CN104560831A - 一种高效生产具有免疫活性的胞外多糖的南极海冰菌 - Google Patents

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Abstract

发明的目的是提供一种能高效稳定生产胞外多糖的菌株，为假交替单胞菌(Pseudoalteromonas？sp.)NJS2-UV3，其保藏编号为CGMCC？No.10239。本发明采用50S的紫外照射时间对南极菌Psychrobacter？sp.B3进行诱变筛选，诱变后菌株的最适生长温度由10℃增加到25℃，从而有效的降低了生产能耗，而且菌株生长速度大大提高；诱变后单位体积发酵液中多糖含量由1.02g/L提高到9.98g/L，因而具有较高的开发利用价值。

Description

一种高效生产具有免疫活性的胞外多糖的南极海冰菌
技术领域
本发明属于功能微生物诱变筛选技术领域，具体涉及一种高效生产具有免疫活性的胞外多糖的南极海冰菌。
背景技术
多糖是一种无细胞毒的免疫促进剂。多种多糖能够分别或同时刺激巨噬细胞、B细胞、T细胞、自然杀伤细胞(NK)，增强这些细胞的活性；促进巨噬细胞分泌白细胞介素1(IL-1)、肿瘤坏死因子(TNF)；促进T淋巴细胞产生白细胞介素2(IL-2)；激活白细胞产生干扰素；调节抗体和补体生成等。多糖能对免疫系统发挥多方面的调节作用，从而改善机体的免疫功能。而微生物来源的多糖，尤其是细菌和真菌的胞外多糖，因其易于分离纯化而且产量高等优点在工业生产中颇受人们青睐。
南极微生物(海冰微藻和细菌)分泌产生大量的胞外多糖(EPSs)，这些物质聚集在冰藻和细菌生存的海冰通道中，提供了海冰和冰水界面的有机碳，是能源传输的主要物质。除了其生态学上的作用，国内外学者开始关注胞外多糖的生物学活性。极地细菌胞外多糖由于富含糖醛酸羧基基团、氨基糖氨基化合物、硫酸盐和羟基基团，特别是高比例的羟基基团和硫酸化程度，使得这些多糖具有独特的生物活性。但由于南极微生物生长速度慢、EPSs产量低且稳定性差，因而限制了其开发应用。因此，有必要从筛选出产量更高，更稳定的菌株。
发明内容
本发明的目的是提供一种能高效稳定生产胞外多糖的菌株以及其应用，从而弥补现有技术的不足。
本发明的紫外诱变南极菌株为假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)NJS2-UV3，于2014年12月23日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10239。
本发明的菌株在发酵制备胞外多糖中的应用；分离的胞外多糖其特征为白色絮状物，易溶于水和二甲基亚砜，相对分子量为60kDa，主要由阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖组成，其组成比为：阿拉伯糖：甘露糖：葡萄糖＝26：40：21。
本发明另一方面提供一种上述菌株发酵制备胞外多糖的方法，包括有如下的步骤：
1)种子液制备：
将菌株接种入培养基后培养获得终止液，其中培养基的一种具体组成如下：蔗糖2.25％(m/v)，豆粉1.05％，K2HPO40.02％，Na2SO40.01％，FeS04·7H2O 0.001％，CaCO30.2％，pH值7.2，l2l℃灭菌20min；培养条件如下：10℃、120rpm，培养48h。
2)深层发酵制备胞外多糖发酵液
按种子液按照5％的比例接入到发酵培养基中，发酵温度为25±1℃；搅拌速度250r/min，用灭菌豆油作为消泡剂来消除在搅拌过程中产生的气泡。其中发酵培养基的一种具体组成如下：蔗糖4.5％，豆粉2.1％，K2HPO4
0.02％，Na2SO40.01％，FeS04·7H2O 0.001％，CaCO30.2％3)胞外多糖发酵液的后处理
将发酵液以10000r/min转速离心10min去菌体，将去菌体发酵液加入三倍体积的95％乙醇沉淀过夜后，以5000r/min离心收集沉淀；采用TCA法脱蛋白，南极菌NJ-S2胞外多糖溶液中加入1.5倍体积的10％TCA溶液，混合均匀，于冰箱中静置4～6h，再以5000r/min的转速离心15min，除去沉淀，保留上清液，如此反复处理数次，得多糖粗品。多糖粗品复溶，经过凝胶过滤层析和离子交换层析的方法进行纯化，冷冻干燥，得到多糖纯品。
本发明采用50S的紫外照射时间对南极菌Psychrobacter sp.B3进行诱变筛选，诱变后菌株的最适生长温度由10℃增加到25℃，从而有效的降低了生产能耗，而且菌株生长速度大大提高；诱变后单位体积发酵液中多糖含量由1.02g/L提高到9.98g/L，因而具有较高的开发利用价值。
附图说明
图1：紫外诱变的致死曲线图；
图2：紫外诱变筛选正向突变菌株UV3的培养图。
具体实施方式
申请人之前使用南极菌Pseudoalteromonas sp.NJS2(CGMCC No.7255)发酵来制备胞外多糖EPS-Ⅰ，但在大规模生产中发现，随着发酵时间的增长，Pseudoalteromonas sp.NJS2的发酵能力明显下降，导致没有规模化生产的潜力，因此，申请人从Pseudoalteromonas sp.NJS2菌株出发进行紫外诱变筛选，最终获得了本发明的目的菌株Pseudoalteromonas sp.NJS2-UV3，该菌株最适生长温度由10℃提高到25℃，且产糖量由诱变前的1.02g/L提高到9.98g/L。
下面结合实施例对本发明做详细的说明。
实施例1.菌株的诱变筛选
将出发菌株Pseudoalteromonas sp.NJS2接种于22116E液体培养基中摇瓶培养，到达对数生长期后离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤两次，加入无菌生理盐水使细菌数目达106数量级，振荡成为单细胞悬液进行紫外诱变。紫外诱变照射时间分别为0～90S，时间梯度间隔10s。以未经紫外线照射处理的细菌悬液涂布2216E固体平板，避光培养72h，作为对照组计算致死率。
随着紫外照射时间的延长，细菌的致死率逐渐增大，时间为50S时，致死率为89％。当时间达到60S时致死率接近100％，如图1所示。所以本专利选择50S的照射时间进行紫外诱变。
以致死率达90％以上的照射时间为诱变剂量处理菌悬液并涂布2216E固体平板。从平板上选取菌落大、湿润且拉丝明显的菌落接种备用，共筛选获得5株正向突变菌株，分别命名为UV1-UV5，其中UV3产糖量最高(图2)，将该菌株命名为Pseudoalteromonas sp.NJS2-UV3，并于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏(保藏号：CGMCC No.10239)。
实施例2：突变菌株的培养温度及稳定性
为了获得适宜生产的高产糖、遗传稳定突变菌株，我们对突变菌株的最佳产糖培养温度进行了研究，并对获得的高产糖菌株进行了传代培养。
(1)葡萄糖标准溶液的制备：准确称取无水葡萄糖10mg，加入100ml容量瓶中，定容至刻度，浓度为100μg/ml。利用苯酚-硫酸法测出葡萄糖的标准曲线。以葡萄糖为标准品，根据标准曲线绘制方法进行标准曲线绘制，对测定数据用最小二乘法进行线性拟合，得到回归方程为y＝0.0023x-0.0048(R2＝0.9913)。突变菌株的产糖量均由此公式计算得出。
(2)诱变菌株的最适产糖生长温度筛选：经紫外诱变得到5株突变菌株，编号为UV1-UV5，接种于2216E液体培养基中，分别置于0-30℃培养箱避光培养3d，采用苯酚硫酸法测定不同温度下突变菌株的产糖量。筛选产糖量最高的菌株进行传代筛选。筛选结果见表1，UV3菌株产糖量最高，在10℃培养条件下产糖量可达9.32g/L，当培养温度提高到25℃，其产糖量可达9.98g/L，约为原始菌株产糖量的10倍。由于该菌株产糖量高，且培养温度接近室温(25℃)，因此，该菌株具有巨大的开发应用前景。
表1:诱变菌株最佳生产产糖温度表
(3)紫外诱变遗传稳定性
为了验证的遗传稳定性，特对该菌株进行传代培养。结果表明：该菌株母代产糖量为9.98g/L，10次传代后产糖量为9.7g/L，为母代菌株产糖量的97.3％，代间产糖差异不大，证明UV3经紫外诱变后遗传性状稳定，见表2。
表2：诱变菌株遗传稳定性
本发明方法制备的多糖EPS-Ⅰ的分子量及单糖组成分析方法及结果如下：
(1)采用高效凝胶渗透色谱法(HP-GPC)测定多糖EPS-Ⅰ分子量。分析条件：TSK-GEL G2000PW，300×7.5mmID色谱柱；流动相0.1mol/LNa2SO4溶液，流速1.0ml/min；柱温60℃，进样量2μl，示差折光检测器检测。以标准Dextran T系列葡聚糖作标准曲线，计算分子量。分析结果表明EPS-Ⅰ多糖的分子量为60k Da。
(2)单糖组成分析：
10mg纯化多糖中加入2mol/L三氟乙酸2ml置于100℃水浴中水解18h,减压浓缩至干，加入10mg盐酸羟胺和0.5ml吡啶，放入90℃水浴中加热反应30min分钟并振荡。取出后冷至室温，加入0.5ml醋酸酐，90℃下继续反应30min分钟进行乙酰化。反应产物减压浓缩至干，加入0.5ml氯仿萃取。同时将D-阿拉伯糖，D-木糖、D-半乳搪、D-葡萄糖和D-甘露糖按上述步骤转化成糖氰乙酸酯衍生物作为标准对照，接着进行气相(GC)色谱分析。气相色谱分析条件:OV-225柱，载气N2，90ml/min；柱温240℃，检测器温度250℃，气化室温度280℃，氢火焰离子检测器。分析结果表明EPS-Ⅰ多糖由阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖组成，其组成比为26：40：21。
本发明制备的胞外多糖EPS-Ⅰ能够显著提高小鼠脾淋巴细胞的增殖和促进小鼠白介素2的分泌，显示出良好的免疫活性。。该多糖在医药、生物技术领域、食品、化妆品等领域具有广泛的应用前景。
实施例3.EPS-Ⅰ多糖的免疫活性
1.EPS-Ⅰ多糖对脾淋巴细胞的增殖作用
采用MTS-PMS比色法。BALB/c小鼠断颈椎处死，无菌取脾，制备脾淋巴细胞，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为4×109/L cell/ml。
将BALB/c小鼠4×109/L cell/ml的脾细胞悬液加入96孔细胞培养板内，每孔100μl，多糖组每孔加入用RPMI1640完全培养液稀释成浓度为：6.25、12.5、25、50、100mg/L的HT-Ⅱ各10μl，每个浓度5个重复，空白对照组以等体积的RPMI1640代替。置37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养72h。取出，加入20μl MTS-PMS继续培养4～6h，用酶标仪测定A492nm值。
将BALB/c小鼠4×109cell/ml的脾细胞悬液加入96孔细胞培养板内，随后每孔加入ConA10μl，终浓度为5mg/L，多糖组每孔加入用RPMI1640完全培养液稀释成浓度为6.25、12.5、25、50、100mg/L的HT-Ⅱ各10μl，每个浓度3个重复，空白对照组以等体积的RPMI1640代替，置37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养72h。取出，加入20μl MTS-PMS继续培养4～6h，用酶标仪测定A492nm值，测定结果见表3。
表3:EPS-Ⅰ多糖对脾淋巴细胞增殖的影响
*p<0.05**p<0.01vs control
从表3中看出，EPS-Ⅰ在6.25～100mg/L的浓度范围内可显著刺激小鼠脾淋巴细胞增殖，随着多糖浓度增加，刺激效应呈增强趋势。EPS-Ⅰ在6.25～100mg/L的浓度范围内与ConA刺激的淋巴细胞增殖无明显协同作用，也无抑制作用。

Claims (6)

1.一种假交替单胞菌，其特征在于，所述的假交替单胞菌的保藏编号为CGMCC No.10239。
2.权利要求1所述的假交替单胞菌，其特征在于，所述的假交替单胞菌是通过诱变筛选获得的。
3.权利要求1所述的假交替单胞菌在发酵制备胞外多糖中的应用。
4.一种胞外多糖，其特征在于，所述的胞外多糖是由权利要求1所述的假交替单胞菌发酵制备的。
5.如权利要求4所述的胞外多糖，其特征在于，所述的胞外多糖为白色絮状物，易溶于水和二甲基亚砜，相对分子量为60kDa，主要由阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖组成，其组成比为：阿拉伯糖：甘露糖：葡萄糖＝26：40：21。
6.一种使用权利要求1所述的假交替单胞菌发酵制备胞外多糖的方法，其特征在于，所述的方法包括有如下的步骤：
1)种子液制备：
将菌株接种入培养基后培养获得终止液，其中培养基的组成如下：蔗糖2.25％，豆粉1.05％，K2HPO4 0.02％，Na2SO4 0.01％，FeS04·7H2O 0.001％，CaCO30.2％，pH值7.2，l2l℃灭菌20min；培养条件如下：10℃、120rpm，培养48h；
2)深层发酵制备胞外多糖发酵液
按种子液按照5％的比例接入到发酵培养基中，发酵温度为25±1℃；搅拌速度250r/min，用灭菌豆油作为消泡剂来消除在搅拌过程中产生的气泡；
其中发酵培养基的一种具体组成如下：蔗糖4.5％，豆粉2.1％，K2HPO40.02％，Na2SO4 0.01％，FeS04·7H2O 0.001％，CaCO3 0.2％；
3)胞外多糖发酵液的后处理
将发酵液以10000r/min转速离心10min去菌体，将去菌体发酵液加入三倍体积的95％乙醇沉淀过夜后，以5000r/min离心收集沉淀；采用TCA法脱蛋白，南极菌NJ-S2胞外多糖溶液中加入1.5倍体积的10％TCA溶液，混合均匀，于冰箱中静置4～6h，再以5000r/min的转速离心15min，除去沉淀，保留上清液，如此反复处理数次，得多糖粗品；多糖粗品复溶，经过凝胶过滤层析和离子交换层析的方法进行纯化，冷冻干燥，得到多糖纯品。
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