CN109486709B - 一株提高玉米耐盐能力的樊氏盐单胞菌菌株jpt10-1及其菌剂与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株提高玉米耐盐能力的樊氏盐单胞菌菌株JPT10‑1及其菌剂与应用，该菌株于2018年8月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2018548。该菌株能够耐受高浓度NaCl，可以在盐浓度为3000 mmol/L的环境中生长，生长速率较快。本发明还公开了利用该菌株制成的菌剂以及该菌剂在提高玉米耐盐能力方面的应用。将该菌株的菌悬液接入盐胁迫下的玉米幼苗后可以显著提高其根长、株高等生物量和根系活力、光合速率和抗氧化酶体系等各项生理指标。同时，该菌株可以改变部分土壤酶的活性，使土壤肥力和植物对营养元素的利用率提高。本发明提供的菌株对于降低玉米在盐碱地生长受到的胁迫有重要的应用价值。

Description

一株提高玉米耐盐能力的樊氏盐单胞菌菌株JPT10-1及其菌 剂与应用

技术领域

本发明属于微生物与植物互作技术领域，具体涉及一株提高玉米耐盐能力的樊氏盐单胞菌菌株JPT10-1及其菌剂与应用。

背景技术

土壤盐渍化是影响农业生产与生态环境的一个重要因素，严重影响作物的种植与生产。根据联合国教科文组织（UNESCO）和联合国粮食及农业组织（FAO）不完全统计，世界盐渍土面积达9.548×10⁸ hm²，除南极洲未调查外，其余各洲均有盐渍土分布，并以每年1.0×10⁶-1.5×10⁶ hm²的速度在增长。在我国，盐碱土的分布范围广、面积大、类型多，日渐成为限制我国农业发展的主要因素，如何改良和利用大面积的盐碱地，提高植物的耐盐碱能力是目前亟待解决的问题。因此，增强农作物的耐盐能力，提高农作物的产量已成为我国农业持续高效发展的重大课题。

许多研究者希望可以通过培育耐盐品种来解决土壤盐渍化的问题，可是由于植物在耐盐性方面遗传和生理上的复杂性，并未得到理想的成果。然而，近些年研究发现植物内生菌对提高植物的耐盐性具有较好的效果，不仅可以改善土壤状况还可以提高植物的长势，其产生的许多活性物质对植物具有生长发育调节作用。内生菌主要从以下几点来帮助植物抵御盐胁迫：1.诱导活性氧清除系统产生抗氧化酶，以降低植物体内活性氧含量从而减少氧化胁迫对植物的危害；2.改变渗透调节物质的含量，减少渗透胁迫对植物造成的生理干旱，提高植物抗盐碱能力；3.提高光合作用，从而增强植物的抗盐碱性。因此，通过微生物与植物的共生来增强植物的耐盐性具有良好的应用前景。近些年来，对植物内生菌自身耐盐机理的相关研究较多，但在高盐浓度下筛到的可以帮助植物抵御胁迫的内生菌较少。而且绝大多数内生菌都面临以下两点问题：1.外源菌株在植物体内无法很好地定殖或生长不稳定；2.内生菌株在植物体外拥有的一些理化性质（或产生某种物质）在植物体内可能被削弱甚至消失，在实际应用上受到了很大的限制。

因此，从环境中筛选耐盐性好、可以在植物体内定殖并且可以帮助植物抵御高盐环境胁迫的植物内生菌，对于植物在盐碱地的种植和提高农业生产技术有重要的研究意义。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一株提高玉米耐盐能力的樊氏盐单胞菌菌株JPT10-1及其菌剂与应用。本发明将该菌株JPT10-1制备成菌悬液用来提高盐胁迫下玉米植株的生长状况。

为实现以上目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一株提高玉米耐盐能力的樊氏盐单胞菌菌株JPT10-1，其分类命名为樊氏盐单胞菌Halomonas ventosae，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM 2018548。

进一步的：所述菌株JPT10-1的菌落呈圆形，菌体呈乳白色，不透明，表明光滑湿润，边缘规则，无晕环。

进一步的：所述菌株JPT10-1适宜生长的温度为18~37℃，pH为5.5~8，盐浓度为1000-3000 mmol/L。

进一步的：所述菌株JPT10-1提高玉米耐盐能力的适宜盐浓度为150 mmol/L-250mmol/L。

本发明还提供了含有所述的樊氏盐单胞菌菌株JPT10-1的菌剂。

进一步的：所述菌剂包括菌粉和菌悬液，所述菌悬液中的含菌量为1×10¹⁰~3×10¹¹个/ml。

进一步的：所述菌悬液通过以下方法获得：将菌株JPT10-1接种于盐浓度为1000-3000 mmol/L的高盐LB液体培养基中，振荡培养48-60 h，培养至OD₆₀₀在0.5-1.0制得所述菌悬液。

本发明还提供了所述的含有樊氏盐单胞菌菌株JPT10-1的菌剂在提高玉米耐盐能力中的应用。

进一步的：将所述菌悬液接入到盐浓度为150 mmol/L -250 mmol/L的玉米幼苗根际土壤中，接入后每隔2~4天用盐浓度为150 mmol/L-250 mmol/L的盐水浇灌一次，互作10-20天。

进一步的：所述菌悬液和玉米互作的适应温度为25-30 ℃，pH为6.5-7.5。

本发明的优点和有益效果是：本发明所述的樊氏盐单胞菌（Halomonas ventosae）JPT10-1是从黄河三角洲盐碱地中筛选并经过分离和纯化得到的可以提高玉米耐盐能力的耐盐菌株，具有性状稳定、培养简单、效果明显、适用条件较广以及不会造成环境污染等优点。本发明的樊氏盐单胞菌（Halomonas ventosae）JPT10-1能够在高盐环境中生长且性能稳定，该菌株可以在高盐LB固体/液体培养基中生长，生长温度为18~37℃，pH为5.5~8，盐浓度为1000-3000 mmol/L，最适生长温度为28 ℃，最适pH为7，最适盐浓度为2000 mmol/L。

本发明利用微生物与植物互作的方法提高植物的抗盐能力，具有不会改变植物性状与基因，效率高且效果明显，不会对环境造成其他影响等优点。

本发明所述的菌株不会对玉米造成任何伤害，可以很好地与玉米共生，而且其来源于盐碱地碱蓬的根际土，对人和动物不具有致病性。

本发明将所述的菌株制成菌悬液来浇灌玉米，较菌粉而言可以快速达到土壤与玉米需要的菌体浓度并且不需要搅拌即可很好地与土壤混合在一起，可以在玉米种植期间进行浇灌。本发明所述的菌悬液具有活菌数高，菌悬液中菌种适应能力强，菌株性能稳定，制备方法简单，成本低等特点，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明分离得到的樊氏盐单胞菌菌株JPT10-1在高盐LB固体培养基上的菌落照片；

图2为菌株的进化树；

图3为不同盐浓度下樊氏盐单胞菌菌株JPT10-1的生长曲线；

图4为盐胁迫下玉米幼苗接入JPT10-1菌株后生物量的变化（*代表有差异显著性）；

图5为盐胁迫下玉米幼苗接入JPT10-1菌株后活性氧清除系统（抗氧化酶体系）与活性氧含量的变化（*代表有差异显著性）；

图6为盐胁迫下玉米幼苗接入JPT10-1菌株后根系活力与渗透调节物质的变化（*代表有差异显著性）；

图7为盐胁迫下玉米幼苗接入JPT10-1菌株后光合作用的变化（*代表有差异显著性）；

图8为盐胁迫下玉米幼苗接入JPT10-1菌株后土壤物理性质的变化（*代表有差异显著性）；

图9为盐胁迫下玉米幼苗接入JPT10-1菌株后土壤各项酶活力的变化（*代表有差异显著性）。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细阐述，但是引用实施例仅用于说明本发明，本发明所保护范围不限于此。

实施例1：樊氏盐单胞菌Halomonas ventosae JPT10-1的分离和纯化

将来源于黄河口碱蓬根际土土壤样品1 g加入到10 mL无菌水中混匀制成10^-1稀释液，吸取1 ml 10^-1稀释液加到9 ml无菌水混匀制成10^-2稀释液，以此类推制作10^-3、10^-4、10^-5稀释液，分别取10^-3、10^-4、10^-5稀释液涂布于高盐LB培养基（NaCl含量为2000 mmol/L），置于28 ℃恒温培养箱中培养5 d，选取不同形态特征的单菌落进行纯化，将得到的纯单菌落制成菌悬液接种于玉米幼苗中，观察玉米幼苗的长势并测定其生物量进行验证，选取可以显著提高玉米幼苗耐盐能力的菌株，其中一株定名为JPT10-1，将其保藏于甘油管和高盐LB固体斜面培养基中。

实施例2：樊氏盐单胞菌Halomonas ventosae JPT10-1的鉴定

1、菌株的形态学及生理生化特征

菌株JPT10-1在高盐LB固体平板上的菌落形态如图1所示为圆形、乳白色、不透明、表面光滑湿润、边缘整齐，产少量淡黄色色素。分别取不同生长阶段（对数期和稳定期）的菌株进行革兰氏染色均呈阴性，在光学显微镜下观察形态均呈椭圆形。菌株JPT10-1的生长温度为18~37℃，pH为5.5~8，盐浓度为1000-3000 mmol/L，最适生长温度为28 ℃，最适pH为7，最适盐浓度为2000 mmol/L。

2、菌株的16S rDNA鉴定：

用基因组提取试剂盒提取菌株JPT10-1的基因组，以其为模板，以16S rDNA通用引物27F（5’-GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3’）和1492R（5’-ACG GAT ACC TTG TTA CGACTT -3’）引物进行扩增16S rDNA序列。

PCR反应体系为：10×buffer 2.5微升，dNTP 2微升，上游引物27F 0.5微升，下游引物1492R 0.5微升，Taq酶0.15微升，DNA模板1微升，超纯水18.35微升。PCR程序为：94 ℃预变性10 min，94 ℃变性40 s，53 ℃退火40 s，72 ℃延伸90 s，35个循环，72 ℃延伸10min，10 ℃保温。1%琼脂糖凝胶电泳结果表明PCR产物条带单一大小约为1.5 kb，将PCR产物送至上海铂尚测序公司测序，测序结果见序列表SEQ ID No.1的核苷酸序列，将测序结果在EZBioCloud（https://www.ezbiocloud.net/identify）上进行序列比对，发现该菌株与樊氏盐单胞菌的序列相似性为99.28%，如图2所示，因此判断该菌株为盐单胞菌菌属。

本发明将筛选到的盐单胞菌菌株JPT10-1进行菌种保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心（CCTCC）；地址：湖北省武汉市武昌珞珈山，武汉大学保藏中心；保藏日期：2018年8月17日， Halomonas ventosae JPT10-1的保藏编号为CCTCC M 2018548。

实施例3：菌株JPT10-1菌悬液的制备

所述樊氏盐单胞菌JPT10-1的菌悬液的制备方法包括以下步骤：将纯化后的菌株JPT10-1按照1%的接种量接种到高盐LB液体培养基中（盐浓度为1000 mmol/L，其余成分同LB液体培养基），在28 ℃ 180 rpm恒温振荡摇床中培养48 h后，取少量菌悬液于1.5 ml离心管中测量OD₆₀₀，若小于0.5则继续培养至0.5-1.0之间，放入4 ℃冰箱中保存即可。制得的所述菌悬液中的JPT10-1含菌量为1×10¹⁰~3×10¹¹个/ml。

实施例4：盐胁迫下玉米幼苗接入菌悬液后各项生理指标的变化

取实施例3中制备的所述菌悬液50 ml接入种植在含盐量为200 mmol/L土壤的玉米幼苗根际中互作（玉米的生长环境为22℃，16 h光照，8 h黑暗），接入后每3天用200mmol/L的盐水浇灌一次，互作14天之后取样测定玉米的各项生理指标。

如图4所示，盐胁迫下接入樊氏盐单胞菌JPT10-1菌悬液玉米幼苗较未接菌玉米幼苗的生物量（株高、根长、鲜重和干重）有显著的提高。根据图5可以判断该菌株对玉米幼苗的根系有较大的帮助，其根系活力较未接菌的玉米幼苗提高了40%，但是玉米幼苗的渗透调节物质变化不是很大，游离脯氨酸含量甚至有所降低，从这可以看出玉米幼苗受到的盐胁迫已经减小。分析图6可以看出该菌株可以显著提高玉米幼苗的活性氧清除系统，尤其是CAT（过氧化氢酶）活性，较未接菌的玉米幼苗提高了715.3%，从活性氧的含量也可以看出玉米幼苗受到的氧化胁迫显著降低。最后从图7显示的数据来看，接入菌悬液的玉米幼苗的光合作用显著提高，光合效率较未接菌的玉米幼苗提高了64.5%，其PSII最大PS II最大光化学效率Fv/Fm（叶绿素荧光参数）也有了显著提高。综上所述，玉米幼苗接入菌悬液后可以显著提高其对盐胁迫的抵御能力，在农业方面具有非常广阔的应用前景。

实施例5：盐胁迫下玉米幼苗接入菌悬液后土壤理化指标的变化

取实施例3中制备的所述菌悬液50 ml接入种植在含盐量为200 mmol/L土壤的玉米幼苗根际中互作（玉米的生长环境为22℃，16 h光照，8 h黑暗），接入后每3天用200mmol/L的盐水浇灌一次，互作14天之后取土壤样品测定各项理化指标。

从图8中可以看出接入菌株后土壤的基本指标并未发生显著变化，菌株不会对玉米的种植环境有过多影响。图9的结果表明接入菌悬液后土壤中磷元素和碳元素的含量会有所提高并且植物对磷的利用可能会提高，土壤中脱氢酶含量显著提高，可以帮助提高玉米根系活力，而且FDA水解酶的活性也显著提高，证明土壤中微生物的丰度和健康指数有了一定的提高。上述结果表明，接入菌悬液后土壤比之前相对肥沃一些并且不会影响植物的生长环境。

实施例6：盐胁迫下玉米幼苗施加菌悬液的方法

将大田土、蛭石和珍珠岩以质量比2:1:1的比例混匀作为种植玉米的土壤。将玉米种子在28-37 ℃的条件下催芽2-3天，种植到育苗盆中距离土壤表面约1-2 cm处，用少量清水浇灌土壤使其湿润，放在光照培养室（生长环境为22℃，16 h光照，8 h黑暗）中培养，当玉米出芽2-3 cm时，玉米幼苗用200 mmol/L的NaCl溶液将土壤浇透，之后将本发明制备的所述菌悬液（含菌量为1×10¹⁰~3×10¹¹个/ml）施加到对应的玉米育苗盆中，每盆50 mL，做好标记。施加菌悬液当天为第0天，之后每3天用200 mmol/L的盐水浇灌一次，将菌悬液与玉米互作至第10-20天时，取样测定各项理化指标，实验结果证明菌悬液提高了玉米的耐盐能力。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 山东农业大学

<120> 一株提高玉米耐盐能力的樊氏盐单胞菌菌株JPT10-1及其菌剂与应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1407

<212> DNA

<213> 樊氏盐单胞菌(Halomonas ventosae)

<400> 1

catgcagtcc gagcggaacg atggagcttt gctccaggcg tcgagcggcg gacgggtgag 60

taatgcatag gaatctgccc ggtagtgggg gataacctgg ggaaacccag gctaataccg 120

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gttagcctaa cttcggaggg cgatcac 1407

Claims (10)

1.一株提高玉米耐盐能力的樊氏盐单胞菌（Halomonas ventosae）菌株JPT10-1，其特征在于：其分类命名为樊氏盐单胞菌（Halomonas ventosae），保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2018548。

2.根据权利要求1所述的樊氏盐单胞菌菌株JPT10-1，其特征在于：所述菌株JPT10-1的菌落呈圆形，菌体呈乳白色，不透明，表明光滑湿润，边缘规则，无晕环。

3. 根据权利要求1所述的樊氏盐单胞菌菌株JPT10-1，其特征在于：所述菌株JPT10-1适宜生长的温度为18~37℃，pH为5.5~8，盐浓度为1000-3000 mmol/L。

4. 根据权利要求1所述的樊氏盐单胞菌菌株JPT10-1，其特征在于：所述菌株JPT10-1提高玉米耐盐能力的适宜盐浓度为150 mmol/L ~250 mmol/L。

5.含有权利要求1所述的樊氏盐单胞菌菌株JPT10-1的菌剂。

6.根据权利要求5所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂为菌悬液，所述菌悬液中的含菌量为1×10¹⁰~3×10¹¹个/ml。

7. 根据权利要求6所述的菌剂，其特征在于：所述菌悬液通过以下方法获得：将菌株JPT10-1接种于盐浓度为1000-3000 mmol/L的高盐LB液体培养基中，振荡培养48-60 h，培养至OD₆₀₀在0.5-1.0制得所述菌悬液。

8.权利要求6所述的含有樊氏盐单胞菌菌株JPT10-1的菌悬液在提高玉米耐盐能力中的应用。

9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于：将所述菌悬液接入到盐浓度为150 mmol/L ~250 mmol/L的玉米幼苗根际土壤中，接入后每隔2~4天用盐浓度为150 mmol/L ~250mmol/L的盐水浇灌一次，互作10-20天。

10. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述菌悬液和玉米互作的适应温度为25~30 ℃，pH为6.5~7.5。