CN101961083A - 蛭弧菌蛭质体作为除菌剂在清洗水果中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蛭弧菌蛭质体作为除菌剂在清洗水果中的应用，其特征在于，将蛭弧菌蛭质体菌液作为除菌剂添加在清洗用水中，然后对水果进行清洗；或者将蛭弧菌蛭质体菌液喷洒在水果加工环境中，对加工环境进行清洗；所述蛭弧菌为蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDM01，由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M208066，保藏日期为2008年4月28日。该蛭弧菌蛭质体对水果表面的常见致病菌有很强的消除作用，致病菌的消除率达93％以上，且蛭质体具有制备、保存更为方便，环境耐受力强，杀菌作用时间更久等优点。

Description

蛭弧菌蛭质体作为除菌剂在清洗水果中的应用

技术领域

本发明涉及蛭弧菌蛭质体的应用，特别是在消除水果表面及其加工过程中携带的菌落总数和致病菌的应用。

背景技术

食品安全已经成为全世界共同关注的问题，国内外的各种资料和统计数据表明微生物是引起食源性疾病的罪魁祸首。随着“生食疗法”逐渐被视为一种健康的时尚，因生食水果导致的大规模食物中毒频繁爆发，其原因大多是沙门氏菌，大肠杆菌，、单核李斯特菌，金黄色葡萄球菌等的污染。因此，通过清洗杀菌技术，清除或杀灭果蔬中的病原微生物，达到预防和控制果蔬引起的传染病的目的，对果蔬进行保鲜非常重要。

目前，水果的工业化清洗过程，主要是采用物理清洗和化学杀菌剂配合的方式，首先根据水果的不同类型选择不同的清洗设备，比如DT5A1型清洗机、鼓风式清洗机、XGJ-2型清洗机，主要原理是水果与清洗水之间的摩擦与相互作用，同时辅助于刷辊，将水果表面污物洗净；其次选择适合的清洗剂，现市场上销售的清洗剂种类很多，有洗涤、去污作用的，有杀菌功能的，但传统的清洗方法对除去果蔬中的泥土效果虽好，但对微生物的消除效果不明显。目前使用的水果杀菌剂多为氯系杀菌剂，但此类不仅不能杀灭水果表面存在的致病菌比如大肠杆菌O157:H7菌株、沙门氏菌、志贺氏菌、单核李斯特菌、金黄色葡萄球菌等，而且还会与食品中某些成份反应生成氯化物，对人体产生危害，清洗过后的废水中含有由于氯的残留，与水中有机物反应生成三氯甲烷，不仅污染水体、大气，还会对人体产生致癌作用。

因此开发一种新型的除菌剂作为水果的清洗方法，从而保证水果加工的安全性，是十分必要的。

蛭弧菌是寄生于其他细菌，并能导致宿主细菌裂解的一类细菌；比一般细菌小，能通过细菌滤器，有类似噬菌体的作用；革兰氏染色呈阴性，可裂解(潜在)致病菌。蛭弧菌的生活史可分为脱离宿主细菌、具有鞭毛、自由游泳的游泳体状态和在宿主细菌内生长发育的蛭质体状态。游泳体蛭弧菌侵入宿主的周质空间的同时失去鞭毛，宿主细胞和蛭弧菌一起，成为蛭质体。与游泳体相比，蛭质体具有制备、保存更为方便，环境耐受力强，作用时间持久的特点，使得它可被应用于保证食品的卫生安全上。

已有的研究表明，作为一种有益微生物制剂，无论是在食品工业还是在(海洋)水产养殖等领域，蛭弧菌的应用均是安全的。例如：在国外，Lenz andHespell(1978)研究发现，蛭弧菌及对动物及人的细胞不具侵染性[Lenz R.W.，Hespell R.B.Attempts to grow bedellovibrios micurgically-injected into animalcells.Archives of Microbiology，1978，119(3)：245-248]。在国内，林茂等(2006)研究了蛭弧菌对鱼类细胞的作用，发现它对鱼类细菌没有侵染作用[林茂，杨先乐，薛晖，曹海鹏，邱军强。蛭弧菌BDH2102对鱼类细胞及病原菌的作用。微生物学通报，2006，33(1)：7-11]。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种蛭弧菌蛭质体在消除水果表面及其加工环境中携带的菌落总数和致病菌的应用。

为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：

一种蛭弧菌，其特征在于，该菌株为蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDM01，由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M208066，保藏日期为2008年4月28日。

所述蛭弧菌BDM01(CCTCC M208066)由蛭弧菌BDJ01(CCTCCM208011)进行紫外诱变得到，对其进行负染后于电子显微镜下形态观察：该蛭弧菌呈单细胞，弧形，大小为1.7×1.0μm，端生鞭毛，鞭毛长度为3.5μm；将其以双层平板法于28℃培养三天可形成直径3-4mm的透明圆形噬菌斑。

蛭弧菌BDM01蛭质体作为除菌剂在清洗水果中的应用，将该蛭弧菌蛭质体菌液作为除菌剂添加在清洗用水中，然后对水果进行清洗。

优选地，所述蛭弧菌蛭质体菌液在清洗用水中的浓度至少为10²pfu/mL。

优选地，所述蛭弧菌蛭质体采用发酵方法进行制备，具体步骤如下：

在含有10mL×10¹⁰cfu/mL嗜水气单胞菌的100mL DNB(dilute nutrientbroth)液体培养基(营养肉汤0.8g，酪蛋白酸水解物0.5g，酵母精提物0.1g，溶于1000mL蒸馏水中，pH值为7.2～7.6)中接入10mL 10³pfu/mL蛭弧菌BDM01，于20～35℃、150～300rpm培养36～48h，培养液经4℃6000～8000rpm离心15～20min后，去除含蛭弧菌游泳体的上清，沉淀即是蛭质体；然后用5mL DNB液体培养基、无菌水、生理盐水或0.2mol/L pH值为7.2～7.6的磷酸盐缓冲液悬浮，得到的蛭弧菌蛭质体菌液。

优选地，将蛭弧菌蛭质体菌液加入清洗用水中，蛭弧菌蛭质体的浓度范围为10²～10⁹pfu/mL。

优选地，清洗时先将水果放入蛭弧菌蛭质体菌液中浸泡20～40min，以消除水果中的致病菌。

蛭弧菌BDM01蛭质体作为除菌剂在水果加工环境中的应用，将蛭弧菌蛭质体菌液作为除菌剂喷洒在水果加工环境中，使蛭弧菌蛭质体的浓度至少达到10²pfu/mL，使用量为30-50mL/m²；水果加工环境包括水果的加工车间、清洗设备及水果的传送带及水果加工设备等。

所述致病菌为大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、单核李斯特菌(Listeriamonocytogenes)等。所述沙门氏菌包括鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)和猪霍乱沙门氏菌(Salmonella cholerae-suis)。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：

1、本发明蛭弧菌蛭质体作为消毒剂在消除水果携带的总菌、致病菌中效果显著，如图1、2所示，致病菌的消除率达93％以上。

2、在加工或食用前用蛭弧菌消除水果表面致病菌安全性好

蛭弧菌消除水果携带的致病菌的方法是生物的方法，蛭弧菌可侵染、裂解宿主细菌的特性使之适合作为抑止或清除生物体及其环境中致病菌的生物净化因子，且其在裂解完宿主细菌后，会因饥饿而自动消亡，因此对人和动物无毒副作用，也为水果的绿色加工生产提供保障。

3、本发明应用于水果的加工环境、加工与清洗设备消毒杀菌，方便、安全且效果好。

4、本发明为消除水果所携带的食源性致病菌提供一种新的方法，并适合推广应用于水果的从农田到餐桌的整个产业链，特别有利于减少或消除化学药物如杀菌剂的残留，确保水果的优质，从根本上避免水果食物中毒事件的发生，保证消费者的健康。

5、与蛭弧菌游泳体相比，蛭质体具有制备、保存更为方便，环境耐受力强，杀菌作用时间更久等优点。这些优点使得蛭弧菌蛭质体作为抑止或清除生物体及其环境中致病菌的生物净化因子，能在水果加工前完成致病菌的生物消除工作，同时也可以减少或消除食物中毒的机率，减少或消除药物残留的可能，提高产品质量安全系数，保护消费者的健康。

附图说明

图1为不同浓度蛭弧菌蛭质体作为除菌剂在消除苹果表面菌落总数的试验效果比较图。

图2为不同浓度蛭弧菌蛭质体作为除菌剂在消除苹果表面致病菌的试验效果比较图。

图3为不同浓度蛭弧菌蛭质体作为除菌剂在消除香瓜表面菌落总数的试验效果比较图。

图4为不同浓度蛭弧菌蛭质体作为除菌剂在消除香瓜表面致病菌的试验效果比较图。

图5为清洗用水中加入不同的除菌剂后杀菌效果比较。

图6为10²pfu/mL蛭弧菌蛭质体对加工环境、加工与清洗设备的除菌效果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。

所述方法对大肠杆菌、沙门氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌等致病菌均有效，但为实验结果及图表数据表达清晰，致病菌以大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌为例。

实施例1

苹果表面常见致病菌的消除

(1)消除苹果表面致病菌的蛭弧菌蛭质体的制备

所述蛭弧菌BDM01由蛭弧菌BDJ01进行紫外诱变得到，对其进行负染后于电子显微镜下形态观察：蛭弧菌BDM01呈单细胞，弧形，大小为1.7×1.0μm，端生鞭毛，鞭毛长度为3.5μm；将其以双层平板法于28℃培养三天可形成直径3-4mm的透明圆形噬菌斑。

蛭弧菌蛭质体制备：在1个装有100mL NB(Nutrient broth)液体培养基的锥形瓶中接种10mL×10¹⁰cfu/mL嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila，购于广东省微生物所菌种保藏中心，编号GIM1.172)，250rpm、30℃摇床培养24小时，培养液分别于4℃、5000rpm离心15min，弃上清。沉淀菌体用5mL无菌水重新悬浮，之后加入到1个装有100mL DNB液体培养基(dilute nutrientbroth)液体培养基(营养肉汤0.8g，酪蛋白酸水解物0.5g，酵母精提物0.1g，溶于1000mL蒸馏水中，pH值为7.2～7.6)的锥形瓶中，菌液再加入10mL浓度为10³pfu/mL蛭弧菌BDM01，恒温摇床250rpm、30℃培养36h。培养液分别于4℃6000rpm离心20min，去除含蛭弧菌游泳体的上清，沉淀即是蛭弧菌蛭质体；然后用5mL DNB液体培养基悬浮，得到浓度10¹¹pfu/mL的蛭弧菌蛭质体菌液。

(2)苹果携带的常见致病菌的制备

于4瓶各含100mL普通营养肉汤培养基中，分别接种10mL×10¹⁰cfu/mL大肠杆菌(Escherichia coli，购于广东省微生物研究所，编号GIM1.137)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium，购于广东省微生物研究所，编号GIM1.237)、单增李斯特菌(Listeria monocytogenes，购于广东省微生物研究所，编号GIM1.228)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，购于广东省微生物研究所，编号GIM1.142)，摇床培养，160rpm 28℃，培养12-16h。增殖培养液经6000rpm、4℃离心20min，弃上清液，沉淀菌体用5mL无菌pH7.2的PBS(磷酸盐缓冲溶液)悬浮，得到浓度为10⁹cfu/ml的原液，最后制备上述四种菌的混合液，使混合液中每种菌的终浓度为10³cfu/ml。

(3)蛭弧菌蛭质体应用消除加工前苹果携带的菌落总数及致病菌

实验分为实验组和对照组。

所有对照组和实验组的苹果先经75％酒精杀菌后浸泡到步骤(2)制备好的混合菌液中1min，取出后沥干，然后：

对照组：三个苹果，为三个平行样，将苹果浸泡在自来水中，30min；

实验组：将苹果分别浸泡在A、B、C、D、E五组自来水中，并向五组自来水中分别添加蛭弧菌蛭质体，并且其浓度分别达到10²pfu/mL、10³pfu/mL、10⁴pfu/mL、10⁶pfu/mL、10⁸pfu/mL，浸泡30min，每个浓度设三个平行样。然后检测菌落总数，致病菌的数目。

检测方法：取苹果，放入无菌绞碎机中，同时加入50mL的无菌磷酸盐缓冲液，搅碎，苹果搅碎后取出10mL混合液放于无菌离心管中。根据GB4789.2-2010菌落总数用营养琼脂培养基检测、根据国标4789.38-2008大肠杆菌用VRB-MUG(中性红-胆盐培养基)培养基检测、根据国标4789.4-2010沙门氏菌用BS(亚硫酸铋琼脂)培养基检测、根据国标4789.30-2010单核李斯特菌用李斯特氏菌显色培养基检测、根据国标4789.10-2010金黄色葡萄球菌用Baird-Parker琼脂平板检测。

检测结果如图1，2所示：

蛭弧菌蛭质体消除实验组总菌与致病菌的残留量要远远低于单纯用自来水冲洗的残留量，而且蛭弧菌浓度越高，消除总菌与致病菌的效果越好，最低浓度10²pfu/mL对于致病菌的消除率已经达到93％，而且蛭弧菌在水果表面通过裂解而消除病原菌，不会对水果的质量产生影响，也不会导致除菌剂在水果中的残留。除菌快速，高效，安全使得蛭弧菌在消除水果携带的致病菌方面应用潜力巨大，将其作为一种水果的新型的清洗方法既能达到除菌的目的，也能保护水果制品的食用安全。

实施例2

香瓜表面常见致病菌的消除

步骤(1)、(2)和(3)均同实施例1

检测结果如图3，4所示：

利用蛭弧菌蛭质体作除菌剂消除实验组的菌落总数与致病菌后的残留量要远远低于单纯用自来水冲洗的残留量，而且蛭弧菌浓度越高，消除菌落总数与致病菌的效果越好，最低浓度10²pfu/mL对于致病菌的消除率已经达到94％。而蛭弧菌在水果表面通过裂解而消除病原菌，不会对水果的质量产生影响，也不会导致除菌剂在水果中的残留。除菌快速，高效，安全使得蛭弧菌在消除水果携带的致病菌方面应用潜力巨大，将其作为一种水果的新型的清洗方法既能达到除菌的目的，也能保护水果制品的食用安全。

实施例3

新型除菌剂与传统除菌剂除菌效果的比较

步骤(1)(2)均同实施例1

步骤(3)不同除菌剂对致病菌的消除试验

选用李子作为作用水果，分为实验组与对照组。

所有对照组和实验组的李子先经75％酒精杀菌后浸泡到步骤(2)制备好的混合菌液中1min，取出后沥干，然后采用不同除菌剂进行除菌处理。

对照组：取三个李子，为三个平行样，将李子浸泡在自来水中；

实验组：分四组，每小组取三个李子，为三个平行样

(1)将李子浸泡在含有浓度为10²pfu/mL蛭弧菌蛭质体的清洗用水；

(2)将李子浸泡在加入过氧化氢的清洗用水，浓度达到5％；

(3)将李子浸泡在通入臭氧的清洗用水，浓度达到0.8mg/L；

(4)将李子浸泡在加入次氯酸钠的清洗用水，浓度达到80mg/L；

浸泡30min后取出沥干，然后每30min检测李子表面残留的致病菌的总菌数。

检测结果如图5所示

最初的杀菌效果为过氧化氢＞臭氧＞次氯酸钠＞蛭弧菌蛭质体，但是随着时间的延长，过氧化氢、臭氧、次氯酸钠的除菌效果逐渐减弱，致病菌又再次滋生，而蛭弧菌则持续消除致病菌，原因是蛭弧菌制剂通过菌裂解消除致病菌需要一个过程，所以起效慢，但是较为持久，可以预防致病菌的再次寄居和繁殖。同时由于过氧化氢的强氧化性有损水果的品质，臭氧杀菌装置耗费过大而次氯酸钠则对热不稳定且容易与有机物反应生成氯化物残留，因此蛭弧菌蛭质体可以成为理想的水果杀菌剂，其通过裂解消除致病菌属于生物防治，使用安全不会对环境造成污染，也不会对水果品质造成影响。

实施例4

蛭弧菌蛭质体在消除水果的加工环境、清洗设备携带的常见致病菌的应用试验

试验包括以下具体步骤及其条件：

步骤(1)及(2)均同实施例1

步骤(3)致病菌的消除试验

由于不同水果的加工采用的加工生产线是相同的所以本发明的应用方法，可适合于各种水果的加工。

采用本发明的应用方法，分成多个不同试验组，对水果加工车间地面和墙体、运输水果的传送带及水果清洗设备的表面，均匀喷洒清水和最低浓度10²pfu/mL的蛭弧菌游泳体，喷洒使用量则按试验组的不同分别为10mL/m²、30mL/m²、、50mL/m²、70mL/m²、或100mL/m²，每天喷洒一次，连续喷洒两天，在随后的环境病菌检测结果如图6所示，仅在喷洒量为10mL/m²试验组中检测到少量的鼠伤寒沙门氏菌，其他喷洒量的试验组没有检测到沙门氏菌，单核李斯特菌，金黄色葡萄球菌及大肠杆菌等常见致病菌。本试用研究的结果表明蛭弧菌在较低浓度消除水果加工过程中致病菌方面的效果十分显著，同时考虑到清洗水果的成本，30-50mL/m²可以作为最适宜的喷洒范围。由此可见，蛭弧菌作为除菌剂可以广泛地推广应用于水果的清洗加工过程中。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.蛭弧菌蛭质体作为除菌剂在清洗水果中的应用，其特征在于，将蛭弧菌蛭质体菌液作为除菌剂添加在清洗用水中，然后对水果进行清洗；所述蛭弧菌为蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDM01，由中国典型培养物保藏中心保藏，其简称为CCTCC，保藏编号为CCTCC NO：M208066，保藏日期为2008年4月28日。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蛭弧菌蛭质体在清洗用水中的浓度至少为10²pfu/mL。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述蛭弧菌蛭质体菌液的制备步骤如下：

在含有10mL×10¹⁰cfu/mL嗜水气单胞菌的100mL DNB液体培养基中接入10mL 10³pfu/mL蛭弧菌BDM01，于20～35℃、150～300rpm培养36～48h，培养液经4℃6000～8000rpm离心15～20min后，去除含蛭弧菌游泳体的上清，沉淀即是蛭弧菌蛭质体；然后用DNB液体培养基、无菌水、生理盐水或0.2mol/LpH值为7.2～7.6的磷酸盐缓冲液悬浮，得到的蛭弧菌蛭质体菌液。

4.根据权利要求1或2或3所述的应用，其特征在于，将所述蛭弧菌游泳体菌液加入到清洗用水中，蛭弧菌蛭质体的浓度范围为10²～10⁹pfu/mL。

5.根据权利要求1或2或3所述的应用，其特征在于，所述清洗时先将水果放入蛭弧菌蛭质体菌液中浸泡20～40min。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，将蛭弧菌蛭质体菌液作为除菌剂喷洒在水果加工环境中，使蛭弧菌蛭质体的浓度至少达到10²pfu/mL，使用量为30-50mL/m²。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述蛭弧菌蛭质体菌液的浓度10²～10⁹pfu/mL。

8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述蛭弧菌蛭质体菌液的制备步骤如下：

在含有10mL 10¹⁰cfu/mL嗜水气单胞菌的100mL DNB液体培养基中接入10mL10³pfu/mL蛭弧菌BDM01，于20～35℃、150～300rpm培养36～48h，培养液经4℃6000～8000rpm离心15～20min后，去除含蛭弧菌游泳体的上清，沉淀即是蛭弧菌蛭质体；然后用5mL DNB液体培养基、无菌水、生理盐水或0.2mol/L pH值为7.2～7.6的磷酸盐缓冲液悬浮，得到的蛭弧菌BDM01蛭质体菌液。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，在加入蛭弧菌游泳体菌液的清洗用水中还可加入去污剂组成清洗剂，所述清洗剂中蛭弧菌蛭质体的浓度范围为10²～10⁹pfu/mL。

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