CN105754908B - 一种铜绿假单胞菌菌株及其应用 - Google Patents

一种铜绿假单胞菌菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种铜绿假单胞菌菌株及其应用，所述铜绿假单胞菌菌株保藏编号为：CGMCC No.11776。本发明是从烟草根部土壤中分离得到的一株高效降解卵菌杀菌剂—代森锰锌的铜绿假单胞菌，实验表明该菌能够在LB培养基中利用代森锰锌作为唯一碳源和能源而生长，并使代森锰锌降解；在添加外源营养物的液体培养条件下，该菌48h能够将混入培养基中5mg/L的高浓度代森锰锌降解90％以上，并且在较宽的pH范围内均有较好的降解效果；该菌可以用于水体及表面残留的代森锰锌的生物降解，弥补了目前利用铜绿假单胞菌降解代森锰锌农药残留的技术空白。

Description

一种铜绿假单胞菌菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种铜绿假单胞菌菌株及其应用。
背景技术
化学农药具有适用范围广、防治对象多、生产成本低、防治效果好以及经济效益高等优点，其广泛适用极大地促进了现代农业的发展，提高了农业生产的劳动效率和机械化程度。但是不可避免地，大量使用农药杀伤昆虫天敌和有益微生物、使有害生物产生抗性、造成人、畜中毒、易对植物产生药害等问题，进入环境中的化学农药，一部分可通过阳光照射、土壤中微生物等的作用，而逐步降解失效；另一部分最终会通过“食物链”的作用，进入人体，对人造成长期危害。各类化学农药目前已广泛进入全球空气及大气沉降物、水体、土壤、底泥级生物体等自然环境中，成为环境中无所不在的污染物，因此探索对农药残留进行有效降解的方法成为研究人员长期努力的一个重要研究方向。而在该领域研究中，近年来广泛兴起的使用微生物对农药残留进行生物降解成为热点领域，通过微生物作用将农药大分子分解成小分子化合物，并使其丧失活性。由于微生物个体小、繁殖迅速、比表面大等特点。它们较之其它生物更易适应环境，并可通过自然突变产生新菌种，产生新的酶系统，具有新的代谢功能，从而可参与对人工新合成化合物的降解与转化作用，因此微生物对降解农药残留具有巨大潜力。假单胞菌科，专性需氧的革兰氏染色阴性无芽胞、无荚膜杆菌，呈杆状或略弯，菌体大小(0.5～1)×(1.5～4)微米，具端鞭毛，能运动。有些株产生荧光色素或(和)红、蓝、黄、绿等水溶性色素，不发酵糖类。大多数菌的适温为30℃。DNA中的G+C克分子含量为58～70％。
发明内容
本发明的目的在于提供一种铜绿假单胞菌菌株及其应用，旨在解决降解代森锰锌残留的问题，提供一种高效降解代森锰锌的微生物菌种,该菌能高效降解代森锰锌，可以用于去除烟叶中代森锰锌残留的微生物降解技术。
本发明是这样实现的，一种铜绿假单胞菌菌株，所述铜绿假单胞菌菌株保藏编号为：CGMCC No.11776。
本发明的另一目的在于提供一种所述的铜绿假单胞菌菌株的培养方法，所述培养方法包括：将铜绿假单胞菌菌体接种到直径60毫米平皿培养基上，在30-37℃，平皿培养基上生长3-5天；
解剖刀刮取菌体，接入液体培养基中，2个培养皿刮取的菌丝接种到100ml培养液中，于30-37℃，240rmp/min转速条件下振荡培养3-5天，获得包含其分泌的胞外降解酶的培养液，为菌丝及菌液的混合菌剂。
进一步，所述平皿培养基组成为：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，琼脂粉15g，蒸馏水1000ml，pH7.5。
进一步，所述液体培养基组成为：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，蒸馏水1000ml，pH7.5。
本发明的另一目的在于提供一种所述铜绿假单胞菌菌株在降解代森锰锌农药残留的应用。
进一步，所述应用将经过培养的铜绿假单胞菌菌株的培养液100ml中，加入浓度5-10mg/L的代森锰锌农药，于37℃，转速240rmp/min，摇床震荡培养，培养时间48小时以上。
本发明提供的高效降解菌铜绿假单胞菌，是从烟草根部土壤中经过人工分离、筛分及纯化所得。得到的高效降解卵菌杀菌剂—代森锰锌的铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，实验表明该菌能够在LB培养基中利用代森锰锌作为唯一碳源和能源而生长，并使代森锰锌降解；在添加外源营养物的液体培养条件下，该菌48h能够将混入培养基中5mg/L的高浓度代森锰锌降解90％以上；该菌可以用于水体及表面残留的代森锰锌的生物降解，目前尚无利用铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)降解代森锰锌农药残留研究的文献报道。本发明是 烟草根部土壤中分离得到的一株高效降解卵菌杀菌剂—代森锰锌的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，该铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一株具有极高活力，其培养方法简单，生长速度快，不易变异，实验表明该菌能够在LB培养基中利用代森锰锌作为唯一碳源和能源而生长，并使代森锰锌降解。
附图说明
图1是本发明实施例提供的铜绿假单胞菌菌株分离方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
铜绿假单胞菌因能产生绿色水溶性色素，感染创口时可形成绿色脓液而得名。又称绿脓假单胞菌，简称绿脓杆菌，因此获得对化学农药的高效降解菌株并运用于实践，对降低农药残留对环境的危害具有现实意义。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
本发明实施例的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌株，该菌株命名为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏日期是2015年12月02日保藏编号为：CGMCC No.11776。
所述铜绿假单胞菌(P.fluorescens)菌株，菌落为无荚膜、无芽孢、能运动的革兰阴性菌，形态不一，成对排列或短链状，为专性需氧菌，最适宜生长温度为37℃，致病性铜绿假单胞菌在42℃时仍能生长，本菌生长对营养要求不高。
所述铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌株的培养过程为：将所述的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌体接种到直径60毫米平皿培养基上，在30-37℃，平皿培养基上生长3-5天；解剖刀刮取菌体，接入液体培养基中，2个培养皿刮取的菌丝接种到100ml培养液中，于30-37℃，240rmp/min转速条件 下振荡培养3-5天，获得包含其分泌的胞外降解酶的培养液，其为菌丝及菌液的混合菌剂。
所述的平皿LB培养基组成为：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，琼脂粉15g，蒸馏水1000ml，pH7.5。
所述的液体LB培养基组成为：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，蒸馏水1000ml，pH7.5。
在经过培养的培养液100ml中，加入最终浓度5-10mg/L的代森锰锌农药，于37℃，转速240rmp/min，摇床震荡培养，培养时间48小时以上。
如图1所示，本发明所提供的降解代森锰锌农药残留的菌株是烟草根部土壤中分离得到的，铜绿假单胞菌菌株分离方法如下：
S101：培养基配制：菌种保藏培养基(固体，1L)：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，琼脂粉15g，蒸馏水1000ml，pH7.5，加水定容至IL；菌种活化培养基(固体，1L)：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，琼脂粉15g，蒸馏水1000ml，pH7.5，加水定容至IL；液体培养基(液体，IL)：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，蒸馏水1000ml，pH7.5，加水定容至IL，培养基均在高压锅中121℃灭菌25分钟；
S102：菌种活化：挑去降解菌的菌丝，接种于加有菌种保藏培养基的60ml培养皿中，于37℃，培养4天，然后用手术刀刮取培养基表面菌丝，接菌入液体培养基中，于37℃，240转/分钟转速条件下振荡培养4-5天，获得包含其分泌的胞外降解酶的培养。
下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步的描述。
实施例1菌体的培养：用接种针挑取铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的菌丝接种到上述菌种活化培养基平皿中，在温度为37℃培养箱中培养4天，菌落为无荚膜、无芽孢、能运动的革兰阴性菌，形态不一，成对排列或短链状，为专性需氧菌。用手术刀刮取菌体，接种到装有500ml经121℃、0.1MPa下高压灭菌20min的培养液的锥形瓶中。再置于37℃，转速240rmp/min，摇床震荡培养4天，获得菌丝及菌液混合菌剂。
实施例2补充碳源固态培养基中代森锰锌残留的降解：在菌种活化培养基灭菌降温到40℃时，混入经过紫外灭菌30分钟的代森锰锌农药，浓度为5mg/L，充分混匀后，倒入直径60ml的培养皿中，每培养皿3ml培养基，该培养基呈粉红色。将实施例1中培养好的菌丝沿菌落边缘用6mm没直径的打孔器打成小片。待混有代森锰锌农药的培养基冷凝后，接入菌丝小片，菌丝向下紧贴培养基表面。置于37℃培养箱中培养10天，培养基中的粉红色已褪去，代森锰锌农药的分子结构被降解，培养基呈奶油色半透明状。
实施例3：降解菌菌剂对高浓度代森锰锌农药残留的降解
(1)在经过培养的培养液100ml中，加入5mg/L的代森锰锌农药，于37℃，转速240rmp/min，摇床震荡培养，以未经接种的培养液中加入相等浓度的代森锰锌农药作为对照组；
(2)每隔12h取样一次，取3ml样品置于50ml所述的铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)菌株在降解代森锰锌农药残留的应用：按如下步骤进行：
(1)在经过培养的培养液100-150ml中，加入终浓度5-10mg/L的代森锰锌农药，于30-37℃，转速240-260rmp/min，摇床震荡培养，以未经接种的培养液中加入相等浓度的代森锰锌农药作为对照组；
(2)每隔12h取样一次，取2-3ml样品置于5-10ml塑料离心管中，加入乙睛10-12ml，振荡20-30min，离心，取出上清液，重复3次，合并上清液，提取培养液中的代森锰锌农药残留，经佛罗里硅土固相萃取柱净化，在38-40℃下旋转蒸发仪浓缩，-20℃下冷冻干燥，再用少量乙睛溶解，进行气相色谱分析，计算降解率。
其降解率(％)＝(A-B)/A×100；
其中A为对照组代森锰锌农药残留值；B为经降解菌剂降解后的代森锰锌农药残留值。
以铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)为菌种，以杀菌剂为补充碳源，降解代森锰锌。ml塑料离心管中，加入乙睛10ml，在振荡器上振荡30min， 3000rmp/min下离心，取出上清液，重复3次，合并上清液，提取培养液中的代森锰锌农药残留后，在固相萃取装置中经佛罗里硅土固相萃取柱(规格：500mg3ml)净化，旋转蒸发仪浓缩(40℃以下)，-20℃下冷冻干燥，再用少量乙睛溶解提取到的农药残留，对其进行气相色谱分析。计算降解率：降解率(％)＝(A-B)/A×100，其中A为对照组代森锰锌农药残留值(48小时后残留值为4.7mg/L)，B为经降解菌剂降解后的代森锰锌农药残留值(48小时后残留值为0.5mg/L)。在该培养条件下，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)对高浓度代森锰锌农药残留的降解率48小时内可达90％以上。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌株，其特征在于，所述铜绿假单胞菌菌株保藏编号为：CGMCC No.11776。
2.一种如权利要求1所述的铜绿假单胞菌菌株的培养方法，其特征在于，所述培养方法包括：将铜绿假单胞菌菌体接种到直径60毫米平皿培养基上，在30-37℃，平皿培养基上生长3-5天；
解剖刀刮取菌体，接入液体培养基中，2个培养皿刮取的菌丝接种到100ml培养液中，于30-37℃，240rmp/min转速条件下振荡培养3-5天，获得包含其分泌的胞外降解酶的培养液，为菌丝及菌液的混合菌剂。
3.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述平皿培养基组成为：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，琼脂粉15g，蒸馏水1000ml，pH7.5。
4.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述液体培养基组成为：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，蒸馏水1000ml，pH7.5。
5.一种如权利要求1所述铜绿假单胞菌菌株在降解代森锰锌农药残留的应用。
6.如权利要求5所述的在降解代森锰锌农药残留的应用，其特征在于，所述应用将经过培养的铜绿假单胞菌菌株的培养液100ml中，加入浓度5-10mg/L的代森锰锌农药，于37℃，转速240rmp/min，摇床震荡培养，培养时间48小时以上。
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防治烟草黑胫病常用农药残留量与降解的研究;李义强;《中国烟草学报》;20110831;第17卷(第4期);全文相关 *

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