CN106701612B - 一株荧光假单胞菌菌株及其应用 - Google Patents

一株荧光假单胞菌菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一株荧光假单胞菌菌株及其应用，该菌株命名为荧光假单胞菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期是2015年12月2日，保藏编号为PFpE1501；该荧光假单胞菌菌株具有在水体农药残留及表面残留的甲霜灵的生物降解的工业化应用前景。

Description

一株荧光假单胞菌菌株及其应用
技术领域
本发明属于环境微生物领域，具体涉及一株荧光假单胞菌菌株及其应用。
背景技术
化学农药具有适用范围广、防治对象多、生产成本低、防治效果好以及经济效益高等优点，其广泛适用极大地促进了现代农业的发展，提高了农业生产的劳动效率和机械化程度。但是不可避免地，大量使用农药杀伤昆虫天敌和有益微生物、使有害生物产生抗性、造成人、畜中毒、易对植物产生药害等问题，进入环境中的化学农药，一部分可通过阳光照射、土壤中微生物等的作用，而逐步降解失效;另一部分最终会通过“食物链”的作用，进入人体，对人造成长期危害。各类化学农药目前已广泛进入全球空气及大气沉降物、水体、土壤、底泥级生物体等自然环境中，成为环境中无所不在的污染物，因此探索对农药残留进行
有效降解的方法成为研究人员长期努力的一个重要研究方向。而在该领域研究中，近年来广泛兴起的使用微生物对农药残留进行生物降解成为热点领域，通过微生物作用将农药大分子分解成小分子化合物，并使其丧失活性。由于微生物个体小、繁殖迅速、比表面大等特点。它们较之其它生物更易适应环境，并可通过自然突变产生新菌种，产生新的酶系统，具有新的代谢功能，从而可参与对人工新合成化合物的降解与转化作用，因此微生物对降解农药残留具有巨大潜力。
假单胞菌科的 1属。专性需氧的革兰氏染色阴性无芽胞、无荚膜杆菌，呈杆状或略弯。菌体大小(0.5～1)×(1.5～4)微米。具端鞭毛，能运动。有些株产生荧光色素或（和）红、蓝、黄、绿等水溶性色素，不发酵糖类。大多数菌的适温为30℃。DNA中的G+C克分子含量为58～70%。荧光假单胞菌(P. fluorescens)属于假单胞菌属rRNA I群荧光DNA同源组, 是植物根际最普遍的微生物类群具有分布广、数量多、营养需要简单、繁殖快、竞争定殖力强的特点。世界许多国家均有人报道分离到抗植物病害的荧光假单胞菌，而且许多菌株能产生几种活性物质，抗多种植物病害。其作用机制包括：抗生素的作用、噬铁素对铁的营养竞争、有效的根际定殖等。随着分子生物学的广泛渗入，通过对这些作用机制的遗传性状进行分析，采用遗传工程加以改良，使得荧光假单胞菌具有更诱人的生防效果。因此获得对化学农药的高效降解菌株并运用于实践，对降低农药残留对环境的危害具有现实意义。
目前尚无利用荧光假单胞菌(P.fluorescens)降解甲霜灵农药残留研究的文献报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一株荧光假单胞菌菌株及其在高浓度甲霜灵农药残留降解中的应用，该菌株具有在水体农药残留及表面残留的甲霜灵的生物降解的工业化应用前景。
为解决上述问题，本发明采用如下技术方案：
一株荧光假单胞菌菌株，该菌株命名为荧光假单胞菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期是2015年12月2日，保藏编号为CGMCC NO.11777。
进一步的，所述菌株为具有以下主要特征的菌株：
菌株为杆状，0.3μm～0.8μm×1.0μm ～1.1μm，革兰氏染色阴性，无芽孢，单极生鞭毛，能运动，在KMB培养基上培养24h后可形成1.2mm菌落，菌落可产生橙色色素，圆形，表面凸起，光滑，较粘稠，易挑起，边缘整齐，为化能异养型，能够利用植物根分泌的大部分养分迅速定殖于植物的根部，是最有潜力的促进植物生长的根围细菌之一。
一种荧光假单胞菌菌株在降解甲霜灵农药残留的应用。
进一步的，以荧光假单胞菌为菌种，以杀菌剂为补充碳源，降解甲霜灵。
进一步的，所述荧光假单胞菌菌株的培养过程包括以下步骤:
1）将所述的荧光假单胞菌菌株菌丝体接种到直径60毫米平皿培养基上；
2）在28-30℃，平皿培养基上生长3-5天；
3）解剖刀刮取菌体，接入液体培养基中，2个培养皿刮取的菌丝接种到100ml培养液中；
4）于28-30℃和140rmp/min转速的条件下振荡培养3-5天，获得包含其分泌的胞外降解酶的培养液，其为菌丝及菌液的混合菌剂；
进一步的，所述的平皿LB培养基组成为:蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，琼脂粉15g，蒸馏水1000ml，pH7.5；所述的液体LB培养基组成为: 蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，蒸馏水1000ml，pH7.5。
进一步的，在经过步骤3）培养的培养液100ml中时，加入最终浓度5-10mg/L的甲霜灵农药，于30℃，转速240rmp/min，摇床震荡培养，培养时间48小时以上。
本技术是从烟草根部土壤中分离得到的一株高效降解卵菌杀菌剂—甲霜灵的荧光假单胞菌(P.fluorescens)，实验表明该菌能够在LB培养基中利用甲霜灵作为唯一碳源和能源而生长，并使甲霜灵降解；在添加外源营养物的液体培养条件下，该菌48h能够将混入培养基中5mg/L的高浓度甲霜灵降解90%以上，并且在较宽的pH范围内均有较好的降解效果；充分说明该菌可以用于水体及表面残留的甲霜灵的生物降解。
本发明的有益效果为：从烟草根部土壤中分离得到的一株高效降解卵菌杀菌剂—甲霜灵的荧光假单胞菌(P.fluorescens)，该荧光假单胞菌(P.fluorescens)是一株具有极高活力，其培养方法简单，生长速度快，不易变异，实验表明该菌能够在LB培养基中利用甲霜灵作为唯一碳源和能源而生长，并使甲霜灵降解;在添加外源营养物的液体培养条件下，该菌48h能够将混入培养基中5mg/L的甲霜灵降解90%以上，并且在较宽的pH范围内均有较好的降解效果，充分说明该菌可以用于水体及表面残留的甲霜灵的生物降解，具有农药残留生物降解的工业化应用前景，也可以作为研究荧光假单胞菌(P.fluorescens)对甲霜灵农药残留降解机制的模式菌株。
具体实施方式
为使对本发明的结构特征及所达成的功效有更进一步的了解与认识，用以较佳的实施例配合详细的说明，说明如下：
1.培养基配制:
1)菌种保藏培养基(固体，1L): 胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，琼脂粉15g，蒸馏水1000ml，pH7.5，加水定容至IL;
2)菌种活化培养基(固体，1L): 胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，琼脂粉15g，蒸馏水1000ml，pH7.5，加水定容至IL;
3)液体培养基(液体，IL): 胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，蒸馏水1000ml，pH7.5，加水定容至IL。
以上培养基均在高压锅中121℃灭菌25分钟。
2.菌种活化:挑去降解菌的菌丝，接种于加有菌种保藏培养基的60ml培养皿中，于28℃，培养4天，然后用手术刀刮取培养基表面菌丝，接菌入液体培养基中，于30℃，240转/分钟转速条件下振荡培养4-5天，获得包含其分泌的胞外降解酶的培养液;由本发明技术方案生产的菌剂能够有效降解甲霜灵农药残留。
实施例1
菌体的培养:用接种针挑取荧光假单胞菌(P.fluorescens)的菌丝接种到上述菌种活化培养基平皿中，在温度为28℃培养箱中培养4天，菌株为杆状，0.3μm～0.8μm×1.0μm～1.1μm，革兰氏染色阴性，无芽孢，单极生鞭毛，能运动；用手术刀刮取菌体，接种到装有500ml经121℃、0.1MPa下高压灭菌20min的培养液的锥形瓶中；再置于30℃，转速240rmp/min，摇床震荡培养4天，获得菌丝及菌液混合菌剂。
实施例2
补充碳源固态培养基中甲霜灵残留的降解:在菌种活化培养基灭菌降温到40℃时，混入经过紫外灭菌30分钟的甲霜灵农药，浓度为5mg/L，充分混匀后，倒入直径60ml的培养皿中，每培养皿3mL培养基，该培养基呈粉红色。将实施例1中培养好的菌丝沿菌落边缘用6mm没直径的打孔器打成小片；待混有甲霜灵农药的培养基冷凝后，接入菌丝小片，菌丝向下紧贴培养基表面。置于30℃培养箱中培养10天，培养基中的粉红色已褪去，甲霜灵农药的分子结构被降解，培养基呈奶油色半透明状。
实施例3
降解菌菌剂对高浓度甲霜灵农药残留的降解：
1)在经过权利要求3培养的培养液100ml中，加入5mg/L的甲霜灵农药，于30℃，转速240rmp/min，摇床震荡培养，以未经接种的培养液中加入相等浓度的甲霜灵农药作为对照组；
2)每隔12h取样一次，取3ml样品置于5OmL塑料离心管中，加入乙睛1OmL，在振荡器上振荡30min，3000rmp/min下离心，取出上清液，重复3次，合并上清液，提取培养液中的甲霜灵农药残留后，在固相萃取装置中经佛罗里硅土固相萃取柱(规格:500mg3ml)净化，旋转蒸发仪浓缩(40℃以下)，-20℃下冷冻干燥，再用少量乙睛溶解提取到的农药残留，对其进行气相色谱分析；计算降解率:降解率(%)=(A-B)/A×100，其中A为对照组甲霜灵农药残留值(48小时后残留值为4.7mg/L)，B为经降解菌剂降解后的甲霜灵农药残留值(48小时后残留值为0.5mg/L)。在该培养条件下，荧光假单胞菌(P.fluorescens)对高浓度甲霜灵农药残留的降解率48小时内可达90%以上。
本发明的有益效果为：从烟草根部土壤中分离得到的一株高效降解卵菌杀菌剂—甲霜灵的荧光假单胞菌(P.fluorescens)，该荧光假单胞菌(P.fluorescens)是一株具有极高活力，其培养方法简单，生长速度快，不易变异，实验表明该菌能够在LB培养基中利用甲霜灵作为唯一碳源和能源而生长，并使甲霜灵降解;在添加外源营养物的液体培养条件下，该菌48h能够将混入培养基中5mg/L的甲霜灵降解90%以上，并且在较宽的pH范围内均有较好的降解效果，充分说明该菌可以用于水体及表面残留的甲霜灵的生物降解，具有农药残留生物降解的工业化应用前景，也可以作为研究荧光假单胞菌(P.fluorescens)对甲霜灵农药残留降解机制的模式菌株。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一株荧光假单胞菌菌株，其特征在于：该菌株命名为荧光假单胞菌（Pseudomonasfluorescens），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期是2015年12月2日，保藏编号为CGMCC NO.11777。
2.一种如权利要求1所述的荧光假单胞菌菌株在降解甲霜灵农药残留的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：以荧光假单胞菌为菌种，以杀菌剂为补充碳源，降解甲霜灵。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述荧光假单胞菌菌株的培养过程包括以下步骤:
1）将所述的荧光假单胞菌菌株菌丝体接种到直径60毫米平皿培养基上；
2）在28-30℃，平皿培养基上生长3-5天；
3）解剖刀刮取菌体，接入液体培养基中，2个培养皿刮取的菌丝接种到100ml培养液中；
4）于28-30℃和140rmp/min转速的条件下振荡培养3-5天，获得包含其分泌的胞外降解酶的培养液，其为菌丝及菌液的混合菌剂。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的平皿LB培养基组成为:蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，琼脂粉15g，蒸馏水1000ml，pH7.5；所述的液体LB培养基组成为: 蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，蒸馏水1000ml，pH7.5。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：在经过步骤3）培养的培养液100ml中时，加入最终浓度5-10mg/L的甲霜灵农药，于30℃，转速240rmp/min，摇床震荡培养，培养时间48小时以上。
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