CN103589660B - 一株产雷公藤甲素的内生细菌 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株产雷公藤甲素的内生细菌，菌株号为LY-3，经鉴定该菌株为菠萝泛菌（Pantoea ananatis），其微生物保藏号是CGMCC No.7371。应用本发明雷公藤内生细菌菌株发酵生产雷公藤甲素，每升发酵液中可获得甲素82.1mg，本发明菌株所得雷公藤甲素含量高，可作为工业发酵用菌株，具有较高的应用价值。

Description

一株产雷公藤甲素的内生细菌

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株具有雷公藤甲素合成功能的内生细菌。

背景技术

早在100 多年前人们已经发现在健康植物组织的内部也有微生物存在,但由于它们生活在没有外在感染症状的健康植物组织内部,其存在和作用长期以来一直为人们所忽视。自20世纪30年代发现造成畜牧业重大损失的牲畜中毒是由于食用感染内生菌的牧草后,内生菌的研究才得以广泛地开展起来。内生菌 ( Endophyte)一词由De Bary于1866年首先提出,直到1992年Kloepper第一次提出了植物内生细菌的概念。相对其它学科来说,植物内生细菌的研究尚缺乏一定的系统性,但近年来,随着研究领域的不断拓宽和研究方法的不断深入,植物内生细菌所发挥的重要的生态和生理作用及其作为潜在生防资源和外源基因载体,在农业和医药领域中的巨大应用潜力,已逐渐成为国内外研究的热点。自1898年Vogl从黑麦草种子内分离出第一株内生细菌以来, 植物内生菌作为一种新的微生物资源受到了广泛的关注, 从内生菌中寻找和发现新的活性化合物已成为国内外研究的又一热点。有研究表明,内生细菌存在于所有植物种类当中, 药用植物内生细菌能够产生与宿主植物相同或相似的药用活性成分,特别是还发现许多新的活性成分, 这些活性成分被证明具有明显的抗癌、抗菌、抗氧化等活性。随着对药用植物资源研究的不断深入，一些寄生于药用植物体内的内生细菌被发现不但对宿主次生代谢产物的产生具有明显的促进作用，而且自身也会代谢产生相同或类似的植物源药用物质。从药用植物内部筛选与开发具有药用价值的内生菌资源，寻找新的抗菌活性物质，进而为植物源药物的生产开辟新途径已成为该领域的研究重点与热点。药用植物内生细菌有望部分代替药用植物作用, 从而解决药用植物资源短缺的问题。因此，利用药用植物内生细菌开发新药源具有极大的可能性。同时，内生细菌易于发酵培养，便于组织工业化生产，利用内生细菌发酵实现生物活性物质的工业化生产，可以提高产量、降低产品成本，满足市场的需求；另外，从内生细菌中提取单体代替以前的从植物中提取单体，还可解决许多植物因作为药用资源而被大量采伐引起的资源和生态危机，有利于珍稀濒危药用植物资源的保护。

雷公藤为卫矛科雷公藤属木质藤本植物, 是我国重要的传统药用植物。然而，雷公藤药用成分含量极低，加之野生资源蕴藏量少，人工栽培又存在生长缓慢，收获期长的问题，远远无法满足市场需求，已成为我国珍贵紧缺中药材。所以对雷公藤内生细菌的提取具有非常重要的意义，但是此方面的研究却未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一株能产生雷公藤甲素的内生细菌，可作为工业发酵用菌株，生产雷公藤甲素，其产量高，具有较高的应用价值。

一株产雷公藤甲素的内生细菌，其特征在于：该菌株为菠萝泛菌（Pantoea ananatis），菌株号为LY-3，已于2013年3月27日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，其微生物保藏号是CGMCC No.7371，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

形态鉴定：本发明的内生细菌从雷公藤组织上分离、纯化获得，其在平面培养基上，正面黄色，背面黄褐色，单个圆形；周生鞭毛；菌落常表现为圆形、湿润、光滑、质地均匀，如图1所示。

序列测定： LY-3菌株由宝生物工程（大连）有限公司16s rDNA扩增及序列测定，并通过在NCBI中比对，鉴定为菠萝泛菌（Pantoea ananatis）。

产物分析：LY-3菌株发酵产物中含有雷公藤甲素，生长48h后，其产生的雷公藤甲素浓度为0.0821g/L。

本发明的优点或有益效果：本发明中的雷公藤内生细菌LY-3具有合成雷公藤甲素的能力，且生长迅速，生产成本低，易于工业扩大化生产，同时可以保护野生植物资源，是生产雷公藤甲素的一种新方法。

附图说明

图1 是LY-3菌株在平面培养基上的形态

图2 是LY-3菌株的雷公藤甲素生成情况

图3是LY-3菌株16 S rDNA扩增结果，图中M：DL 2000 DNA Marker，1：LY-3菌株PCR扩增产物，+：正对照，-：负对照。

具体实施方式

    以下为本发明的具体实施例，进一步说明本发明，但本发明不仅限于此。

实施例1：雷公藤菌株的分离纯化

（1）雷公藤植物组织的准备：该菌株主要从野外雷公藤植株的不同组织器官获取，将植物分根、茎、叶进行采集。

（2）植物材料的表面消毒：叶片消毒采用70％酒精浸泡40s、0.1％升汞浸泡90s，茎消毒采用70％酒精浸泡30s、0.1％升汞浸泡60s，根部消毒采用70％酒精浸泡50s、0.1％升汞浸泡120s；

（3）雷公藤组织的表面无菌检测:将所采集的雷公藤组织经表面消毒后，直接种植于固体培养基上，置恒温箱培养，从中选出表面无任何菌种生长的组织体。该过程使用牛肉膏蛋白胨固体培养基，配方为牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂15-20g，无菌水1000ml，pH 7.0-7.2，培养温度为28℃，培养方式为平板培养，培养时间为36h；

（4）采用组织块法分离内生细菌：将采集到的雷公藤组织（根、茎、叶）样品分别用自来水冲洗晾干后 ,各称取3g , 70%酒精表面清洗后 ,再用0.1%升汞表面消毒1.5～3.0min,无菌水冲洗3-4次后晾干。每样品加10ml无菌水碾碎静止15min后,各取50ul涂平板 ,每处理重复3次 ,27℃黑暗培养48～72h ,计算菌落数。根据菌落形态、颜色等挑取单菌落 ,按常规方法纯化后保存 ,供测试鉴定。为了抑制放线菌生长，在配制牛肉膏蛋白胨培养基时于灭菌前每升培养基中加入2ml氯霉素。待组织块周围长出单菌落后，挑取形态不同的菌落移至新的牛肉膏蛋白胨培养基中进行点纯化。

（5）点纯化方法：将分离繁殖出的不同种类的内生细菌接入平板培养基进行纯化，经过2-3次点接纯化、转接后得到单一菌种菌株；采用的点接种纯化技术将消毒后的接种环轻微点击菌体表面，然后将其点击接种面，该方法较传统的点植培养法更易控制接种量，从而提高对内生细菌的接种效率与检出率。

（6）结果：从雷公藤植物组织器官中共分离得到雷公藤菌株40余株，经菌落鉴定确定分属于23个不同形态型的菌株（表1）。从表1可以看出，从雷公藤中分离得到的23株内生细菌中，由根分离出6株，占总菌数的26.09%；其次是由茎分离出的菌株为13株，占总菌数的56.52%；由叶分离出4株，占总菌数的17.39%。

实施例2：雷公藤内生细菌的筛选

（1）内生细菌的悬浮培养：将从雷公藤不同组织分离得到的内生细菌接入液体培养基，摇床振荡培养，培养温度为25℃，培养时间为48h。待菌液培养完成，经4℃冷冻离心（12000转，5分钟）获取细菌发酵液，再经0.22um的微孔滤膜过滤后，将最终获取的发酵液用于雷公藤甲素的测定。

液体培养基：使用牛肉膏蛋白胨液体培养基，其中牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂15-20g，无菌水1000ml，pH 7.0-7.2。

（2）雷公藤甲素的测定：利用高效液相色谱检测发酵培养液中雷公藤甲素的浓度，雷公藤甲素标准品购于成都普瑞法科技开发有限公司。液相色谱仪的参数设置为：流动相为65%甲醇，35%水；流速为1ml/min，检测波长218nm。检测前将流动相，超纯水，甲素标准溶液和发酵液样品预先超声波处理半小时。通过内生细菌发酵液与雷公藤甲素标准品的图谱比对，鉴定获取产雷公藤甲素的上述Pantoea ananatis功能菌株。

（3）结果：利用牛肉膏蛋白胨液体培养基分别对分离得到的23株雷公藤内生细菌进行悬浮培养，培养时间为48h，每2h取样对不同细菌发酵液甲素含量进行检测，结果从雷公藤叶中分离得到LY-3菌株，其发酵产物中含有雷公藤甲素，雷公藤甲素的生成情况如图2所示。从图2可知，LY-3菌株从培养初期就可向体外代谢产生雷公藤甲素，当生长48h后，其产生的雷公藤甲素浓度最高，约为0.0821g/L。

实施例3：LY-3菌株的鉴定

（1）变性

挑取菌体于50 ul TaKaRa Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR(Code No.D304)中变性后离心取上清作为模板。

反应条件：80℃，15 min

（2）PCR 扩增

使用TaKaRa 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit（Code No.D310），进行PCR 扩增目的片段。

取5ul进行3%琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示。

使用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0（Code No. D823A）切胶回收目的片段进行DNA 测序。

（3）测序

LY-3菌株 以16S SEQR1、Seq Internal 和Seq Reverse 为引物进行DNA 测序。

（4）实验结果

NCBI 比对结果见表2。

LY-3菌株经过鉴定属于菠萝泛菌（Pantoea ananatis），目前已保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.7371，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

SEQUENCE LISTING

 

<110> 福州农林大学

 

<120> 一株产雷公藤甲素的内生细菌

 

<160> 1

 

<170> BiSSAP 1.2

 

<210> 1

<211> 1300

<212> DNA

<213> 福州农林大学

 

<220>

<221> source

<222> 1..1300

<223> /organism="福州农林大学"

      /mol_type="DNA"

 

<400> 1

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ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac gatgtcgact tggaggttgt tcccttgagg     660

 

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cttcgggaac tstgagacag gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgttg tgaaatgttg     900

 

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tcaaaggaga ctgccggtga taaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa gtcatcatgg    1020

 

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ccttgtacac accgcccgtc acaccatggg agtgggttgc aaaagaagta ggtagcttaa    1260

 

ccttcgggag ggcgcttacc actttgtgat catgactggg                          1300

Claims (1)

1. 一株产雷公藤甲素的内生细菌，其特征在于：该菌株为菠萝泛菌（Pantoea ananatis），菌株号为LY-3，已于2013年3月27日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，其微生物保藏号是CGMCC No.7371。