CN106479916B - 一种阴沟肠杆菌菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种阴沟肠杆菌菌株及其应用，所述阴沟肠杆菌菌株的保藏编号为：CGMCC No.12819。本发明是从烟草根部土壤中分离得到的一株高效降解杀菌剂‑‑甲霜灵的阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)，实验表明该菌能够在LB培养基中利用甲霜灵作为唯一碳源和能源而生长，并使甲霜灵降解；在添加外源营养物的液体培养条件下，该菌48h能够将混入培养基中5mg/L的高浓度甲霜灵降解90％以上，并且在较宽的pH范围内均有较好的降解效果；由本发明技术方案生产的降解菌剂能够高效降解水体、土壤及烟叶表面的甲霜灵农药残留，保护和修复生态环境，弥补了目前利用阴沟肠杆菌降解甲霜灵农药残留的技术空白。

Description

一种阴沟肠杆菌菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种阴沟肠杆菌菌株及其应用。
背景技术
化学农药具有适用范围广、防治对象多、生产成本低、防治效果好以及经济效益高等优点，其广泛适用极大地促进了现代农业的发展，提高了农业生产的劳动效率和机械化程度。但是不可避免地，大量使用农药杀伤昆虫天敌和有益微生物、使有害生物产生抗性、造成人、畜中毒、易对植物产生药害等问题，进入环境中的化学农药，一部分可通过阳光照射、土壤中微生物等的作用，而逐步降解失效；另一部分最终会通过“食物链”的作用，进入人体，对人造成长期危害。各类化学农药目前已广泛进入全球空气及大气沉降物、水体、土壤、底泥级生物体等自然环境中，成为环境中无所不在的污染物，因此探索对农药残留进行有效降解的方法成为研究人员长期努力的一个重要研究方向。而在该领域研究中，近年来广泛兴起的使用微生物对农药残留进行生物降解成为热点领域，通过微生物作用将农药大分子分解成小分子化合物，并使其丧失活性。由于微生物个体小、繁殖迅速、比表面大等特点。它们较之其它生物更易适应环境，并可通过自然突变产生新菌种，产生新的酶系统，具有新的代谢功能，从而可参与对人工新合成化合物的降解与转化作用，因此微生物对降解农药残留具有巨大潜力。
假单胞菌科的1属，兼性厌氧的革兰氏染色阴性无芽胞、无荚膜杆菌，呈粗短杆状。菌体大小(0.6～1.1)×(1.2～3)微米。有周身鞭毛(6～8条鞭毛)动力阳性。大多数菌的适温为30℃。DNA中的G+C克分子含量为58～70％。阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)属于假单胞菌属rRNA I群荧光DNA同源组,是植物根际最普遍的微生物类群具有分布广、数量多、营养需要简单、繁殖快、竞争定殖力强的特点。世界许多国家均有人报道分离到抗植物病害的阴沟肠杆菌，而且许多菌株能产生几种活性物质，抗多种植物病害。其作用机制包括：抗生素的作用、噬铁素对铁的营养竞争、有效的根际定殖等。随着分子生物学的广泛渗入，通过对这些作用机制的遗传性状进行分析，采用遗传工程加以改良，使得阴沟肠杆菌具有更诱人的生防效果。因此获得对化学农药的高效降解菌株并运用于实践，对降低农药残留对环境的危害具有现实意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种阴沟肠杆菌菌株及其应用，旨在解决降解高浓度甲霜灵农药残留的问题，提供一种高效降解高浓度甲霜灵农药残留的微生物菌种,该菌能高效降解高浓度甲霜灵农药残留，该菌可以用于水体、土壤及表面残留的甲霜灵的生物降解。
本发明是这样实现的，一种阴沟肠杆菌菌株，所述阴沟肠杆菌菌株保藏编号为：CGMCC No.12819。
本发明的另一目的在于提供一种阴沟肠杆菌菌株的培养方法，所述培养方法包括：将所述的阴沟肠杆菌菌丝体接种到直径60毫米平皿培养基上，在28-30℃，平皿培养基上生长3-5天；
解剖刀刮取菌体，接入液体培养基中，2个培养皿刮取的菌丝接种到100ml培养液中，于28-30℃，240rmp/min转速条件下振荡培养3-5天，获得包含其分泌的胞外降解酶的培养液，其为菌丝及菌液的混合菌剂；
优选的，所述的平皿LB培养基组成为：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，琼脂粉15g，蒸馏水1000ml，pH7.5；
优选的，所述的液体LB培养基组成为：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，蒸馏水1000ml，pH7.5。
本发明的另一目的在于提供一种所述阴沟肠杆菌菌株降解水体、土壤及烟叶表面的甲霜灵农药残留的应用。
优选的，在经过培养的培养液100ml中，加入最终浓度5-10mg/L的甲霜灵农药，于30℃，转速240rmp/min，摇床震荡培养，培养时间48小时以上。
本发明提供的阴沟肠杆菌菌株，是烟草根部土壤中分离得到的一株高效降解杀菌剂—甲霜灵的阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)。该阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)是一株具有极高活力，其培养方法简单，生长速度快，不易变异，实验表明该菌能够在LB培养基中利用甲霜灵作为唯一碳源和能源而生长，并使甲霜灵降解；在添加外源营养物的液体培养条件下，该菌48h能够将混入培养基中5mg/L的甲霜灵降解90％以上，并且在较宽的pH范围内均有较好的降解效果，充分说明该菌可以用于水体、土壤及表面残留的甲霜灵的生物降解，具有农药残留生物降解的工业化应用前景，也可以作为研究阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)对甲霜灵农药残留降解机制的模式菌株。
附图说明
图1是本发明实施例提供的阴沟肠杆菌菌株分离方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例的阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)菌株，该菌株命名为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏日期是2016年8月8日，保藏编号为：CGMCC No.12819。
所述阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)菌株为粗短杆状，0.6μm～1.1μm×1.2μm～3.0μm，革兰氏染色阴性，无芽孢无荚膜，有周身鞭毛(6～8条鞭毛)动力阳性，能运动，兼性厌氧。在KMB培养基上培养24h后可形成1.2mm菌落，菌落可产生红色色素，圆形，表面凸起，光滑，较粘稠，易挑起，边缘整齐，为化能异养型，能够利用植物根分泌的大部分养分迅速定殖于植物的根部，是最有潜力的促进植物生长的根围细菌之一。
所述阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)菌株培养过程为：将所述的阴沟肠杆菌菌丝体接种到直径60毫米平皿培养基上，在28-30℃，平皿培养基上生长3-5天；解剖刀刮取菌体，接入液体培养基中，2个培养皿刮取的菌丝接种到100ml培养液中，于28-30℃，240rmp/min转速条件下振荡培养3-5天，获得包含其分泌的胞外降解酶的培养液，其为菌丝及菌液的混合菌剂；
所述的平皿LB培养基组成为：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，琼脂粉15g，蒸馏水1000ml，pH7.5；
所述的液体LB培养基组成为：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，蒸馏水1000ml，pH7.5。
在经过培养的培养液100ml中，加入最终浓度5-10mg/L的甲霜灵农药，于30℃，转速240rmp/min，摇床震荡培养，培养时间48小时以上。
如图1所述，本发明提供的阴沟肠杆菌菌株，是烟草根部土壤中分离得到的一株高效降解杀菌剂—甲霜灵的阴沟肠杆菌菌株。阴沟肠杆菌菌株分离方法如下：
S101：培养基配制：菌种保藏培养基(固体，1L)：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，琼脂粉15g，蒸馏水1000ml，pH7.5；加水定容至IL；菌种活化培养基(固体，1L)：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，蒸馏水1000ml，pH7.5，加水定容至IL；液体培养基(液体，IL)：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，蒸馏水1000ml，pH7.5，加水定容至IL，培养基均在高压锅中121℃灭菌25分钟；
S102：菌种活化：挑去降解菌的菌丝，接种于加有菌种保藏培养基的60ml培养皿中，于28-30℃，培养3-5天，然后用手术刀刮取培养基表面菌丝，接菌入液体培养基中，于28-30℃，240转/分钟转速条件下振荡培养3-5天，获得包含其分泌的胞外降解酶的培养。
下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步的描述。
实施例1菌体的培养：用接种针挑取阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)菌丝接种到上述菌种活化培养基平皿中，在温度为28℃培养箱中培养4天，菌株为粗短杆状，0.6μm～1.1μm×1.2μm～3.0μm，革兰氏染色阴性，无芽孢、无荚膜，有周身鞭毛(6～8条鞭毛)动力阳性，能运动，兼性厌氧。用手术刀刮取菌体，接种到装有500ml经121℃、0.1MPa下高压灭菌20min的培养液的锥形瓶中。再置于30℃，转速240rmp/min，摇床震荡培养4天，获得菌丝及菌液混合菌剂。
实施例2补充碳源固态培养基中甲霜灵残留的降解:在菌种活化培养基灭菌降温到40℃时，混入经过紫外灭菌30分钟的甲霜灵农药，浓度为5mg/L，充分混匀后，倒入直径60ml的培养皿中，每培养皿3mL培养基，该培养基呈粉红色。将实施例1中培养好的菌丝沿菌落边缘用6mm没直径的打孔器打成小片。待混有甲霜灵农药的培养基冷凝后，接入菌丝小片，菌丝向下紧贴培养基表面。置于30℃培养箱中培养10天，培养基中的粉红色已褪去，甲霜灵农药的分子结构被降解，培养基呈奶油色半透明状。
实施例3:降解菌菌剂对高浓度甲霜灵农药残留的降解
(1)在经过培养的培养液100ml中，加入5mg/L的甲霜灵农药，于30℃，转速240rmp/min，摇床震荡培养，以未经接种的培养液中加入相等浓度的甲霜灵农药作为对照组；
(2)每隔12h取样一次，取3ml样品置于5OmL所述阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)降解水体、土壤及烟叶表面的甲霜灵农药残留的应用如下：塑料离心管中，加入乙睛1OmL，在振荡器上振荡30min，3000rmp/min下离心，取出上清液，重复3次，合并上清液，提取培养液中的甲霜灵农药残留后，在固相萃取装置中经佛罗里硅土固相萃取柱(规格:500mg3ml)净化，旋转蒸发仪浓缩(40℃以下)，-20℃下冷冻干燥，再用少量乙睛溶解提取到的农药残留，对其进行气相色谱分析。
其降解率：降解率(％)＝(A-B)/A×100。
其中A为对照组甲霜灵农药残留值(48小时后残留值为4.7mg/L)，B为经降解菌剂降解后的甲霜灵农药残留值(48小时后残留值为0.5mg/L)。
以阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)为菌种，以杀菌剂为补充碳源，降解甲霜灵。取3ml样品置于5OmL塑料离心管中，加入乙睛1OmL，在振荡器上振荡30min，3000rmp/min下离心，取出上清液，重复3次，合并上清液，提取培养液中的甲霜灵农药残留后，在固相萃取装置中经佛罗里硅土固相萃取柱(规格:500mg3ml)净化，旋转蒸发仪浓缩(40℃以下)，-20℃下冷冻干燥，再用少量乙睛溶解提取到的农药残留，对其进行气相色谱分析。计算降解率:降解率(％)＝(A-B)/A×100，其中A为对照组甲霜灵农药残留值(48小时后残留值为4.7mg/L)，B为经降解菌剂降解后的甲霜灵农药残留值(48小时后残留值为0.5mg/L)。在该培养条件下，阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)对高浓度甲霜灵农药残留的降解率48小时内可达90％以上。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)菌株，其特征在于：所述阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.12819。
2.如权利要求1所述的阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)菌株降解水体、土壤及烟叶表面的甲霜灵农药残留的应用。
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