CN101955916B - 一种宽宿主谱李斯特菌噬菌体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种宽宿主谱李斯特菌噬菌体及其作为生物杀菌剂在食品中的应用。分离的单核细胞增生性李斯特菌噬菌体命名为LipG2-5(保藏号CCTCC M 2010003)，对单核细胞增生性李斯特菌、英诺克李斯特菌及威尔氏李斯特菌均具有强裂解活性，其分离培养物及复配制剂能够作为食品添加剂防控食品中李斯特菌的污染。

Description

一种宽宿主谱李斯特菌噬菌体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种宽宿主谱李斯特菌噬菌体菌株及其作为食品添加成分在固态及液态食品中的应用，尤其是能够特异性裂解食品中污染的多种李斯特菌的噬菌体的应用。属于生物工程领域。

背景技术

李斯特菌(Listeria)是一种能够引起动物和人李斯特菌病的革兰氏阳性细菌，目前国际公认的李斯特菌共有六个种，其中单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes，Lm)是最重要的食源性人兽共患病原菌。调查研究表明，96％的李斯特菌病例都是由Lm中1/2a，1/2b和4b血清型引发的，主要表现为胃肠炎、败血症、脑膜脑炎和流产等，死亡率高达25-30％。在自然界中，Lm通常存在于土壤、河水、植物、屠宰场废弃物及动物源食品中(肉、奶及其制品、海产品等)，且与大多数人源病原菌不同的是Lm在低温环境中仍可生长繁殖(如2～8℃)，是冷藏食品以及即食(Ready-To-Eat，RTE)食品中威胁人类健康的重要病原菌之一。国内主要城市食品污染调查研究显示，北京8类食品中，Lm平均检出率为21.5％；浙江6类食品中的检出率为7.14％；南京市连续两年的李斯特菌检出率分别为18.3％和17.9％，其污染状况令人堪忧。在国外，美国和加拿大曾爆发过6起重大的李斯特菌病，而这都与食用了污染李斯特菌的食品有关。

噬菌体是一类细菌依赖性的病毒，又称细菌病毒。裂解性噬菌体感染细菌后，可在宿主菌内快速增殖，并使之裂解，故又称毒性噬菌体。Lm噬菌体可以特异性感染并裂解李斯特菌，因而具有杀菌作用。在感染模型中，噬菌体能够特异杀死李斯特菌；而在食品中，噬菌体能够作为抗菌剂来控制细菌污染，具有潜在的开发价值。

发明内容

发明目的

开发对李斯特菌具有强裂解作用的噬菌体制剂，该制剂可以单独或复配使用，能够特异性的灭活多种食源性李斯特菌，为目前防控食品中李斯特菌污染提供一种安全、无毒副作用的噬菌体产品来源。

技术方案

一种宽宿主谱李斯特菌噬菌体，保藏号为：CCTCC M 2010003，保藏日期2010年1月15日，该菌株对李斯特菌有强的裂解作用。

1.形态学特性

取纯化噬菌体悬液作电镜观察，加20μl样本滴在铜网上，待其沉淀15min，用滤纸吸去多余的液体，用2％的磷钨酸染色30min，干燥后电镜观察。头部对称，直径约为75nm，尾长约为262.5nm，尾部直径为12.5nm。

2.噬菌体基因组核酸类型鉴定

根据国际病毒分类委员会2005年发表的《病毒分类-国际病毒分类委员会第八次报告》中对噬菌体的新分类方法，本发明获得的噬菌体的形态学特征应归于长尾噬菌体科，其DNA鉴定结果显示，该噬菌体为dsDNA，将其命名为单核细胞增生性李斯特菌噬菌体LipG2-5。

在本发明中：所述的噬菌体菌株在30～50℃中放置60min，其活性稳定；在60℃以上孵育60min，则失活；噬菌体菌株在pH5.0～8.0环境下，其活性稳定；

一种宽宿主谱李斯特菌噬菌体的制备方法，其特征在于：取2ml新鲜培养的单核细胞增生性李斯特菌过夜培养物，离心，0.4ml TSB-YE(含0.6％酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤)培养基重悬，加0.1ml噬菌体、麦芽糖(0.2％)、CaCl₂(终浓度1.25mM)，30℃温育30min，使噬菌体颗粒吸附于宿主菌；加入100ml TSB-YE培养基，30℃静置培养6-8h；取上述培养物以13000×g.min^-1，4℃，离心30min，取上清；再用0.22μm滤膜过滤上清，形成噬菌体悬液。加RNase A、DNase I至1μg/ml，37℃温育30min；加9.3g PEG 8000，5.8g NaCl，摇匀至溶解，冰浴1h或4℃过夜；4℃离心10000×g.min^-120min，去上清液；加2ml SM[0.05M TRIS，0.1MNaCl，0.008M MgSO4，pH 7.54]溶液，充分洗溶管壁及沉淀，室温作用1h；通过加入等体积的氯仿抽提噬菌体悬液中的PEG和细胞碎片，温和振荡30s；4℃，3000×g.min^-1离心15min以分离有机相和亲水相，回收含有噬菌体颗粒的亲水相，获得纯化的噬菌体。

一种宽宿主谱李斯特菌噬菌体的应用，其特征在于用于防止李斯特菌污染和抑制李斯特菌过度生长。

一种宽宿主谱李斯特菌噬菌体的应用，其特征在于将噬菌体制成喷洒液或淋洗液，用于对食品、生产环境或生产器具的喷洒或消杀，防止食品加工过程中造成的李斯特菌污染。

一种宽宿主谱李斯特菌噬菌体的应用，其特征在于所述的食品为由肉类、或蛋类、或奶制品、或粮食、或蔬菜、或它们之间的组合加工的固体或液体类食品。

一种宽宿主谱李斯特菌噬菌体的应用，其特征在于以所述的一种宽宿主谱李斯特菌噬菌体的分离物或培养物制成杀菌剂。

一种宽宿主谱李斯特菌噬菌体的应用，其特征在于：将噬菌体与赋形剂复配后，用来抑制食品中李斯特菌的污染。

一种宽宿主谱李斯特菌噬菌体的应用，其特征在于：所述的赋形剂为制药领域普遍使用的缓冲液、金属离子、表面活性剂、明胶或海藻酸盐。

有益效果

由于采用噬菌体特异性裂解李斯特菌可以杀死具有耐药性的李斯特菌；由于采用噬菌体特异性裂解李斯特菌能够防止李斯特菌进化和耐药毒株的产生；由于本发明涉及的噬菌体菌株具有亲水相，通过传统的方法很容易配制成喷洒液或淋洗液，对环境或器具进行消杀；由于本发明涉及的噬菌体菌株没有毒副作用，可以作为食品添加剂，特异性裂解李斯特菌，防止李斯特菌对食品的污染。

附图说明

图1噬菌体双层板检测结果

图2噬菌体电镜照片

图3噬菌体温度敏感性检测结果

图4噬菌体pH敏感性检测结果

图5噬菌体宿主谱系分析结果

图6噬菌体在即食食品(火腿肠)中灭菌检测结果(4℃)

图7噬菌体在即食食品(火腿肠)中灭菌检测结果(25℃)

图8噬菌体在牛奶中灭菌作用检测结果(4℃)

图9噬菌体在牛奶中灭菌作用检测结果(25℃)

具体实施方式

本发明试验用噬菌体宿主菌单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes，简称Lm保藏号：GIM1.228)、威尔氏李斯特菌(Listeria welshimeri，保藏号：GIM 1.231)、英诺克李斯特菌(Listeria innocua，保藏号：GIM 1.230)购自广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心。实施例1、噬菌体分离制备及纯化

噬菌体分离

本发明样品采自江苏省宜兴猪场污水，将样品加入SM溶液，室温震荡2-4h，取上清经双层滤纸过滤，3000×g.min^-1离心20min，再用0.22μm滤膜过滤上清。取10ml过滤上清，加入1ml Lm过夜培养物，再加入无菌CaCl₂母液至终浓度1.25mM混匀后，加入20ml TSB-YE培养基，室温作用30min，再放置于30℃，待培养至6～8h后，取上述培养物以13000×g.min^-1，4℃，离心30min，取上清；再用0.22μm滤膜过滤上清，形成噬菌体原液。

将TSA-YE(含0.6％酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂)平板分为2个区域：吸取宿主菌液0.1ml滴于普通营养琼脂平板正中央，将菌液均匀地涂开；待其晾干后，取噬菌体原液0.01ml穿刺于其中一个区域；待自然晾干后，置于30℃温箱培养10h后，观察穿刺区域的变化。同时设立对照，对照中仅涂噬菌体原液，以鉴定噬菌体中是否含有宿主菌。

取噬菌体原液0.1ml，进行10倍稀释，取10²、10⁴和10⁶稀释液各0.1ml与过夜培养的宿主菌液0.1ml混匀，室温作用15min后，加入约5ml 0.7％LB培养基，混匀后迅速倾倒入TSA-YE平板上层，摇匀平置5min，待其凝固，置于30℃温箱培养12h后观察，获得形成噬菌斑的双层平板。

噬菌体纯化

取2ml新鲜培养的Lm过夜培养物，离心，0.4ml TSB-YE培养基重悬，加0.1ml噬菌体(以单个噬菌体培养物与宿主菌分别按照1∶1、1∶10和1∶100的比例)。加麦芽糖(0.2％)，CaCl₂(终浓度1.25mM)，30℃温育30min，使噬菌体颗粒吸附于宿主菌；加入100ml TSB-YE培养基，30℃静置培养6-8h；取上述培养物以13000×g.min^-1，4℃，离心30min，取上清；再用0.22μm滤膜过滤上清，形成噬菌体悬液。加RNase A、DNase I至1μg/ml，37℃温育30min；加9.3g PEG 8000，5.8g NaCl，摇匀至溶解，冰浴1h或4℃过夜；4℃离心10000×g.min^-120min，去上清液；加2ml SM溶液，充分洗溶管壁及沉淀，室温作用1h；通过加入等体积的氯仿抽提噬菌体悬液中的PEG和细胞碎片，温和振荡30s；4℃，3000×g.min^-1离心15min以分离有机相和亲水相，回收含有噬菌体颗粒的亲水相，获得纯化的噬菌体，双层平板检测纯化噬菌体(如图1所示)。

噬菌体电镜检测

取纯化噬菌体悬液作电镜观察，加20μl样本滴在铜网上，待其沉淀15min，用滤纸吸去多余的液体，用2％的磷钨酸染色30min，干燥后电镜观察。

如图2所示，噬菌体LipG2-5属于长尾噬菌体科，头部对称，直径约为75nm，尾长约为262.5nm，尾部直径为12.5nm。

温度及pH对噬菌体的影响

取0.1ml1×10⁸pfu/ml纯化噬菌体于30℃～90℃水浴分别作用1h，将样品冷却后测其效价；分别取pH3.0～10.0的蛋白胨水和2×10⁸pfu/ml纯化噬菌体等量混合，37℃水浴作用2h后测其效价。

结果如图3所示，噬菌体在30～50℃分别作用1h后，其活性无显著变化；60℃～90℃作用1h后，噬菌体低于可检测水平。

结果如图4所示，在pH为3和4时，均检测不到噬菌体；pH为5.0～8.0时，其效价与初始效价无显著性差异；当pH为9.0时，其效价降低了3log，而当pH为10时，检测不到噬菌体。

噬菌体宿主谱系检测

将TSA-YE平板分为若干个区域，吸取不同宿主菌过夜培养物：单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、威尔氏李斯特菌(Listeria welshimeri GIM 1.231)、英诺克李斯特菌(Listeria innocua GIM 1.230)、绵羊李斯特菌(Listeria ivanovii，本室分离鉴定并保存)0.1ml滴于TSA-YE平板正中央，将菌液均匀地涂开；同时也加入副伤寒沙门菌(ATCC 50073)、肠炎沙门菌(ATCC 13073)以及大肠杆菌(ATCC 25922)待其晾干后，取噬菌体原液0.1ml，进行10倍稀释，取10²、10⁴和10⁶稀释液0.01ml分别滴加于涂有不同宿主菌的平板中，正放待自然晾干后，置于30℃温箱培养10h后，观察噬菌体对不同宿主菌的裂解作用。

结果见图5，噬菌体对仅对李斯特菌属宿主菌有特异性裂解作用，即对单核细胞增生性李斯特菌、威尔氏李斯特菌、英诺克李斯特菌以及绵羊李斯特菌具有良好的裂解特性，对其他细菌无裂解作用，平板中无透明斑。

实施例2、噬菌体在固态食品中的杀菌作用

即食性食品(火腿肠)，将其切成约面积为2cm×2cm的小块(约1g)，将肉块过火焰灭菌；制备5×10⁵cfu/ml李斯特菌菌液；制备5×10⁹pfu/ml的噬菌体样品。无菌室温环境下，将宿主菌菌液以20μl(1×10⁴cfu/ml)滴于肉块表面，约15min后，滴20μl不同浓度的噬菌体，同时设立宿主菌对照；将制备好的样品分别置于4℃和25℃，分别于24h、72h、168h检测宿主菌数量。

结果如图6中所示，4℃作用24h后，与对照组相比较，加入噬菌体组中，宿主菌数量下降；72h后，宿主菌数量显著降低；至168h，宿主菌数量与对照组呈极显著性差异。

如图7中所示，25℃作用24h后，与对照组相比较，宿主菌数量下降；72h后，宿主菌数量降低；至168h，宿主菌与对照组呈显著性差异。

实施例3、噬菌体在液态食品中的杀菌作用

将巴氏杀菌牛奶，分成两组，A组接种宿主菌10⁴cfu/ml，同时加入10⁸pfu/ml噬菌体，B组中仅加入宿主菌作为对照，将制备好的样品分别置于4℃和25℃，分别于24h、72h、168h检测宿主菌数量。

结果如图8所示，4℃作用24h后，宿主菌数量下降；至72h，宿主菌数量降至对照组50％以下；至168h，宿主菌数量与对照组呈显著性差异。

如图9中所示，25℃作用24h后，与对照组相比较，即5×10⁹pfu/ml的噬菌体剂量能有效够杀灭宿主菌，宿主菌数量下降；72h后，宿主菌数量降低；至168h，宿主菌与对照组呈显著性差异，此时宿主菌长生较快。

实施例4、噬菌体在加工器械中的杀菌作用

挑取单核增生性李斯特菌单克隆，经过夜培养后，调整期浓度为10⁴cfu/ml，喷洒在加工用刀具表面；然后将纯化噬菌体以10⁷pfu/ml、10⁸pfu/ml浓度对刀具实施喷洒消杀，120min后，检测宿主菌的数量。

检测结果显示，在以10⁷pfu/ml和10⁸pfu/ml浓度噬菌体实施喷洒消杀120min后，食槽表面宿主菌显著下降，因此以浓度≥10⁷pfu/ml噬菌体能够有效的杀灭器具表面污染的李斯特菌。

实施例5、噬菌体安全性实验

8周龄雌性SPF级BALB/c小鼠，27g±2g，共20只，购自扬州大学比较医学中心。随机分为2组，各10只；其中一组口服噬菌体10¹⁰pfu/0.1ml/只；对照组口服等体积PBS。连续口服14d，脱劲致死小鼠，观察内脏、消化道及黏膜变化情况。

结果显示，此计量的噬菌体对小鼠日常行为没有影响，解剖检查无异常，且在饲喂结束两天后，在小鼠粪便中检测不到噬菌体。

Claims (6)

1.一种宽宿主谱李斯特菌噬菌体，其特征在于保藏号为：CCTCC M 2010003，对李斯特菌具有实质性裂解潜力。

2.根据权利要求1所述的一种宽宿主谱李斯特菌噬菌体的应用，其特征在于用于防止李斯特菌污染和抑制李斯特菌过度生长，其中所述的李斯特菌为单核细胞增生性李斯特菌Listeria monocytogenes，保藏号：GIM1.228、威尔氏李斯特菌Listeria welshimeri，保藏号：GIM 1.231、英诺克李斯特菌Listeriainnocua，保藏号：GIM 1.230。

3.根据权利要求1所述的一种宽宿主谱李斯特菌噬菌体的应用，其特征在于将噬菌体制成喷洒液或淋洗液，用于对食品、生产环境或生产器具的喷洒或消杀，防止食品加工过程中造成的李斯特菌污染，其中所述的李斯特菌为单核细胞增生性李斯特菌Listeria monocytogenes，保藏号：GIM1.228、威尔氏李斯特菌Listeria welshimeri，保藏号：GIM 1.231、英诺克李斯特菌Listeriainnocua，保藏号：GIM 1.230。

4.根据权利要求3所述的一种宽宿主谱李斯特菌噬菌体的应用，其特征在于所述的食品为由肉类、或蛋类、或奶制品、或粮食、或蔬菜、或它们之间的组合加工的固体或液体类食品。

5.根据权利要求1所述的一种宽宿主谱李斯特菌噬菌体的应用，其特征在于：将噬菌体与赋形剂复配后，用来抑制食品中李斯特菌的污染，其中所述的李斯特菌为单核细胞增生性李斯特菌Listeria monocytogenes，保藏号：GIM1.228、威尔氏李斯特菌Listeria welshimeri，保藏号：GIM 1.231、英诺克李斯特菌Listeria innocua，保藏号：GIM 1.230。

6.根据权利要求5所述的一种宽宿主谱李斯特菌噬菌体的应用，其特征在于：所述的赋形剂为制药领域普遍使用的缓冲液、金属离子、表面活性剂、明胶或海藻酸盐。

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