CN103387949A

CN103387949A - 一株大菱鲆烂边病拮抗菌及其应用

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Publication number: CN103387949A
Application number: CN2013103355504A
Authority: CN
Inventors: 郑风荣; 林学政; 刘洪展; 王波; 张白羽
Original assignee: First Institute of Oceanography SOA
Current assignee: First Institute of Oceanography SOA
Priority date: 2013-08-04
Filing date: 2013-08-04
Publication date: 2013-11-13
Anticipated expiration: 2033-08-04
Also published as: CN103387949B

Abstract

本发明的目的是提供一种大菱鲆拮抗菌，为假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp.），该菌株已于2013年7月3日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院的中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.7870。发明筛选的具有拮抗大菱鲆鳍部出血和死亡疾病的细菌，拮抗活性强，利用盐析法制备的拮抗菌胞外产物的产量稳定，成本低，可具有较高的拮抗活性。使用该拮抗菌或拮抗产物对大菱鲆的免疫保护率达50-60%，该拮抗菌产物为纯生物制剂，且具有安全、环保的特点，不会产生药物残留和环境造成污染，并且该方法可遏制大菱鲆鳍部出血死亡流行性疾病的发生和流行。

Description

一株大菱鲆烂边病拮抗菌及其应用

技术领域

本发明属于海洋微生物和生物防治技术领域，具体涉及一种大菱鲆拮抗菌及其应用。

背景技术

大菱鲆(Scophthalmas maximus) 是欧洲名贵海水鱼种，是当前欧洲的重要海水养殖鱼类之一，自1992年被引种到我国进行人工繁殖, 现已达到一定的规模，逐渐成为我国北方优秀的水产养殖品种和工厂化养殖的主要对象, 年创产值超过15亿元。然而伴随着养殖范围的扩大和养殖密度的增加,以及品种的退化,大菱鲆的病害问题也日渐突出，各种细菌性疾病、寄生虫病、病毒性疾病时有发生，且有愈演愈烈之势。其中细菌性疾病是大菱鲆养殖中危害最为严重的一种疾病。2009年以来山东威海养殖区大菱鲆爆发流行性疾病，症状首先表现为侧鳍、尾鳍颜色变浅，出现出血点，鳍条及鳍基部充血发红，各内脏器官有不同程度的发红和病变，患病大菱鲆未见溃烂便死亡，该病多发生于苗期和养成初期，传染性极强、流行范围广，死亡率极高，一旦发病，完全治愈非常困难，病鱼从鳍出现出血点至死亡仅需3～4天，属急性死亡，给养殖业主造成很大的经济损失。研究表明鳗弧菌（Vibrio anguillarum）和副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）可引起大菱鲆鳍部充血死亡等的流行性病害的发生。由于传统的抗生素等化学药物防治容易引起细菌产生抗药性，导致防治效果逐年下降，同时化学药物的使用容易导致药物残留、污染环境，并最终影响人类健康。为减少抗生素或一些化学水质净化剂的使用，使水产养殖业走上无公害养殖的可持续发展之路，一些国家开始利用生态防治方法来控制水产养殖病害，其原理是根据同一生态系统中的不同微生物之间的相互作用，如一些细菌和其他微生物可在环境中分泌抗生素，能很快杀死其它微生物，有的细菌则产生细菌素，杀死与其亲缘关系相近的种。益生菌是近年来国内外许多学者研究生物防治和生态防治的方法，它是一类具有巨大实用价值的生物工程产品，它是由从宿主体内分离出的正常菌群成分制成的活菌制剂，再通过适当途径作用于养殖鱼类，可以抑制病原菌的生长，提高苗种的成活率和鱼类的生长速度。

发明内容

本发明的目的是提供一种大菱鲆拮抗菌及其应用，可有效防治大菱鲆鳍部出血和死亡流行性疾病的发生，为大菱鲆鳍部出血和死亡流行性疾病的预防和治疗提供产品和使用方法。

本发明所提供的生物拮抗菌，为假交替单胞菌（Pseudoalteromonassp.），该菌株已于2013年7月3日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院的中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC NO. 7870。

本发明的假交替单胞菌用于制备菌液制剂，所制得的菌液制剂可以预防大菱鲆鳍部出血和死亡流行性疾病的发生。

菌液制剂中假交替单胞菌的数量为10⁷ ～10¹⁰ CFU/ml。

本发明筛选到的假交替单胞用于提取胞外产物，预防大菱鲆鳍部出血和死亡流行性疾病的发生。

本发明筛选的具有拮抗大菱鲆鳍部出血和死亡疾病的细菌，拮抗活性强，利用盐析法制备的拮抗菌胞外产物的产量稳定，成本低，可具有较高的拮抗活性。使用该拮抗菌或拮抗产物对大菱鲆的免疫保护率达50-60%，该拮抗菌产物为纯生物制剂，且具有安全、环保的特点，不会产生药物残留和环境造成污染，并且该方法可遏制大菱鲆鳍部出血死亡流行性疾病的发生和流行。

具体实施方式

下面对本发明进行详细的描述。上述拮抗菌的筛选方法如下：首先以大菱鲆鳍部出血的病原菌鳗弧菌（Vibrio anguillarum）为指示菌，利用分离自南极冰海水和大菱鲆养殖池水的100余株细菌，筛选其拮抗菌。提取拮抗菌的胞外产物，用于大菱鲆鳍部出血死亡流行性疾病的预防。具体技术方案如下：

（1）拮抗菌的筛选：将指示菌-大菱鲆鳍部出血的病原菌鳗弧菌（Vibrio anguillarum）接种于含有3%NaCl的LB液体培养基中，28?C震荡培养12～16小时，取40μl～50μl指示菌均匀涂布于高盐营养琼脂培养基（蛋白胨 10g/L，肉浸粉 10g/L，NaCL 30g/L，琼脂 20g/L，PH为7.4）平板上，用接种环或灭菌牙签挑取南极冰海水和大菱鲆养殖池水的细菌单菌落于涂有指示菌的平板上，每个平板涂2～3个单菌落，或者将该平板贴上灭菌后的小圆形滤纸片（5mm 直径），并用移液枪取50μl（1）中分离纯化的菌液涂于滤纸片上，每个平板上放两片或三片药敏片（药敏片直径为6mm），并做三个平行平板，减少随机误差。将平板放在恒温培养箱中28°C培养24h后，观察是否出现抑菌圈，并测量抑菌圈的大小。根据抑菌圈的大小筛选得到一株分离自大菱鲆养殖池水的强拮抗菌23，点种法抑菌圈直径3～4mm，滤纸片法抑菌圈直径15～20mm。

（2）牛津杯法将筛选得到的强拮抗菌23重新鉴定，方法如下：将牛津杯放入高盐营养琼脂培养基平板上，在牛津杯中放入50μl分离纯化的菌株23的菌液，将平板放在恒温培养箱中28°C培养24h后，观察是否出现抑菌圈，结果检测到抑菌圈直径为20mm。

（3）拮抗菌23胞外产物的抗菌活性鉴定：利用盐析法制备上述（1）、（2）筛选得到的拮抗菌的胞外产物，沉淀用pH7.4、10mM的无菌PBS溶解，并用透析袋，4°C过夜透析后即得拮抗菌胞外产物，放入1.5ml的灭菌EP管中。将制备得到的10μl胞外产物涂在灭菌滤纸片上，并将滤纸片贴于涂布40μl～50μl指示菌的高盐营养琼脂培养基平板上，恒温培养箱中28°C培养24h后，观察抑菌圈的大小。

（4）拮抗菌23的形态、生理生化和分子生物学鉴定：将拮抗菌划线接种于2216E平板，光学显微镜观察细菌形态为菌落呈白色，圆形，隆起，不透明，表面光滑，湿润，有鞭毛，细胞革兰氏染色阴性，生理生化鉴定菌落特征为化氢阴性，丙氨酸阴性，葡萄糖酸盐阴性，蛋白胨水阴性，葡磷胨水阴性，枸橼酸盐阴性，尿素阴性，葡萄糖阴性，赖氨酸阴性，鸟氨酸阳性，棉籽糖阴性，山梨醇阴性，木糖阴性，氨基酸对照阴性。16S rRNA进行的分子生物学鉴定为假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp.）。本发明筛选的菌株已于2013年7月3日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院的中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC 7870。

（5）假交替单胞菌的培养条件:

将该菌涂布于高盐营养琼脂培养基（蛋白胨 10g/L，肉浸粉 10g/L, NaCL 30g/L，琼脂 20g/L，PH为7.4）平板上，28℃ 培养16-18小时即可长出单菌落。

（6）假交替单胞菌菌液制剂的制备

将假交替单胞菌接种于添加了3%NaCl的LB培养基中，28℃条件下培养至OD600值达到0.6以上时终止培养，获得假交替单胞菌的扩大培养液；使菌液中的假交替单胞菌的浓度为10⁷-10¹⁰CFU/ml，即制得假交替单胞菌的菌液制剂。

本发明制得的假交替单胞菌菌液制剂可以添加在大菱鲆饵料中或养殖水体中。

（7）拮抗菌假交替单胞菌的安全性鉴定

从养殖场挑取日龄30-60、平均体长(2.0±1.1)cm的健康大菱鲆，饲养于10L海水的整理箱中，每组20尾，实验室暂养5天后用于拮抗菌安全性实验，暂养期间水温18℃-20℃，充氧，每天换水。将分离纯化的假交替单胞菌于含有3%NaCl的高盐LB培养基，28℃ 培养24-48 h后，离心，用无菌海水重悬得菌悬液，养殖大菱鲆水体中分别加入筛选得到的拮抗菌，使拮抗菌的浓度在1×10⁸cfu/L水体，每天换水补充菌液，以未做任何处理的同等大小的健康大菱鲆做对照，处理后密切观察大菱鲆的状况。结果表明，筛选得到的拮抗菌对大菱鲆是安全的，大菱鲆的游动、摄食正常。

（8）拮抗菌假交替单胞菌的抗菌性检测

一、菌株抗菌性检测

从市场购买体形均一、健康大菱鲆，饲养于10L海水的整理箱中，每组15尾，实验期间连续充气，水温14℃ ，每天换水，不投饵。将大菱鲆病原菌鳗弧菌（Vibrio anguillarum）和筛选分离到的假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp.）分别接种于含有3%NaCl的LB培养基中，28℃ 培养24h后，离心，用无菌海水分别重悬，得菌悬液，进行以下四组实验处理：（1）对照组，未加病原菌和拮抗菌；（2）水体中病原菌菌液终浓度为1.5×10⁸ CFU/ml；（3）水体中拮抗菌和病原菌菌液终浓度均为1.5×10⁸ CFU/ml，拮抗菌比病原菌先1天加入，处理2和3每天换水补充菌液，定时观察记录各组发病和死亡情况。处理组（2）第4天出现死亡，第10天发病率是100%，死亡率是80%；处理组（3）中的大菱鲆第5天有1尾鳍部出现出血点，第6天，死亡3尾，第六天，死亡4尾，死亡率为26.7%；处理组（1）则无一例死亡。

二、拮抗菌假交替单胞菌胞外产物的信息

1、拮抗菌假交替单胞菌胞外产物的制备

假交替单胞菌接种于250ml、3%NaCl的LB培养基中，28℃ 培养12-18h后，4℃ 、8000g离心10-20分钟，弃沉淀，取上清，搅拌条件下缓慢滴加饱和硫酸铵达50%的饱和度，于4℃沉淀30min以上或过夜，使蛋白充分沉淀，10000g/min，10min 4℃离心，弃上清。沉淀用5ml、pH7.4、10mM的无菌PBS溶解，并装入截留分子量为8000-14000Da、酸碱处理好的透析袋中，在4°C条件下，于 pH7.4、10mM的无菌PBS中透析过夜后，期间换两到三次PBS溶液，即得拮抗菌胞外产物，分装、放入1.5ml的灭菌EP管中，-80°C条件下保存备用。

2、拮抗菌假交替单胞菌胞外产物的抗菌效果检测

将健康、体形均一的大菱鲆60尾，饲养于10L海水的整理箱中，随机分组每组20尾，实验期间连续充气，水温22℃ ，每天换水，不投饵。使用制备的拮抗菌胞外产物进行注射拮抗效果试验，方法如下，试验分3个处理，第1组为对照组，第2组为终浓度为1.5×10⁸ CFU/ml的鳗弧菌病原菌处理组，第3组为注射20～40μl 的假交替单胞菌胞外产物后1天后加入终浓度为1.5×10⁸CFU/ml的大菱鲆病原菌鳗弧菌处理。8天后，第1组大菱鲆无死亡，第2组大菱鲆死亡率为100%，第3组的死亡率为20%。

将健康、体形均一的大菱鲆70尾，饲养于10L海水的整理箱中，随机分组每组15尾，实验期间连续充气，水温14℃ ，每天换水，不投饵。使用制备的拮抗菌胞外产物进行注射拮抗效果试验，方法如下，试验分3个处理，第1组为对照组，第2组为终浓度为1.5×10⁸ CFU/ml的大菱鲆病原菌处理组，第3组为注射20～40μl 的假交替单胞菌胞外产物3天后加入终浓度为1.5×10⁸ CFU/ml的大菱鲆病原菌鳗弧菌处理。10天后，第1组大菱鲆无死亡，第2组的大菱鲆死亡率为75%，第3组的死亡率为20%。

上述的实验结果表明，本发明筛选得到的大菱鲆拮抗菌及其胞外产物具有高效的拮抗效果，能够有效的提高大菱鲆的抗病力，具有良好的市场推广前景。

Claims

1.一种大菱鲆拮抗菌，所述的大菱鲆拮抗菌为假交替单胞菌，其保藏编号为CGMCC NO. 7870。

2.权利要求1所述的大菱鲆拮抗菌菌液制剂在预防大菱鲆鳍部出血和死亡流行性疾病的发生中的应用。

3.一种菌液制剂，为权利要求1所述的假交替单胞菌的菌液制剂。

4.如权利要求3所述的菌液制剂，其特征在于所述的菌液制剂中假交替单胞菌的数量为10⁷ ～10¹⁰ CFU/ml。

5.权利要求3所述的菌液制剂在预防大菱鲆鳍部出血和死亡流行性疾病中的应用。

6.一种胞外产物。所述的胞外产物是从权利要求1所述的假交替单胞中制备的。

7.权利要求6所述的胞外产物用于预防大菱鲆鳍部出血和死亡流行性疾病的发生。