CN103937701B - 一种短小芽孢杆菌shou002及其应用 - Google Patents

一种短小芽孢杆菌shou002及其应用 Download PDF

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本发明提供了一种短小芽孢杆菌shou002及其应用，其中，本发明的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）shou002于2013年11月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2013536，该短小芽孢杆菌shou002对水产病原菌具有良好的抑制作用，并且无致病性，安全可靠，能够有效的降解养殖水体中的有机物、氨氮和亚硝酸氮等污染物，优化养殖环境，促进水环境生态良性循环，可以用作饲料添加剂和水体生态环境改良剂应用到水产养殖中。

Description

一种短小芽孢杆菌shou002及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种短小芽孢杆菌shou002及其应用。
背景技术
大黄鱼(Pseudosciaena crocea)属石首鱼科，黄鱼属，为我国主要的海产经济鱼类之一。但是近年来，随着大黄鱼网箱养殖业的蓬勃发展，各种鱼病也频繁发生，尤其是发病时间长、发病率和死亡率较高的弧菌病，给渔业生产造成严重的经济损失。传统的抗生素等药物长期使用后会造成细菌的多重抗药性、药物残留以及危害环境等不良后果。
此外，水体恶化是导致水产养殖病害暴发，产量下降的主要因素之一。特别是近年来，水产养殖业迅速发展，集约式工业化养殖规模日益扩大，由此产生的大量粪便、分泌物、残饵及动植物残骸的积累，使养殖水体中有机物、氨氮和亚硝酸氮等污染物的浓度日益增加，导致水质恶化，对养殖生物产生毒害作用。
目前，在水产养殖业中，应用比较多的是利用微生态制剂控制并解决养殖水体的污染及病害问题。相对于物理和化学方法，微生物治理养殖生态环境，可直接将水体中的有机物和氮磷等过剩物质分解和转化，具有成本低、收效大、无再污染等优点，已经成为研究的热点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种短小芽孢杆菌shou002及其应用，旨在通过生态方法来进行鱼病防治、养殖水体质量改善、促进饲料消化吸收以增强宿主对疾病的抵抗力。
本发明是这样实现的，一种短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)shou002，于2013年11月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2013536。
本发明进一步提供了上述短小芽孢杆菌shou002在水产养殖中的应用。
优选地，所述短小芽孢杆菌shou002用于抑制水产病原菌，以及降解水体中的有机物、氨氮和亚硝酸氮污染物。
优选地，所述水产病原菌为病原弧菌。
优选地，所述短小芽孢杆菌shou002用于养殖水体生态环境的改良剂。
优选地，所述短小芽孢杆菌shou002用于畜禽、水产饲料中的添加剂。
本发明克服现有技术的不足，提供一种短小芽孢杆菌shou002及其应用，本发明的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)shou002于2013年11月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2013536，保藏地址为中国武汉市武汉大学中国典型培养物保藏中心，邮编430072，该短小芽孢杆菌shou002对水产病原菌具有良好的抑制作用，并且无致病性，安全可靠，能够有效的降解养殖水体中的有机物、氨氮和亚硝酸氮等污染物，优化养殖环境，促进水环境生态良性循环，可以被作为饲料添加剂和水体生态环境改良剂应用到水产养殖中。
附图说明
图1是本发明实施例4中短小芽孢杆菌shou002对养殖水体氨氮降解变化示意图；
图2是本发明实施例5中短小芽孢杆菌shou002对养殖水体中饲料残饵的降解变化示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1短小芽孢杆菌shou002的筛选
采用锰营养琼脂、硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂(TCBS)、伊红美蓝琼脂(EMB)、海水琼脂(2216E)和淡水琼脂(FWA)培养基从大黄鱼肠道中分离、筛选出对大黄鱼病原弧菌，副溶血弧菌(Vp1.2164)和溶藻弧菌(Va-Y)有较强拮抗作用的拮抗菌。
对筛选出来的菌株通过点种法进行体外拮抗实验，筛选抗菌谱最广、效果最强的菌株。菌株经细菌鉴定仪及16SrRNA基因序列分析鉴定，确定它们的分类地位。
选取一株拮抗作用较强抗菌谱较广的菌株，经VITEK-32细菌快速鉴定仪及16SrRNA基因序列分析，确定目的菌株为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，将所获得的菌株命名为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)shou002，并于2013年11月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2013536。
实施例2短小芽孢杆菌shou002胞外产物对病原弧菌抑制
(1)参照Sugita等(Sugita H,Hirose Y,Matsue N,et al.Vibrio sp.strainNM10,isolated from the intestine of a Japanese coastal fish,has an inhibitoryeffect against Pasteurella piscicida[J].Appli Environ Microbiol，1998，64：231-237)的方法进行，具体步骤为：将筛选到的拮抗菌在营养琼脂斜面上活化后接种于营养肉汤培养基，28℃恒温振荡培养一定时间，4℃、9600rpm/min条件下离心20min，弃去细胞沉淀，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，所得液体即为短小芽孢杆菌shou002的胞外产物，置于4℃保存备用。
(2)采用平板扩散法检测抑菌活性。
副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)Vp1.2164(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，鱼类致病菌)和溶藻弧菌Va-Y(扬州大学付立霞老师惠赠，已在文献：“王娟，封永辉，蔡立胜，王建，曲宪成，张庆华(通讯作者)。来自大黄鱼肠道的弧菌拮抗菌的筛选与鉴定，海洋与湖沼，2010，41(5)：707-713.”中公开)为指示弧菌，培养18～20h后用0.85％的灭菌生理盐水洗下菌苔，参照麦氏比浊管调节其菌液浓度为107CFU/ml，取0.1ml涂布于适宜平板上；滤纸用打孔机打成Φ＝5.5mm的双层圆形纸片，在干燥箱内140℃干燥1h，将纸片分别浸于短小芽孢杆菌shou002的胞外产物中，之后在培养箱内28℃干燥15min，将纸片贴于上述涂布病原弧菌的平板上，28℃培养24～48h观察有无抑菌圈出现并记录直径。
(3)短小芽孢杆菌shou002的胞外产物对2株病原弧菌均产生抑制作用，抑菌圈直径分别为11.5mm和9.6mm。
实施例3短小芽孢杆菌shou002的安全性
将营养肉汤培养基(包括蛋白胨10g，牛肉浸出粉3g，氯化钠5g，加蒸馏水1000ml，加热溶解后分装烧瓶，经121℃灭菌15min)过夜培养的待测菌株划线于羊血平板上，28℃培养24h，根据菌落周围透明圈的形成，来判断溶血素的产生，并以弧菌Vp1.2164作为阳性对照。试验结果表明，副溶血弧菌1.2164在血平板上有溶血现象，短小芽孢杆菌shou002在血平板上未观察到溶血现象，表明菌株不产生溶血素，不具有潜在的致病性。
实施例4短小芽孢杆菌shou002对养殖水体氨氮降解
(1)用接种环挑取短小芽孢杆菌shou002斜面菌种接种到活化培养基中，28℃摇床培养18～20h后，用0.85％无菌生理盐水离心洗涤3次，最后用生理盐水制成菌液，备用。
活化培养基为牛肉膏蛋白胨液体培养基，包括牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaC15.0g，水l000ml，pH值7.2～7.4，分装于150ml三角瓶中，每瓶100ml。营养琼脂培养基则在上述培养基中添加1.5～2％琼脂。
(2)将上述菌液分别按10％的接种量，接入筛选培养基(筛选培养基为：5.0g葡萄糖，0.25g(NH4)2SO4，1.0gNaC1，0.5gK2HPO4，0.25gMgSO4·7H2O，1000ml水，PH7.2，其中，氨氮含量约为50mg/L)中作为氨氮模拟废水，28℃摇床培养24h。接种后每隔2h取样1次，每次10ml，先在其最大吸收波长下测定培养液的OD值，然后离心取上清液，测定其中氨氮含量，以时间为横坐标，培养液的浊度(即OD值)和氨氮含量为纵坐标作图。结果如图1所示，从图1中可以看出，菌株shou002在10h开始进入对数期，16h达到对数期；菌株在进入对数期之前，反应液中的氨氮含量虽然也下降，但不明显；进入对数期以后氨氮含量明显下降，在16h后达到稳定状态，随后氨氮含量保持相对平稳。对菌量和氨氮浓度两种曲线进行比较观察，发现氨氮降解菌生长速率最大的时期亦是反应液中氨氮含量下降最快的时期，表明菌的生长与氨氮的降解是同步进行的，24h的降解率为51.7％。
实施例5短小芽孢杆菌shou002对养殖水体中饲料残饵的降解
(1)斜面保藏菌种经营养肉汤培养基(蛋白胨10g，牛肉浸出粉3g，氯化钠5g，加蒸馏水1000ml，加热溶解后分装烧瓶，经121℃灭菌15min)活化后，配制一定浓度的菌液，分别接种于添加1％饲料大黄鱼养殖水体中，菌量分别为1％和5％(初始菌株浓度约为9.0×108CFU/ml)，于28℃、静置条件下培养，每隔一定时间取样测定蛋白质、淀粉的含量。其中，蛋白氮的测定：采用半微量凯氏定氮法(参考文献：马广慈，唐任寰，郑斯成.药物分析方法与应用[M].北京：科学出版社，2000：189-190)；淀粉含量的测定：采用碘显色法(参考文献：沈萍，范秀容，李广武主编.微生物学实验(第3版)[M].北京：高等教育出版社，1999，116-119)；细菌数量测定：采用平板菌落计数法。测定结果如图2所示，从图2可以看出，接种短小芽孢杆菌shou002的培养基中，饲料蛋白质和淀粉的含量都随培养时间的延长而减少，并都在48h左右趋于稳定；但是，由于接种的菌量不同，饲料蛋白质和淀粉的降解率也不同，5％菌量的降解率均高于接种1％菌量的降解率，其中，在48h，接种5％短小芽孢杆菌shou002菌液对蛋白质、淀粉的降解率分别为72.73％、72.50％，高于1％菌液的降解率，分别为61.33％、64.10％。之后，随着时间的延长，降解率都趋于稳定。当培养120h时，接种5％菌量组的蛋白和淀粉的降解率分别为76.62％、80.00％，1％菌量组的蛋白和淀粉的降解率分别为65.33％、74.36％，说明菌株对蛋白质和淀粉的降解率在达到稳定后，降解能力能持续一段时间。
相比与现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明的短小芽孢杆菌shou002对水产病原弧菌具有良好的抑制作用，并且无致病性，安全可靠。
(2)本发明的短小芽孢杆菌shou002能够有效的降解养殖水体中的有机物、氨氮和亚硝酸氮等污染物，优化养殖环境，促进水环境生态良性循环。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)shou002，于2013年11月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2013536。
2.权利要求1所述的短小芽孢杆菌shou002在制备畜禽、水产饲料中的添加剂方面的应用。
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