CN106754751B - 一种肠出血性大肠杆菌噬菌体及其应用 - Google Patents

一种肠出血性大肠杆菌噬菌体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种肠出血性大肠杆菌噬菌体及其应用；一种噬菌体菌株，其特征在于：该噬菌体菌株保藏号为CCTCC NO：M 2016539，于2016年9月29日保藏于中国武汉大学中国典型培养物保藏中心，分类命名为肠出血性大肠杆菌噬菌体vB_ECM_MIE，Entero‑hemorrhagic Escherichia coli O157:H7 phage vB_ECM_MIE；对EHEC具有高效杀菌能力。

Description

一种肠出血性大肠杆菌噬菌体及其应用
技术领域
肠出血性大肠杆菌(EHEC)是能引起人的出血性腹泻和肠炎的一群大肠埃希氏菌，其以O157:H7血清型为代表菌株。
背景技术
近年来，食源性致病菌—大肠杆菌0157:H7己成为世界性公共卫生问题，严重危害人类健康，造成大量经济损失，并对社会稳定和环境安全造成极大程度的负面影响据报道，仅在美国每年由于大肠杆菌0157:H7引起的食源性疾病即达73,000例，造成经济损失0.7亿美元/年。出血性大肠杆菌主要包括O157:H7、O26:Hll和0111:NM，其中血清型0157是引起出血性结肠炎的主要致病菌，据报道，90％的溶血性尿毒综合征病例都是由其亚型0157:H7引起，因此有关大肠杆菌0157:H7的研究受到普遍关注。大肠杆菌0157:H7对人的致病力强，感染剂量低，感染载体含菌量达10个/g以上即可引起感染。病菌侵入人体后，可以引起出血性或非出血性腹泻、轻度发热或无发热、出血性结肠炎(Hemorrhagic colitis)和溶血性尿毒综合症(Hemolytic uremic syndrome,HUS)及血栓性血小板减少紫癜(Thromboricthromobocytopenic purpura,TTP)等严重并发症，严重者可导致死亡。
如何消除大肠杆菌0157:H7对食品的污染，减少或切断病原菌可能的传播途径，已成为世界范围内亟待解决的问题之一。研究表明，牛、猪等大家畜是大肠杆菌0157:H7的主要寄存宿主，致病菌常通过厩肥污染的生肉及其制品或奶制品进入食物链，造成人群感染，而误食污染动物粪便的成品蔬菜已成为当前0157:H7流行病感染爆发的又一主要原因，因此牛及其饲养环境是大肠杆菌0157:H7的主要寄居场所及重要的传播源。建立切实可行的饲养场控制策略可以有效地从源头上降低甚至完全消除大肠杆菌0157:H7的流行,减少和切断致病菌通过食物链和环境污染等途径传播,降低大肠杆菌0157:H7传染疾病的发生和流行，值得注意的是,与人被感染的情况不同，绝大多数排泄或携带病原菌的牛都不表现任何明显的临床症状，这就为预防感染和临床诊治带来巨大挑战。随着抗生素应用于食源性动物所带来的一系列诸如抗生素残留，多重耐药菌株的层出不 穷以及耐药性转移等弊端的出现，寻找有效、绿色、安全、无公害的抗菌或抑菌制剂替代抗生素控制动物及生产加工过程中大肠杆菌0157:H7势在必行。"
噬菌体是一种可以感染细菌的病毒,裂解性噬菌体在感染细菌后,能引起宿主细胞破裂,利用这一特性可以将噬菌体应用于抗菌治疗"在抗生素发现并广泛应用之前，人们就已经开始尝试应用噬菌体防治细菌感染，并取得了一系列可喜的成果。20世纪四十年代后，由于人们发现抗生素能够有效治疗多种细菌性疾病，因此噬菌体疗法的研究被取而代之。随着抗生素抗性问题的不断出现，应用抗生素进行抗菌治疗面临着巨大挑战，寻找安全绿色的抗生素替代品日益成为研发的方向和重点。近年来，有关噬菌体作为抗菌制剂的研究受到普遍关注"噬菌体作为一种抗菌剂，具有特异性强、自我增殖快、来源广等一些其它抗菌剂无法比拟的优点，而且天然、绿色、安全，是一种极具开发和应用前景的生物防治手段。大量研究显示，噬菌体己经成功地应用于人、家畜、水产养殖动物以及农作物细菌性感染的防治，并在食品保鲜和抗微生物污染方面彰显优势。
发明内容
本发明的目的在于：针对目前防治EHEC O157:H7引起的动物腹泻及中毒事件时，使用药物及相关治疗措施不能够有效控制该病的传播等问题，提供一种新的能够特异性裂解EHEC O157:H7的噬菌体及其应用。
本发明的另一目的是开发新的并且有用的对EHEC具有实质裂解潜力的噬菌体分离液，所述噬菌体分离液可以单独合用或混合使用以预防因EHEC O157:H7引起的动物腹泻以及养殖过程中畜舍环境引起的污染。
本发明的另一目地是提供所述的噬菌体制品在各种畜禽养殖过程中的饲料、垫料、饲喂用器具表面的EHEC O157:H7裂解潜力。
本发明的另一目的是提供消毒动物饲喂过程中的EHEC污染或畜舍环境的方法，所述方法包括使用如上述描述的对EHEC具有裂解潜力的至少一种或组合的噬菌体制剂。
本发明还涉及用于选择如以上描述的对EHEC具有实质裂解潜力的噬菌体分离物的方法。
本发明的优点是根据本发明选择的噬菌体制品对引起动物腹泻的主要病原EHEC及相关大肠杆菌具有宿主范围广的特点，且所述的噬菌体制品是无毒的，可以安全地用于动物腹泻的预防和治疗中。
本发的优点是根据本发明将纯化的噬菌体作为食品添加剂，在配料时加入105pfu/ml或105pfu/g浓度的纯化的噬菌体，用于防止食品储存过程中肠出血性大肠杆菌的生存和繁殖。
本发明的另一优点是提供了有助于消毒、清洁和净化畜舍环境中工作表面以及地面、墙壁等等的活性消毒用品，能够防止EHEC的污染和过度生长。
本发明的另一优点是提供了有助于消毒、清洁和净化动物毛皮中及加工过程等等的活性消毒用品，能够防止EHEC的污染和过度生长。
附图说明
图1噬菌体vB_ECM_M1E电镜照片；
图2是不同温度对噬菌体的影响；
图3是不同pH对噬菌体的影响；
图4噬菌体在生肉及牛奶中的杀菌结果，其中A.生肉，B.牛奶。
具本实施方式
本发明试验用噬菌体宿主菌EHEC O157:H7购自广东省微生物研究所菌种保藏中心，保藏号G1M1.707。
本发明试验用LB培养基等培养基购自北京陆桥技术股份有限公司。
实施例1、噬菌体的分离制备
本发明样品采自养猪厂清洗场地污水，经双层滤纸过滤，5000×g.min-1离心10min，0.22μm滤膜过滤上清。
取50ml过滤上清，加入2ml噬菌体宿主菌EHEC O157:H7过夜培养物，加入20ml LB培养基，室温作用30min，再放置于37℃培养12～16h。次日，取上述培养物以14000×g.min-1离心30min，取上清；14000×g.min-1再次离心20min， 取上清加入0.1％氯仿，形成噬菌体原液。
取噬菌体原液0.1ml，进行10倍稀释，取102、104和106稀释液各0.1ml与过夜培养的宿主菌液0.1ml混匀，室温作用15min后，加入约5ml 0.7％LB培养基，混匀后迅速倾倒入LB培养基平板上层，摇匀平置5min，待其凝固，置于37℃温箱培养12h后观察，获得形成噬菌斑的双层平板。
实施例2、噬菌体的纯化及透射电镜分析
取2ml新鲜培养的宿主菌，离心，0.4ml LB培养基重悬，加0.1ml噬菌体(以实施例1获得的单个噬菌体培养物与宿主菌分别按照1:1、1:10和1:100的比例)。加麦芽糖(0.2％)，MgSO4(10mM)，37℃温育20min，使噬菌体颗粒吸附于宿主菌；加入100ml LB液体培养基，其中含有麦芽糖(0.2％)，MgSO4(10mM)，37℃摇震培养9-12h；加0.1ml氯仿，37℃继续摇震培养10-20min，获得裂解液。
将裂解液转移至离心管，离心8000×g.min-1，去细菌碎片，取上清液；加RNase A、DNaseⅠ至1μg/ml，37℃温育30min；加9.3g PEG 8000，5.8g NaCl，摇匀至溶解，冰浴1h或4℃过夜；4℃离心10000×g.min-1 20min，去上清液；加2ml SM液，充分洗溶管壁及沉淀，室温作用1h；通过加入等体积的氯仿抽提噬菌体悬液中的PEG和细胞碎片，温和振荡30s；4℃，3000×g.min-1离心15min以分离有机相和亲水相，回收含有噬菌体颗粒的亲水相，获得纯化的噬菌体，双层平板检测纯化噬菌体(见图1)。
纯化的噬菌体命名为vB_ECM_MIE，于2016年9月29日保藏于中国武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2016539，分类命名为肠出血性大肠杆菌O157：H7噬菌体vB_ECM_MIE Entero-hemorrhagicEscherichia coli O157:H7phage vB_ECM_MIE。
实施例3、温度及pH对噬菌体稳定性的影响
分别取0.1ml 1×108pfu/ml纯化噬菌体于40℃～90℃水浴作用1h，将样品冰浴冷却后测其效价；分别取pH 2.0～9.0的蛋白胨水和2×108pfu/ml纯化噬菌体等量混合，37℃水浴作用2h后测其效价。
结果表明，如图2所示，噬菌体在20℃～50℃作用1h后，其活性无明显变化；60℃作用1h，活性有所降低；70℃作用后，效价降低至初始效价的50％以下；至90℃，几乎失活。
噬菌体经不同pH作用后结果如图3，噬菌体在pH6.0～8.0作用后，其效价均在108pfu/ml，其活性无明显变化；当pH分别6.0和9.0时，其效价降至5×107pfu/ml以下；而当在2.0～4.0以及10.0时，已检测不到噬菌体。
实施例4、噬菌体在环境中的灭菌实验
将宿主菌分别调整至105cfu/ml 30ml；同样将相应噬菌体调整为108pfu/ml30ml。将容器(体积2000cm×1500cm×3560cm，透明塑料箱)进行紫外杀菌，箱体四角及中心部位5个位置分别放置5个去盖的LB固体平板，先喷洒细菌30ml，15min后喷洒30ml噬菌体，其中对照组中仅喷洒宿主菌。分别在喷洒结束后3h，加盖取出平板，并置于37℃恒温培养箱过夜培养。
表1噬菌体的空间抑菌效力
**:p<0.01:噬菌体组与对照组比较
实施例5、噬菌体在生猪肉中的抑菌效果
噬菌体在食品中的灭菌效果研究即食性食品(火腿肠)，将其切成面积约为2cm×2cm的小块(约1g)，将肉块过火焰灭菌；制备5×105cfu/mL EHEC菌液；制备5×108pfu/mL浓度的噬菌体。将宿主菌菌液以20μL(1×104cfu/mL)滴于肉块表面，约30min后，滴50μL噬菌体稀释液，同时设立宿主菌对照以及PBS对照；将制备好的样品分别置于4℃，分别于1d、2d、3d检测宿主菌数量变化情况。
将巴氏杀菌牛奶，分成3组，A组接种宿主菌104cfu/mL于试管中，同时加 入107pfu/mL噬菌体，B组中仅加入104cfu/mL宿主菌作为对照，C组中加入相同体积PBS作为对照，将各组置于4℃，分别于1d、2d、3d检测宿主菌数量变化情况。
噬菌体在生肉及牛奶中的杀菌结果如图4所示，将噬菌体以高感染复数作用于生肉中的EHEC，4℃作用1天后，宿主菌数量已降至检测水平以下(见图4A)；第2天，仍未检测到EHEC，而此时EHEC对照组中数量有所升高；至第3天，检测组与对照组宿主菌数量呈显著性差异，表明噬菌体能够有效杀灭宿主菌。同样在巴氏杀菌牛奶中，第1天已检测不到宿主菌EHEC；而对照组中宿主菌数量却有显著上升趋势(见图4B)。由此可见，噬菌体无论在固态还是液态食品中均能有效杀灭EHEC。

Claims (8)

1.一种噬菌体菌株，其特征在于：该噬菌体菌株保藏号为CCTCC NO：M 2016539，于2016年9月29日保藏于中国 武汉大学 中国典型培养物保藏中心，分类命名为肠出血性大肠杆菌噬菌体vB_ECM_MIE（ Entero-hemorrhagic Escherichia coli O157:H7 phage） vB_ECM_MIE。
2.一种如权利要求1所述噬菌体菌株在制备抑制肠出血性大肠杆菌生物制品中的应用。
3.根据权利要求2所述噬菌体菌株的应用，其特征在于：抑制肠出血性大肠杆菌生物制品中的应用是指：将纯化的噬菌体用水稀释至浓度≥105pfu/ml的喷洒液或淋洗液，用于对生产环境或生产器具的喷洒或消杀，防止食品加工过程中造成的肠出血性大肠杆菌污染。
4.根据权利要求2所述噬菌体菌株的应用，其特征在于：抑制肠出血性大肠杆菌生物制品中的应用是指：将纯化的噬菌体作为食品添加剂，在配料时加入105 pfu/ml或105 pfu/g浓度的纯化的噬菌体，用于防止食品储存过程中肠出血性大肠杆菌的生存和繁殖。
5.根据权利要求3或4所述噬菌体菌株的应用，其特征在于：所述的食品是指：肉类、蛋类、奶制品、粮食或蔬菜，或它们之间的组合加工的固体或液体类食品。
6.根据权利要求2所述噬菌体菌株的应用，其特征在于：抑制肠出血性大肠杆菌生物制品中的应用是指：将纯化的噬菌体用水稀释至浓度≥105 pfu/ml后，作为消杀剂用于畜禽舍养殖区对肠出血性大肠杆菌的消杀和抑制。
7.根据权利要求2所述噬菌体菌株的应用，其特征在于：抑制肠出血性大肠杆菌生物制品中的应用是指：将纯化的噬菌体与赋形剂复配后，作为治疗由肠出血性大肠杆菌导致腹泻的药物。
8.根据权利要求7所述噬菌体菌株的应用，其特征在于：所述的赋形剂为制药领域普遍使用的缓冲液、金属离子、表面活性剂。
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