，略隆起；

所述菌株3y621为本实验室从罗非鱼肠道中分离出的蛋白酶高产的菌株[参考文献：陈惠源，蔡俊鹏。罗非鱼肠道蛋白酶高产菌株及其适应力研究。水利渔业，2005，25(4)：86-87]；其为革兰氏阳性菌，细胞呈直杆状，0.4～0.5μm×2.0～2.5μm，常单个或以成对排列，有芽孢；30℃恒温培养24h，营养琼脂平板表面菌落圆形，湿润，灰白色，略隆起；

所述光合细菌优选红假单胞菌(Rhodopseudomonas sp.)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)或荚膜红细胞(Rhodobacter capsulatus)中的至少一种；

所述蛭弧菌菌液和有益菌菌液优选按体积比1∶2～1∶4混合，其中蛭弧菌菌液的浓度为10⁵～10¹⁰pfu/ml，有益菌菌液的浓度为10⁵～10¹⁰cfu/ml；

所述改善水体和生物肠道菌落结构的菌剂的制备方法，包括以下步骤：将蛭弧菌液和有益菌菌液混合，得到上述改善水体和生物肠道菌落结构的菌剂。

所述改善水体和生物肠道菌落结构的菌剂的制备方法，包括以下步骤：分别将蛭弧菌液和有益菌菌液的浓度调整为10⁵～10¹⁰pfu/ml和10⁵～10¹⁰cfu/ml；调整浓度后蛭弧菌液和有益菌菌液按体积比1∶2～1∶4混合，得到上述改善水体和生物肠道菌落结构的菌剂。

所述蛭弧菌菌液优选通过申请号“200710031166.X”，名称为“高密度蛭弧菌游泳体的发酵培养技术”国家发明专利申请公开的高密度蛭弧菌游泳体的发酵方法进行制备；其中，所用的宿主菌为致病菌，优选副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、假单胞菌(Pseudomonas sp.)或大肠杆菌(Escherichia coli)；

所述的光合细菌菌液通过以下步骤进行培养：光合细菌按质量体积比0.1％接种到优化RCVBN液体培养基中，于30℃、光照强度为3000lx下光照厌氧培养48h后得到的菌液按10％接种入优化的RCVBN培养基中，光照厌氧发酵培养48～96h，期间适当搅拌，然后5000～8000rpm离心5～15min获得菌体，往沉淀中加入无菌的DNB(dilute nutrient broth)液体培养基、水或生理盐水或磷酸盐缓冲液得到浓度为10⁵～10¹⁰cfu/ml的光合细菌菌液；

所述优化RCVBN培养基的组成为：3.0g CH₃COONa，1.0g(NH₄)₂SO₄，0.2gMgSO₄，1.0g NaCl，0.3g KH₂PO₄，0.5g K₂HPO₄，0.05g CaCl₂，0.1g酵母膏，1ml微量元素溶液，1000ml蒸馏水；

所述的微量元素溶液组成为：2g EDTA-2Na，0.2g FeSO₄·7H₂O，0.1gMnCl₂·4H₂O，0.1g H₃BO₃，0.1g CoCl₂·6H₂O，0.1g ZnCl₂，0.02g Na₂MoO₄·2H₂O，0.02mg NiCl₂·6H₂O，0.01g CuCl₂·2H₂O，1000ml蒸馏水，pH7.0～7.2；

所述蛭弧菌优选2008年1月13日在中国典型培养物保藏中心保藏的保藏编号为CCTCC NO：M 208008的蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDF01，保藏日期为2008年1月13日、保藏编号为CCTCC NO：M 208009的蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDF02或保藏日期为2008年4月28日、保藏编号为CCTCC NO：M 208066的蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDM01中的至少一种；

所述改善水体和生物肠道菌落结构的菌剂的应用，包括以下步骤：在灌水前或养殖过程中，将所述菌剂均匀泼洒于水体中，每1～2周泼洒1次，使水体中有益菌终浓度至少为10²cfu/ml，蛭弧菌终浓度至少为10²pfu/ml。

本发明利用蛭弧菌是能以裂解养殖水体中的致病菌为宿主，提高了所得到的蛭弧菌对致病菌的趋向性和裂解能力，并利用所本实验室从养殖生物肠道分离得到的能定殖于养殖生物肠道的细菌及其他有益菌来填补致病菌留下的空缺的生态灶(niche)，从而实现改善水体和生物肠道菌落结构的目的。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、本发明以致病菌为宿主菌，分离得到的蛭弧菌，避免了长期使用有益菌培养蛭弧菌而导致后者对有益菌裂解能力的提升、对真正有害菌裂解能力钝化的潜在恶果。

2、本发明所使用的蛭弧菌可有效消除、控制阴性菌和阳性菌的数量；获得的生态灶，再其它有益菌来填补。从而控制养殖水体和养殖生物肠道微生物群落结构/有害菌种群密度。

3、本发明所述改善水体和生物肠道菌落结构的菌剂在改善养殖环境和养殖生物肠道微生物群落结构上的应用有效。这是由于蛭弧菌能够裂解养殖环境及养殖生物肠道中的有害菌，光合细菌(红假单胞菌，沼泽红假单胞菌，荚膜红细胞)、乳酸链球菌、保加利亚乳杆菌以及大闸蟹和罗非鱼肠道菌株都能很好的填补本土菌群被裂解后留下的生物灶。

4、本发明能提高养殖生物的成活率和生长速度：在湛江一罗非鱼养殖场对实施本方法的罗非鱼和对照组的罗非鱼的生长速度的监测，在监测过程中，实验组(使用本发明所述改善水产养殖环境和水产生物肠道环境的菌剂)无论在罗非鱼的体重和体长方面都优于对照组，六十天后实验组比对照组罗非鱼体重重15.16％，体长长11.19％。

5、本发明所述的菌剂有效、环保、不产生病原菌抗性，应用前景良好。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

(1)蛭弧菌菌液的制备

蛭弧菌菌液通过申请号“200710031166.X”的国家发明专利申请公开的高密度蛭弧菌游泳体的发酵方法进行制备：分别在3个装有100ml LB(Luria-Bertani)液体培养基的锥形瓶中接种嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila，购于广东省微生物所菌种保藏中心，编号GIM1.172)，250rpm、30℃摇床培养24小时，培养液分别于4℃、5000rpm离心15min，弃上清。分别将沉淀加入到3个装有100ml DNB液体培养基(营养肉汤0.8g，酪蛋白酸水解物0.5g，酵母精提物0.1g，NaCl30g，溶于1000ml蒸馏水中，pH值为7.2～7.6)的锥形瓶中，再从双层平板上挑菌斑分别接入蛭弧菌BDF01、蛭弧菌BDF02和蛭弧菌BDM01恒温摇床250rpm、30℃培养24h。培养液分别于4℃6000rpm离心20min，取上清液，再将上清液分别于4℃16000rpm离心20min，保留沉淀，加入DNB液体培养基重新悬浮蛭弧菌沉淀物，蛭弧菌BDF01菌液、蛭弧菌BDF02菌液和蛭弧菌BDM01菌液的浓度分别为10⁵pfu/ml。

所述蛭弧菌BDM01由蛭弧菌BDF01进行紫外诱变得到，对其进行负染后于电子显微镜下形态观察：蛭弧菌BDM01呈单细胞，弧形，大小为1.7×1.0μm，端生鞭毛，鞭毛长度为3.5μm；将其以双层平板法于28℃培养三天可形成直径3-4mm的透明圆形噬菌斑。

(2)有益菌菌液的制备

光合细菌菌液的制备：红假单胞菌(Rhodopseudomonas sp.)(菌株号码：1.2193，购于中国科学院微生物研究所)，沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)(菌株号码：1.2349，购于中国科学院微生物研究所)，荚膜红细胞(Rhodobacter capsulatus)(菌株号码：GIM1.168，购于广东省微生物研究所菌种保藏中心)分别按质量体积比0.1％接种到优化RCVBN液体培养基中，于30℃、光照强度为3000lx下光照厌氧培养48h后得到的菌液按体积比10％接种入优化的RCVBN培养基中，光照厌氧发酵培养48h，期间适当搅拌，然后5000rpm离心15min获得菌体，往沉淀中加入无菌的DNB液体培养基得到浓度为10⁵cfu/ml的光合细菌菌液。优化RCVBN培养基的组成为：3.0g CH₃COONa，1.0g(NH₄)₂SO₄，0.2g MgSO₄，1.0g NaCl，0.3g KH₂PO₄，0.5g K₂HPO₄，0.05g CaCl₂，0.1g酵母膏，1ml微量元素溶液，1000ml蒸馏水；微量元素溶液组成为：2gEDTA-2Na，0.2g FeSO₄·7H₂O，0.1g MnCl₂·4H₂O，0.1g H₃BO₃，0.1g CoCl₂·6H₂O，0.1g ZnCl₂，0.02g Na₂MoO₄·2H₂O，0.02mg NiCl₂·6H₂O，0.01g CuCl₂·2H₂O，1000ml蒸馏水，pH7.0～7.2。

菌株H₂、乳酸链球菌(Streptococcus lactis)(菌株号码GIM1.156，购于广东省微生物研究所菌种保藏中心)，保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)(菌株号码GIM1.8，购于广东省微生物研究所菌种保藏中心)，各自接种在NB(Nutrient Broth)平板上，30℃培养24h。再挑取单一菌落接种到NB液体种子培养基中，30℃震荡培养过夜后，按1％接种到NB液体发酵培养基中，30℃发酵培养12～48h，之后5000rpm离心15min获得菌体，往沉淀中加入无菌的生理盐水，得到浓度为10¹⁰cfu/ml的菌液。

将以上各有益菌等比混合，得到有益菌剂。

其中，菌株H₂为本实验室从养殖生物肠道分离得到的革兰氏阳性菌，具有产蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶特点(参考文献：钟雄明，蔡俊鹏.大闸蟹肠道中产酶菌株及其胞外酶的研究[J].水利渔业，2007，27(1)：91-92)。通过观察，细菌H₂为革兰氏阳性短杆菌，成单或成对，链状较少，无荚膜，无芽孢，极生单鞭毛，30℃恒温培养24h，营养琼脂平板表面菌落圆形，湿润，灰白色，略隆起。经16S rDNA序列分析，鉴定菌株H₂为Brevibacterium sp.，其16S rDNA序列如SEQ ID：No.1所示。

(3)改善水体和生物肠道菌落结构的菌剂的制备

将蛭弧菌浓缩液与有益菌按体积比1∶3混合，得到改善水体和生物肠道菌落结构的菌剂。

(4)将步骤(3)制备得到的菌剂用于大闸蟹养殖中，进行检测

将6个大闸蟹养殖水池(0.5mx0.5mx0.5m＝125L)分为实验组和对照组，每组各3个池。每个大闸蟹养殖水池池水为100L，大闸蟹20只，大闸蟹均重175g，水温为25℃；在实验组池中均匀泼洒骤(3)制备得到的改善水产养殖环境和水产生物肠道环境的菌剂，每周泼洒1次，使用的终浓度控制在蛭弧菌浓度为10²～10⁵pfu/ml、有益菌浓度为10²～10⁵cfu/ml，每次泼洒各池的用量相同。

在试验过程中，检测养殖水体和大闸蟹肠道的革兰氏阴性菌群、阳性菌群和有益菌(光合细菌、保加利亚乳杆菌、乳酸链球菌和细菌H₂)的浓度。水池中菌群的检测方法为：在施用本有益菌剂后立即检测水体中菌群，本次记为第0天，往后每7天检测一次，共检测5次，采用涂布选择培养基平板法。具体检测操作如下：取1000ml水样，用0.22um滤膜(Millipore)过滤浓缩细菌，然后在用10ml无菌水洗下滤膜上的菌体，再按10倍稀释法稀释，最后从每个稀释梯度样品中吸取0.2mL的水样涂平板进行检测。做三个平行样检测。

大闸蟹肠道微生物菌群的检测方法为：施用菌剂后第28天，取大闸蟹肠中食糜0.2g于无菌离心管中，加入无菌0.85％生理盐水1.8ml，制成原液。将原液依次进行10倍稀释，取100μl稀释液涂布选择培养基平板，使用MPN法(MostProbable Number Method，最大可能数法)进行检测，使用的选择性培养基为：伊红美蓝琼脂检测革兰氏阴性菌数量，甘露醇食盐琼脂检测革兰氏阳性菌数量，RCVBN琼脂培养基检测光合菌数量，MRS琼脂(de Man，Rogosa and Sharpemedium)检测保加利亚乳杆菌数量，AZIDE BLOOD琼脂(叠氮血琼脂)检测乳链球菌数量。对于本实验室分离出的有益菌H₂总数的检测，使用特异性荧光定量PCR的方法，具体步骤如下：取大闸蟹肠中食糜0.2g于无菌离心管中，加入无菌0.85％生理盐水1.8ml，制成原液，离心，用pH为7.0的PBS(phosphatebuffer saline)洗一次，再离心，收集菌体，然后悬浮于200μl TE(Tris-EDTA buffer)液中，用基因组DNA抽提试剂盒提取DNA，其反应体系40μl：SYBR Green I混合液20μl(含2μl 10×buffer，0.1mol/ldNTPs，2.5U Taq DNA聚合酶)，上下游引物2μmol/l(分别为5’-TTCCATGGCCGATAGCCGGGCGAACAG-3’和5’-GCGAATTCTCACTGGATGTCGGACGAGATGA-3’)及DNA模板；反应程序采用三步法：95℃预变性10min，94℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环。在每一循环的退火阶段收集荧光进行实时检测。反应结束后先加热到95℃，然后降至60℃开始缓慢升温(0.2℃/s)至95℃，纪录荧光信号的变化，得出扩增产物的熔解曲线。

同时计算出养殖水体或肠道中土生菌群的数量，由下面的方法计算：

本土革兰氏阴性菌群＝伊红美蓝琼脂的数量

本土革兰氏阳性菌群＝甘露醇食盐琼脂的数量-MRS琼脂检测保加利亚乳杆菌数量-AZIDE BLOOD琼脂检测乳链球菌数量-使用特异性荧光定量PCR法测得的肠道株的数量

表1、步骤(3)制备得到的菌剂对大闸蟹养殖水体微生物菌落结构的影响

从表1可以看出，本实施例制备的改善水体和生物肠道菌落结构的菌剂对水体中的土著菌的抑制和清除效果显著，养殖水体中，原有的革兰氏阴性和阳性菌分别从10³～10⁴cfu/ml减少到了10³cfu/ml和从10³cfu/ml减少到了10²cfu/ml。光合细菌、保加利亚乳杆菌数量增与原来相比增加了10倍以上，乳酸链球菌的也增加了两倍以上，本土细菌清除后留下的生态灶从而被填补，菌群数量得到保持稳定，水域微生态平衡，有利于养殖环境良性发展。从而证明本方法能有效的控制淡水养殖环境微生物菌群结构。

表2、步骤(3)制备得到的菌剂对大闸蟹肠道微生物群落结构的影响

从表2可以看出，使用本实施例制备的改善水体和生物肠道菌落结构的菌剂，大闸蟹肠道中的本土革兰氏阴性和阳性菌的浓度分别从10³cfu/ml减少到了10²cfu/ml和从10³cfu/ml减少到了10²cfu/ml，而肠道中的光合细菌、保加利亚乳杆菌和乳酸链球菌和其他有益菌的数量与刚施用相比上升了一个数量级，肠道菌群数量不变，说明土著菌群被蛭弧菌侵食后，留下的空缺已由有益菌填补，使大闸蟹肠道菌群的数量维持在一定水平并且结构得到优化。从而证明本方法能有效改善养殖生物肠道微生物菌群结构。

实施例2

(1)蛭弧菌菌液的制备

同实施例1步骤(1)，区别仅在于用0.05M pH值为7.2的无菌磷酸盐缓冲液悬浮蛭弧菌沉淀物，蛭弧菌BDF01菌液、蛭弧菌BDF02菌液和蛭弧菌BDM0l菌液的浓度分别为10⁷pfu/ml。

(2)有益菌菌液的制备

同实施例1步骤(2)，区别在于使用菌株3y621，而不使用菌株H₂。用0.05MpH为7.2无菌磷酸盐缓冲液调整光合细菌菌液的浓度，为10⁵cfu/ml；分别用生理盐水调整细菌3y621、乳酸链球菌和保加利亚乳杆菌得到的浓度，浓度均为107cfu/ml的菌液。

将以上各有益菌以等比混合，得到有益菌剂。

其中，菌株3y621[参考文献：陈惠源，蔡俊鹏。罗非鱼肠道蛋白酶高产菌株及其适应力研究。水利渔业，2005，25(4)：86-87]为本实验室从罗非鱼肠道中分离出的蛋白酶高产的菌株。经检测，菌株3y621为革兰氏阳性菌，细胞呈直杆状，0.4～0.5μm×2.0～2.5μm，常单个或以成对排列，有芽孢；30℃恒温培养24h，营养琼脂平板表面菌落圆形，湿润，灰白色，略隆起。经16S rDNA序列分析，鉴定菌株3y621为Bacillus sp.其16S rDNA序列如SEQ ID：No.2所示。

(3)改善水体和生物肠道菌落结构的菌剂的制备

将蛭弧菌浓缩液与有益菌按体积比1∶2混合，用磁力搅拌器搅拌均匀，得到改善水体和生物肠道菌落结构的菌剂；

(4)将步骤(3)制备得到的菌剂用于罗非鱼养殖中，进行检测

将6个罗非鱼养殖水池(0.5mx0.5mx0.5m＝125L)分为实验组和对照组，每组各3个池。每个罗非鱼养殖水池中淡水为100L，罗非鱼30条，罗非鱼的平均体长为9.0cm，均重68g，水温为25℃；在实验组池中均匀泼洒骤(3)制备得到的改善水体和生物肠道菌落结构的菌剂，每周泼洒1次，使用浓度控制在蛭弧菌浓度为10²～10⁵pfu/ml、有益菌浓度为10²～10⁵cfu/ml，每次泼洒各池的用量相同。

在试验过程中，检测养殖水体和罗非鱼肠道的革兰氏阴性菌群、阳性菌群和有益菌(光合细菌、保加利亚乳杆菌、乳酸链球菌和菌株3y621)的浓度；水池中菌群的检测方法为：在施用本有益菌剂后立即检测水体中菌群，本次记为第0天，往后每7天检测一次，共检测5次，采用涂布选择培养基平板法。具体检测操作如下：取1000ml水样，用0.22um滤膜(Millipore)过滤浓缩细菌，然后在用10ml无菌水洗下滤膜上的菌体，再按10倍稀释法稀释，最后从每个稀释梯度样品中吸取0.2mL的水样涂平板进行检测。做三个平行样检测。

罗非鱼肠道微生物菌群的检测方法为：施用菌剂后第28天，取罗非鱼肠中食糜0.2g于无菌离心管中，加入无菌0.85％生理盐水1.8ml，制成原液，然后依次进行10倍稀释。取100μl稀释液涂布选择培养基平板。使用MPN法进行检测，具体操作同实施例1步骤(4)。取罗非鱼肠中食糜0.2g于无菌离心管中，加入无菌0.85％生理盐水1.8ml，制成原液，用PBS洗一次，再离心，收集菌体，然后悬浮于200μl TE液中，用基因组DNA抽提试剂盒提取DNA，其反应体系40μl同实施例1，上下游引物分别为5’-AGGATGAAGAAGAAGTCCTGT-3’和5’-TGATTTAATTGCTCGTATATTTTACCCAGT-3’；反应程序采用三步法：95℃预变性10min，94℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环。在每一循环的退火阶段收集荧光进行实时检测。反应结束后先加热到95℃，然后降至60℃开始缓慢升温(0.2℃/s)至95℃，纪录荧光信号的变化，得出扩增产物的熔解曲线。

同时计算出养殖水体或肠道中土生菌群的数量，由下面的方法计算：

本土革兰氏阴性菌群＝伊红美蓝琼脂的数量

本土革兰氏阳性菌群＝甘露醇食盐琼脂的数量-MRS琼脂检测保加利亚乳杆菌数量-AZIDE BLOOD琼脂检测乳链球菌数量-使用特异性荧光定量PCR法测得的肠道株的数量

从表3可以得出，罗非鱼养殖水体中的本土革兰氏阴性菌和阳性菌减少显著，其中阴性菌从10⁴cfu/ml减少到了10³cfu/ml，阳性菌从10³cfu/ml减少到了10²cfu/ml，施加的光合细菌、保加利亚乳杆菌和乳酸链球菌和其他有益菌的均增加了一个数量级以上，留下的生态灶由已经由有益菌填补，维持了菌群的平衡，有利于养殖环境朝着良性发展。本方法确能有效的控制淡水养殖环境微生物菌群结构。

表3、步骤(3)制备得到的菌剂对罗非鱼养殖水体微生物菌落结构的影响

从表4可以得出，实施本方法后，罗非鱼肠道中的本土革兰氏阴性菌和阳性菌的浓度明显低于对照组，其中阴性菌从10⁴cfu/ml减少到了10³cfu/ml，阳性菌也从10³cfu/ml减少到了10²cfu/ml，而肠道中的有益菌显著增殖，从较少的数量上升到10²cfu/ml以上，补充了本土菌群减少的空缺，形成了罗非鱼肠道更健康更合理的微生态系统。从而证明本方法能有效控制养殖生物肠道微生物菌群结构。

表4、步骤(3)制备得到的菌剂对罗非鱼肠道微生物群落结构的影响

实施例3

改善水体和生物肠道菌落结构的菌剂对养殖罗非鱼作用的试验，包括以下具体步骤：

(1)蛭弧菌浓缩液的制备

同实施例1步骤(1)，区别仅在于用无菌水悬浮蛭弧菌沉淀物，蛭弧菌BDF01菌液、蛭弧菌BDF02菌液和蛭弧菌BDM01菌液的浓度分别为10¹⁰pfu/ml。

(2)有益菌菌液的制备，同实施例(2)步骤(2)

(3)改善水体和生物肠道菌落结构的菌剂的制备

将蛭弧菌浓缩液与有益菌按体积比1∶4混合，得到改善水体和生物肠道菌落结构的菌剂。

(4)将步骤(3)制备得到的菌剂用于罗非鱼养殖中，对罗非鱼的成活率和生长速度进行检测：

将位于湛江的罗非鱼养殖场中，将6养殖水池分为2组，1组为实验组，1组为对照组，每组各3个池。试验用水为不过滤的罗非鱼养殖淡水，每个水池为100L。实验组和对照组用的罗非鱼平均体长均为2.36cm，重0.58g，每个水池放30条罗非鱼。试验期间水温为25℃。实验组各池使用步骤(3)制备得到的菌剂，对照组则不使用。在实验组池中均匀泼洒步骤(3)制备得到的菌剂，使蛭弧菌浓度为10²～10⁵pfu/ml、有益菌浓度为10²～10⁵cfu/ml，在放养鱼苗或灌水前一周均匀泼洒在池塘中，以后每2周泼洒1次。对试验组和对照组的罗非鱼的生长速度的监测，其结果如表5所示。

表5、罗非鱼体重体长的测定(n＝50)

可见，实验组无论在罗非鱼的体重和体长方面都优于对照组，六十天后实验组比对照组罗非鱼体重重15.16％，体长长11.19％。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110>华南理工大学

<120>改善水体和生物肠道菌落结构的菌剂及制备方法与应用

<130>4

<160>2

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>842

<212>DNA

<213>菌株H2(Brevibacterium sp.)

<400>1

tgcttgcgac cgtactccca ggcggggcac ttaatgcgtt agctacggcg cggagaacgt   60

ggaatgtccc ccacacctag tgcccaacgt ttacggcatg gactaccagg gtatctaatc  120

ctgttcgctc cccatgcttt cgctcctcag tgtcagttac agcccagagt cccgccttcg  180

ccaccggtgt tcctcctgat atctgcgcat ttcaccgcta caccaggaat tccagactcc  240

cctactgcac tctagtcagc ccgtacccac tgcacgcgca acgttaagcg ttgcgtttcc  300

acagcagacg tgaccaacca cctacgagct ctttacgccc aataattccg gacaacgctc  360

gtaccctacg tattaccgcg gctgctggca cgtagttagc cggtacttct tctgcaggta  420

ccgtcacttt cgcttcttcc ctgctgaaag cggtttacaa cccgaaggcc gtcatcccgc  480

acgctgcgtc gctgcatcag ggtttccccc attgtgcaat attccccact gctgcctccc  540

gtaggagtct gggccgtgtc tcagtcccag tgtggccggt cgccctctca ggccggctac  600

ccgtcgtcgc cttggtaggc cattacccca ccaacaagct gataggccgc gagcccatcc  660

ccgatcgaaa aactttccac caaccctcat gcgaaaagag gtcatatccg gtattagacc  720

cagtttccca ggcttatccc gaaatcaggg gcaggttact cacgtgttac tcacccgttc  780

gccactcatc caccaacagc aagctgtcgg cttcagcgtt cgacttgcat gtgttaggcc  840

tg                                                                 842

<210>2

<211>1695

<212>DNA

<213>菌株3y621(Bacillus sp.)

<400>2

cagatcagcg gcggacgggt gagtaacacg tgggtaacct gcctgtaaga ctgggataac   60

tccgggaaac cggggctaat accggataac acctaccccc gcatggggga aggttgaaag  120

gtggcttcgg ctatcactta cagatggacc cgcggcgcat tagctagttg gtgaggtaac  180

ggctcaccaa ggcgacgatg cgtagccgac ctgagagggt gatcggccac actgggactg  240

agacacggcc cagactccta cgggaggcag cagtagggaa tcttccgcaa tggacgaaag  300

tctgacggag caacgccgcg tgagtgaaga aggttttcgg atcgtaaaac tctgttgtta  360

gggaagaaca agtaccgttc gaatagggcg gtaccttgac ggtacctaac cagaaagcca  420

cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgttg tccggaatta  480

ttgggcgtaa agcgcgcgca ggtggtttct taagtctgat gtgaaagccc acggctcaac  540

cgtggagggt cattggaaac tggggaactt gagtgcagaa gaggaaagtg gaattccaag  600

tgtagcggtg aaatgcgtag atatttggag gaacaccagt ggcgaaggcg actttctggt  660

ctgtaactga cactgaggcg cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat accctggtag  720

tccacgccgt aaacgatgag tgctaagtgt tagagggttt ccgcccttta gtgctgcagc  780

taacgcatta agcactccgc ctggggagta cggtcgcaag actgaaactc aaaggaattg  840

acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt  900

accaggtctt gacatcctct gacaacccta gagatagggc tttccccttc gggggacaga  960

gtgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc 1020

aacgagcgca acccttgatc ttagttgcca gcattcagtt gggcactcta agatgactgc 1080

cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg 1140

gctacacacg tgctacaatg gacggtacaa agggctgcaa gaccgcgagg tttagccaat 1200

cccataaaac cgttttcagt tcggattgta ggctgcaatt cgcttacatg aagctggaat 1260

cgttagtaat cgcggatcag catgccgcgg tgaatacgtt cccggccctt gtacacaccg  1320

ccggtcacac cacgagagtt tgtaccaccg gaagtcggtg aggtaacctt ttggagccag  1380

ccgcctaagg tgggacagat gattggggtg aagtcgtaac aaggtagccg tatcggaagg  1440

tgcggctgga tcacctcctt tctaaggaag atttactaaa acgtttgacg acgtcgaagt  1500

tttgttcagt tttgatggtt taagtttttt accaaacgca agccgaataa aatgaacatc  1560

catcttctat attggtcttt gaaaactaaa taaagtttta ttgatagtca agaaattacc  1620

gagtatcgcc attttaaggt tttaaccaat tccgttaagt taataagggc gcacggggga  1680

tgcctgggca gtcaa                                                   1695

Claims (7)

1.一种改善水体和生物肠道菌落结构的菌剂，其特征在于：所述菌剂包含蛭弧菌菌液和有益菌菌液；

所述有益菌由光合细菌、乳酸链球菌(Streptococcus lactis)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)和水产生物肠道有益菌；

所述水产生物肠道的有益菌为菌株H₂或菌株3y621中的一种或两种。

2.根据权利要求1所述改善水体和生物肠道菌落结构的菌剂，其特征在于：所述蛭弧菌菌液和有益菌菌液按体积比1∶2～1∶4混合，其中蛭弧菌菌液的浓度为10⁵～10¹⁰pfu/ml，有益菌菌液的浓度为10⁵～10¹⁰cfu/ml。

3.根据权利要求1所述改善水体和生物肠道菌落结构的菌剂，其特征在于：所述光合细菌为红假单胞菌(Rhodopseudomonas sp.)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)或荚膜红细胞(Rhodobactercapsulatus)中的至少一种。

4.根据权利要求1所述改善水体和生物肠道菌落结构的菌剂，其特征在于：所述蛭弧菌为在中国典型培养物保藏中心保藏的编号为CCTCCNO：M 208008的蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDF01、编号为CCTCC NO：M208009的蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDF02或编号为CCTCC NO：M 208066的蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDM01中的至少一种。

5.权利要求1～4任一项所述改善水体和生物肠道菌落结构的菌剂的制备方法，其特征在于：将蛭弧菌液和有益菌菌液混合，得到所述改善水体和生物肠道菌落结构的菌剂。

6.根据权利要求5所述改善水体和生物肠道菌落结构的菌剂的制备方法，其特征在于：

所述的光合细菌菌液通过以下步骤进行培养：光合细菌按质量体积比0.1％接种到优化RCVBN液体培养基中，于30℃、光照强度为30001x下光照厌氧培养48h后得到的菌液按10％接种入优化的RCVBN培养基中，光照厌氧发酵培养48～96h，期间适当搅拌，然后5000～8000rpm离心5～15min获得菌体，往沉淀中加入无菌的DNB液体培养基、水或生理盐水或磷酸盐缓冲液得到浓度为10⁵～10¹⁰cfu/ml的光合细菌菌液；

所述优化RCVBN培养基的组成为：3.0g CH₃COONa，1.0g(NH₄)₂SO₄，0.2g MgSO₄，1.0g NaCl，0.3g KH₂PO₄，0.5g K₂HPO₄，0.05g CaCl₂，0.1g酵母膏，1ml微量元素溶液，1000ml蒸馏水；

所述的微量元素溶液组成为：2g EDTA-2Na，0.2g FeSO₄·7H₂O，0.1gMnCl₂·4H₂O，0.1g H₃BO₃，0.1g CoCl₂·6H₂O，0.1g ZnCl₂，0.02gNa₂MoO₄·2H₂O，0.02mg NiCl₂·6H₂O，0.01g CuCl₂·2H₂O，1000ml蒸馏水，pH7.0～7.2。

7.权利要求1～4任一项所述改善水体和生物肠道菌落结构的菌剂的应用，其特征在于：在灌水前或养殖过程中，将所述菌剂均匀泼洒于水体中，每1～2周泼洒1次，使水体中有益菌终浓度至少为10²cfu/ml，蛭弧菌终浓度至少为10²pfu/ml。