CN104531553B - 一种具有灭螺活性的菠萝泛菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有灭螺活性的菠萝泛菌(Pantoea ananatis Z1)及其应用，其生物保藏号为CCTCC NO：M2014105，该细菌CCTCC NO：M2014105为泛菌属细菌，是从竹子叶片中筛选获得的，能够快速有效地杀灭钉螺；本发明的有益效果为：提供了一种可以杀灭钉螺的新细菌，可以直接作为生物灭螺剂使用，用该细菌CCTCC NO：M2014105制备的生物灭螺剂与传统化学灭螺剂相比，制备方法简单，成本低，对环境友好。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种微生物领域，尤其涉及的是一种具有灭螺活性的菠萝泛菌及其应用。
背景技术
钉螺作为血吸虫唯一的中间宿主,其繁衍和分布与血吸虫病的流行传播密切相关，所以抑螺灭螺被认为是阻止血吸虫病传播的重要途径。目前主要的灭螺剂是化学药物类，这类药物容易对环境造成不可逆破坏。近年来植物内微生物群落结构得到广泛的关注和研究，国内外学者经过研究发现植物体内存在大量的微生物,这些微生物在动物的生长、发育、健康等方面都起到重要作用，因此，本发明将研究的方向对准了植物内的微生物群落，希望能找到一种选择性强、对环境影响较小的生物灭螺剂，以替代传统化学灭螺剂，保护环境。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种具有灭螺活性的菠萝泛菌及其应用，以提供一种选择性强、对环境影响较小的新的生物灭螺剂。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种具有灭螺活性的菠萝泛菌，Pantoea ananatis Z1，为泛菌属细菌，该细菌于2014年3月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC；地址：中国武汉，武汉大学；邮编：430072)，其生物保藏号为CCTCC NO：M2014105，分类命名为：Pantoea ananatis Z1。
所述细菌CCTCC NO：M2014105是从竹子叶片中筛选获得的，其生物学特征如下：
(1)形态学特征：该细菌革兰氏染色为阴性，在光学显微镜16×100油镜下观察该细菌呈直杆状，周生鞭毛。
(2)培养特征：在YEB固体培养基中生长良好，菌落圆润，呈淡黄色，边缘整齐，透明，易挑起，在YEB液体培养基中培养时随着培养时间延长，培养液由透明的浅黄色变为浑浊的黄色。
所述细菌CCTCC NO：M2014105的16S rRNA序列如SEQ ID NO.1所示，其中所述16SrRNA序列有487个碱基，将序列输入GenBank数据库中进行BLAST比对处理，结果发现，该16SrRNA序列与菠萝泛菌MDM-02(Pantoea ananatis，MDM-02)的16S rRNA序列(GenBank登录号：HE716901.1)同源性为99％，结合形态学特征和培养特征鉴定该细菌CCTCC NO：M2014105为泛菌属的菠萝泛菌(Pantoea ananatis)。
本发明还提供了上述细菌CCTCC NO：M2014105在制备生物灭螺剂中的应用，所述细菌CCTCC NO：M2014105的发酵液作为生物灭螺剂杀灭钉螺。
本发明相比现有技术具有以下优点：本发明提供了一种具有灭螺活性的菠萝泛菌及其应用，该细菌CCTCC NO：M2014105能够作为生物灭螺剂快速有效地杀灭钉螺，可直接作为生物灭螺剂使用，用该细菌CCTCC NO：M2014105制备的生物灭螺剂与传统化学灭螺剂相比，制备方法简单，成本低，对环境友好。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
本实施例的一种具有灭螺活性的菠萝泛菌CCTCC NO：M2014105菌株的筛选，包括以下步骤：
1、培养基的配制：
1)YEB液体培养基：牛肉浸膏为5.0g/L，酵母膏为1.0g/L，蛋白胨为5.0g/L，MgSO4·7H2O为4g/L，蔗糖为5.0g/L，pH7.0～7.5；
2)YEB固体培养基：将上述YEB液体培养基中加入15g/L的琼脂，获得YEB固体培养基。
2、筛选步骤：
1)在无菌条件下，取新鲜竹叶，用体积分数为75％的酒精浸泡1分钟，0.1％升汞浸泡12分钟，无菌生理盐水冲洗3遍后，将竹叶研磨，获得组织碎末；
2)将步骤1)的组织碎末接种到100mL的YEB液体培养基中，37℃培养12～16小时，培养的转速为180rpm，获得培养液；
3)按体积计，将步骤2)的培养液用无菌生理盐水依次稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7，获得稀释液；
4)将步骤3)的稀释液涂于YEB固体培养基上，37℃培养12～16小时，挑取单菌落进行纯化，即获得所述细菌CCTCC NO：M2014105。
3、分子鉴定：
将上述纯化后的细菌CCTCC NO：M2014105接种到YEB固体培养基上，37℃培养12～16小时，挑取单菌落进行菌落PCR，所述菌落PCR的引物为细菌16S rRNA通用引物27F和R518，所述引物的序列为：
SEQ NO.2：27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
SEQ NO.3：R518：ATTACCGCGGCTGCTGG
所述菌落PCR的扩增程序为：94℃预变性3分钟，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，循环30次，72℃继续延伸7分钟，获得PCR扩增产物；
将PCR扩增产物用质量分数为1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测，用PCR纯化试剂盒进行纯化，获得细菌CCTCC NO：M2014105的16S rRNA，将16S rRNA送至测序公司测序，结果如SEQ ID NO.1所示，将16S rRNA序列输入GenBank数据库，用BLAST软件进行比对处理，结果发现，该16S rRNA序列与菠萝泛菌MDM-02(Pantoea ananatis，MDM-02)的16S rRNA序列(GenBank登录号：HE716901.1)同源性为99％，结合形态学特征和培养特征鉴定该细菌CCTCC NO：M2014105为泛菌属的菠萝泛菌。
实施例2
本实施例为所述细菌CCTCC NO：M2014105灭螺活性的测定：
1、灭螺剂的制备：
将细菌CCTCC NO：M2014105接种于100mL的YEB液体培养基中，37℃下培养24小时，培养的转速为180rpm，得到种子液，将1mL种子液转移到100mL的YEB液体培养基中，37℃培养12～16小时，培养的转速为180rpm，获得发酵液，即为生物灭螺剂。
2、灭螺剂稀释液的配制：将灭螺剂用去氯水配制成体积分数为10％的溶液，即为灭螺剂稀释液。
3、灭螺活性的测定：
将野外采集的钉螺在25℃下培养3天后，选择活力好的钉螺用去氯水冲洗3遍，将钉螺分成三组，每组三袋，每袋20只钉螺，每组选择一袋置于配置好的灭螺剂稀释液中分别浸泡2天，3天，4天，取出后用去氯水冲洗干净，室温恢复饲养3天，清水浸泡2小时，取出观察钉螺有无软体伸出，若有软体伸出则为活钉螺，无软体伸出的用敲击法敲击钉螺壳体，判断死活，同时设置去氯水为阴性对照组。
4、结果：
细菌CCTCC NO：M2014105的灭螺活性测定结果如下表1所示：
表1：细菌CCTCC NO：M2014105的灭螺活性测定结果表
从表1中可以看出，该细菌CCTCC NO：M2014105杀灭钉螺的效率随着时间的增加而增加，在处理2天的情况下，钉螺的平均死亡率为53.33％，在处理3天的情况下，钉螺的平均死亡率达到了90％，在处理4天的情况下，钉螺的平均死亡率达到了98.33％，可以看出，该细菌CCTCC NO：M2014105具有很好的杀灭钉螺的效果，其杀灭钉螺的效率随着时间的延长而增加。
Claims (4)
1.一种具有灭螺活性的菠萝泛菌，Pantoea ananatis Z1，其特征在于，所述菠萝泛菌的生物保藏号为CCTCC NO：M2014105。
2.根据权利要求1所述的一种具有灭螺活性的菠萝泛菌，其特征在于，所述菠萝泛菌的16S rRNA序列如SEQ ID NO.1所示。
3.一种如权利要求1所述的具有灭螺活性的菠萝泛菌在制备生物灭螺剂中的应用。
4.根据权利要求3所述的一种具有灭螺活性的菠萝泛菌在制备生物灭螺剂中的应用，其特征在于，所述菠萝泛菌的发酵液作为生物灭螺剂杀灭钉螺。
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Granted publication date: 20170510 Termination date: 20171127 |
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