CN115491321B

CN115491321B - 一株高效生产胞外多糖的假交替单胞菌、胞外多糖及其制备方法与应用

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Publication number: CN115491321B
Application number: CN202210411444.9A
Authority: CN
Inventors: 张鹏英; 王德志; 丛柏林; 刘胜浩; 范风华
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Filing date: 2022-04-19
Publication date: 2024-05-31
Anticipated expiration: 2042-04-19

Abstract

本发明涉及一株高效生产胞外多糖的假交替单胞菌、胞外多糖及其制备方法与应用。一株高效生产胞外多糖的假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)LP6‑12‑2，于2021年12月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.24106。本发明还提供了利用假交替单胞菌LP6‑12‑2制备胞外多糖的方法，以及产物胞外多糖EPS1‑1的应用。本发明提供的假交替单胞菌LP6‑12‑2能够稳定高效地生产胞外多糖，产量能够达到285mg/L，增加了胞外多糖生产菌株的来源。并且本发明制备的胞外多糖EPS1‑1有良好的免疫调节活性，具有极大的开发和应用前景。

Description

一株高效生产胞外多糖的假交替单胞菌、胞外多糖及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一株高效生产胞外多糖的假交替单胞菌、胞外多糖及其制备方法与应用，属于医药及保健食品技术领域。

背景技术

多糖是由10个以上的单糖通过糖苷键聚合而成的天然高分子化合物，广泛存在于自然界高等植物、藻类、微生物及动物体内。大量的研究表明，多糖具有复杂的生物活性，如免疫调节、肿瘤抑制、抗冻、抗菌、抗病毒、抗辐射、抗衰老等，可用于开发治疗癌症、病毒性感染、增强免疫力的药品或功能食品。

南极具有干燥、酷寒、强福射的自然环境，孕育着独特的微生物生态系统，因此是产新型生物活性物质和先导化合物菌株的潜在种源地。南极海冰温度低于0℃是嗜冷微生物定居的良好生态环境。南极微生物在海冰反复冻融的过程中常年耐受低温以及盐度的急剧变化，会大量分泌胞外多糖(Exopolysaccharides，EPS)。这些物质聚集在冰藻和细菌生存的海冰通道中，提供了海冰和冰水界面的有机碳，是能源传输的主要物质。除了其生态学上的作用，国内外学者开始关注胞外多糖的生物学活性。极地细菌胞外多糖由于富含糖醛酸羧基基团、氨基糖氨基化合物、硫酸盐和羟基基团，特别是高比例的羟基基团和硫酸化程度，使得这些多糖具有独特的生物活性。EPS通过构成黏液和水合基质，保持细胞的完整性，改变生理或提高修复能力，来抵抗不利条件从而保护细胞免受环境压力的影响。为了适应南极环境，微生物合成结构新颖的EPS，由此有望开发出新型的免疫调节剂、抗肿瘤药物等新型活性物质。并且南极微生物生长速度慢、EPS产量低且稳定性差，因而限制了其开发应用，也有必要从筛选出产量更高，更稳定的菌株。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一株高效生产胞外多糖的假交替单胞菌、胞外多糖及其制备方法与应用。

本发明的技术方案如下：

一株高效生产胞外多糖的假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)LP6-12-2，于2021年12月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.24106。

本发明还提供了利用上述假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)LP6-12-2制备胞外多糖的方法，包括步骤如下：

(1)种子液的制备：将假交替单胞菌LP6-12-2按0.5～1.5％的接种量接种至2216E基础培养基中，在4～15℃，140～160rpm/min下培养46～50h，得到种子液；

(2)发酵液的制备：将步骤(1)所得的种子液按照0.5～1.5％的体积比接种于2216E改良培养基中，在4～15℃，140～160rpm/min下培养55～65h，收集发酵液，在7500～8500rpm/min下离心12～18min，去除菌体，取上清液；

(3)乙醇沉淀：将步骤(2)所得的上清液在55～65℃下减压浓缩至发酵液体积的20～25％，冷却至20～25℃，向浓缩液中加入其三倍体积的95～100％乙醇，4℃过夜，然后在7500～8500rpm/min下离心12～18min，收集沉淀；

(4)脱除蛋白：向步骤(3)所得的沉淀中加入去离子水，在20～25℃下搅拌溶解沉淀，在11000～13000rpm/min下离心8～12min，去除沉淀，收集上清液；向上清液中加入Sevage试剂，剧烈震荡并磁力搅拌，静置后回收有机试剂，除去蛋白质，重复操作6～10次，在55～65℃下减压浓缩，除去有机试剂，得到胞外多糖溶液；

(5)透析冻干：将步骤(4)所得的胞外多糖溶液装入透析袋中进行透析，每隔8h换去离子水，透析48h，然后经过真空冷冻干燥，得到胞外粗多糖；

(6)粗品分离：将步骤(5)所得的胞外粗多糖溶解于Tris-HCl缓冲液中，配制成浓度为8～10mg/mL的多糖溶液，进行DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析，使用0～0.5M梯度浓度的NaCl溶液由小到大依次进行梯度洗脱，收集0.1M NaCl浓度下的洗脱液，经过真空冷冻干燥，得到胞外多糖EPS-1；

(7)纯化：将步骤(6)所得的胞外多糖EPS-1溶解于去离子水中，配制成浓度为8～12mg/mL的多糖溶液，先后进行Sephadex G-75和Sephadex G-100凝胶柱层析，收集洗脱液的主成分，经过真空冷冻干燥，得到胞外多糖EPS1-1。

根据本发明优选的，步骤(1)中，所述2216E基础培养基的组成如下：蛋白胨0.1～1％(w/v)，酵母粉0.05～0.2％(w/v)，人工海水盐0.2～4％(w/v)。

根据本发明优选的，步骤(2)中，所述2216E改良培养基的组成如下：蛋白胨0.1～1％(w/v)，酵母粉0.05～0.2％(w/v)，人工海水盐0.2～4％(w/v)，葡萄糖0.5～2％(w/v)。

根据本发明优选的，步骤(4)中，所述Sevage试剂为氯仿：正丁醇＝5:1的混合溶液，加入量为上清液体积的18～22％。

本发明还提供上述方法制备得到的胞外多糖EPS1-1。

根据本发明优选的，所述胞外多糖EPS1-1为半乳糖胺(GalN)，葡糖胺(GlcN)，半乳糖(Gal)，葡萄糖(Glc)和甘露糖(Man)组成的杂多糖，其摩尔比具体为GalN:GlcN:Gal:Glc:Man＝1.2:4.2:4.3:7.2:83.1，分子量为23.47kDa，多糖含量大于95％，具有许多分枝结构且不含三股螺旋结构；

所述胞外多糖EPS1-1为α吡喃多糖，其一级结构是由五个D-Manp以α-(1→2)的方式连接而成构成主链，一个α-D-Manp-(1→6)-α-D-Manp-(1→和两个α-D-Manp-(1→作为支链以α-(1→6)的方式分别与主链的3～5号甘露糖基的6位O相连。

本发明还提供上述胞外多糖EPS1-1在制备免疫增强剂、或药物组合物、或保健品中的应用。

本发明的有益效果在于：

1、本发明提供的假交替单胞菌LP6-12-2能够稳定高效地生产胞外多糖，产量能够达到285mg/L，高于现有技术的一般水平，增加了胞外多糖生产菌株的来源。

2、本发明提供了胞外多糖EPS1-1的发酵生产制备方法，对胞外多糖EPS1-1结构进行了鉴定，从而为实验室研究以及工业生产提供依据，弥补了国内南极细菌胞外多糖研究的匮乏。并且本发明提供的制备方法过程简单，易于操作，便于大规模生产。

3、本发明制备的胞外多糖EPS1-1在250～1000μg/mL的剂量范围内，对人正常肝细胞LO2无细胞毒性；胞外多糖EPS1-1在一定浓度范围内，对小数单核巨噬细胞RAW264.7无细胞毒性，且能够显著促进RAW264.7细胞增殖，同时能够激活巨噬细胞，明显增强了巨噬细胞吞噬中性红的能力，显著促进了巨噬细胞NO、TNF-α、IL-6和IL-10细胞因子的释放，说明胞外多糖EPS1-1有良好的免疫调节活性，具有极大的开发和应用前景。

附图说明

图1为分离纯化结果图；

图中：A为粗糖阴离子交换洗脱曲线图；B为胞外多糖EPS-1凝胶过滤层析SephadexG-75洗脱曲线图；C为胞外多糖EPS-1凝胶过滤层析Sephadex G-100洗脱曲线图；D为胞外多糖EPS1-1高效凝胶渗透色谱图。

图2为单糖组成结果图；

图中：A为16种标准品离子色谱图；B为胞外多糖EPS1-1样品离子色谱图。

图3为胞外多糖EPS1-1的GC-MS甲基化分析结果图。

图4为胞外多糖EPS1-1的一维和二维核磁共振图谱；

图中：A为一维核磁共振氢谱图；B为一维核磁共振碳谱图；C为二维核磁共振¹H-¹HCOSY图谱；D为二维核磁共振HSQC图谱；E为二维核磁共振HMBC；F为二维核磁共振NOISY图谱。

图5为胞外多糖EPS1-1对LO2细胞和RAW264.7细胞影响图。

图中：A为胞外多糖EPS1-1对LO2细胞毒作用的影响；B为胞外多糖EPS1-1对RAW264.7细胞增殖作用的影响；C为胞外多糖EPS1-1对RAW264.7细胞吞噬能力的影响；D为胞外多糖EPS1-1对RAW264.7细胞酸性磷酸酶活性的影响。

图6为胞外多糖EPS1-1对RAW264.7细胞的NO及细胞因子TNF-α、IL-6和IL-10释放的影响图。

图中：A为胞外多糖EPS1-1对NO释放的影响；B为胞外多糖EPS1-1对TNF-α细胞因子释放的影响；C为胞外多糖EPS1-1对IL-6细胞因子释放的影响；D为胞外多糖EPS1-1对IL-10细胞因子释放的影响。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的具体实施过程作进一步详述，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，并不是全部的实施例。

下述的实施例中所使用的实验技术方法和科学术语如无特殊说明均与常规技术人员通常理解的含义相同。所涉及的实验耗材和试剂如无特殊备注均为一般商业途径可获取。

实施例中所述高效生产胞外多糖的假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)LP6-12-2，于2021年12月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.24106。

2216E固体培养基的组成如下：蛋白胨0.1～1％(w/v)，酵母粉0.05～0.2％(w/v)，人工海水盐0.2～4％(w/v)，琼脂0.8～1.2％(w/v)。

2216E基础培养基的组成如下：蛋白胨0.1～1％(w/v)，酵母粉0.05～0.2％(w/v)，人工海水盐0.2～4％(w/v)。

2216E改良培养基的组成如下：蛋白胨0.1～1％(w/v)，酵母粉0.05～0.2％(w/v)，人工海水盐0.2～4％(w/v)，葡萄糖0.5～2％(w/v)。

实施例1：菌种的培养与鉴定

(1)样品采集：在2012～2013年中国第29次南极科学考察期间从南极普利兹湾及其临近海域(75°28.501'E，28°54.511'S)采集沉积物样品，放置在冰盒中带回实验室。

(2)培养与分离：吸取沉积物样品500μL加入到50mL的2216E基础培养基中，在摇床中以10℃，180rpm/min的条件，培养一周，得到富集的菌液。将菌液按照10¹，10²，10³，10⁴，10⁵的倍数进行梯度稀释，采用平板划线法纯化接种至2216E固体培养基分离培养，重复3～5次，获得南极海洋嗜冷菌单菌落，保种记为LP6-12-2。

(3)菌种鉴定

使用BioTeke细菌基因组提取试剂盒提取步骤(2)南极海洋嗜冷菌单菌落的菌株中的DNA，具体提取方法参照该试剂盒的说明书。

PCR引物采用通用引物：

正向引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，

反向引物1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTTC-3'。

PCR反应条件为：96℃预变性5min；96℃变性20s；62℃退火20s；72℃延伸30s，35个循环，72℃延伸10min，16℃保存。

PCR产物由北京六合华大基因科技有限公司进行测序，其16S rDNA的测序结果如SEQ ID NO.1所示，长度为1407bp。

将该序列在GenBank数据库中进行Blast同源搜索，序列对比分析发现，LP6-12-2与Pseudoalteromonas sp.C70、P.sp.M175、A sp.H29假交替单胞菌属的16S rDNA同源比对的相似度为99.0％。根据16S rDNA序列比对结果，将该菌株鉴定为假交替单胞菌，命名为Pseudoalteromonas sp.LP6-12-2。

实施例2：胞外多糖EPS1-1的制备

利用假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)LP6-12-2制备胞外多糖EPS1-1的方法，包括步骤如下：

(1)种子液的制备：从-80℃超低温冰箱中取出冻存的假交替单胞菌LP6-12-2，按1％接种量接种至100mL的2216E基础培养基中，在10℃，150rpm/min下，培养50h，得到种子液；

(2)发酵液的制备：将步骤(1)所得的种子液按照1％的体积比接种于2216E改良培养基中，在6℃，150rpm/min下培养60h，收集5L发酵液，在8000rpm/min下离心15min，去除菌体，取上清液；

(3)乙醇沉淀：将步骤(2)所得的上清液在60℃下减压浓缩至1L，冷却至25℃，向浓缩液中加入其三倍体积的95％乙醇，4℃过夜，然后在8000rpm/min下离心15min，收集沉淀；

(4)脱除蛋白：向步骤(3)所得的沉淀中加入500mL去离子水，在25℃下搅拌2h至沉淀充分溶解，在12000rpm/min下离心10min，去除沉淀，收集上清液；向上清液中加入100mL的Sevage试剂(V/V氯仿：正丁醇＝5:1)，剧烈震荡并磁力搅拌，重复操作8次，直至无明显蛋白出现，在60℃下减压浓缩至150mL，除去有机试剂，得到胞外多糖溶液；

(5)透析冻干：将步骤(4)所得的胞外多糖溶液装入至2000Da的透析袋中进行透析，每隔8h换去离子水，透析48h，透析后的多糖溶液装入冻干皿中，于-80℃冷冻，之后放入真空冷冻干燥机中干燥，得到胞外粗多糖；

(6)粗品分离：将步骤(5)所得的胞外粗多糖溶解于Tris-HCl缓冲液(pH＝7.8)中，配制成浓度为10mg/mL的多糖溶液，进行DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析，使用0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5M梯度浓度的NaCl溶液由小到大依次进行梯度洗脱，结果如图1A所示，用分布收集器收集0.1M NaCl浓度下的洗脱液，于-80℃冷冻，之后放入真空冷冻干燥机中干燥，得到胞外多糖EPS-1；

(7)纯化：将步骤(6)所得的胞外多糖EPS-1溶解于去离子水中，配制成浓度为10mg/mL的多糖溶液，先后进行Sephadex G-75和Sephadex G-100凝胶柱层析，每次上样1mL，结果如图1B和C所示，收集洗脱液的主成分，于-80℃冷冻，之后放入真空冷冻干燥机中干燥，得到胞外多糖EPS1-1。

本实施例制备的胞外粗多糖产量达到了285mg/L，胞外粗多糖中含有多种多糖，其中胞外多糖EPS1-1质量占比为20％，产量能够达到57mg/L，说明本发明提供的假交替单胞菌LP6-12-2能够稳定高效地生产胞外多糖，增加了胞外多糖生产菌株的来源。

实施例3：假交替单胞菌LP6-12-2胞外多糖EPS1-1的结构表征

本发明对假交替单胞菌LP6-12-2胞外多糖EPS1-1结构的具体表征过程如下：

(1)分子量和纯度测定：利用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)测定胞外多糖EPS1-1的分子量并分析其纯度。

色谱条件，色谱柱：BRT105-104-102串联凝胶柱(8×300mm)；流动相：0.05M NaCl溶液；流速：0.6mL/min，柱温：40℃；进样量：20μL；检测器：示差检测器RI-10A，结果如图1所示。

由图1D可知，本发明制备胞外多糖EPS1-1在HPGPC图谱中呈现单一较对称的峰，样品均一度高，测得其分子量为23.47kDa。

(2)单糖组成测定：利用离子色谱仪测定EPS1-1的单糖组成。

色谱条件，色谱柱：DionexCarbopac^TMPA20(3*150)；流动相：A:H₂O；B:15mMNaOH；C:15mMNaOH&100mM NaOAC；流速：0.3mL/min；进样量：5μL；柱温：30℃；检测器：电化学检测器，结果如图2所示。

由图2可知，本发明制备胞外多糖EPS1-1单糖组成为半乳糖胺(GalN)、葡糖胺(GlcN)、半乳糖(Gal)、葡萄糖(Glc)和甘露糖(Man)，摩尔比为1.2:4.2:4.3:7.2:83.1。

(3)甲基化分析：样品经甲基化、水解、乙酰化后，经GC-MS测定并与标准质谱图库进行比对。

GC-MS条件：RXI-5SIL MS色谱柱30m*0.25mm*0.25μm；程序升温条件为：起始温度120℃，以3℃/min升温至250℃/min；保持5min；进样口温度为250℃，检测器温度为250℃/min，载气为氦气，流速为1mL/min，结果如图3所示。

由图3可知，本发明制备的胞外多糖EPS1-1结构中有11种连接方式。其具体其连接方式及摩尔比如下表1所示。

表1胞外多糖EPS1-1的GC-MS甲基化分析结果

(4)核磁共振图谱分析：称取50mg胞外多糖EPS1-1，将其溶于0.5mL的重水中并冷冻干燥。随后将冻干粉再溶于0.5mL的重水中，并继续冷冻干燥，重复以上过程，以充分交换活泼氢。然后将样品溶于0.5mL的重水中，在室温25℃下置于以600MHz的核磁共振仪测定¹HNMR图谱、¹³C NMR图谱、¹H-¹H COSY图谱、HSQC图谱、HMBC图谱和NOISY图谱，结果如图4所示，碳氢信号归属如表2所示。

表2胞外多糖EPS1-1各单糖的碳氢信号归属

由图4和表2可知，本发明制备胞外多糖EPS1-1的一级结构是由五个D-Manp以α-(1→2)的方式连接而成构成主链，一个α-D-Manp-(1→6)-α-D-Manp-(1→和两个α-D-Manp-(1→作为支链以α-(1→6)的方式分别与主链的3～5号甘露糖基的6位O相连。

实施例4：胞外多糖EPS1-1免疫调节活性的测定

本发明制备的胞外多糖EPS1-1体外细胞水平的免疫调节活性测定具体过程如下：

1、胞外多糖EPS1-1对人正常肝细胞LO2和小鼠单核巨噬细胞RAW264.7的细胞毒性的影响。

将LO2和RAW264.7细胞以5×10⁴个/mL密度，接种100μL在96孔板中。孵育24h后，向LO2细胞培养孔中分别加入胞外多糖EPS1-1使其浓度为0、250、500、750和1000μg/mL，向RAW264.7细胞培养孔中分别加入胞外多糖EPS1-1使其浓度为50、100、200、400、600和800μg/mL，LPS(1μg/mL)作为阳性对照，再孵育24h。使用CCK-8(Cell Counting Kit-8)方法检测LO2和RAW264.7的细胞活性。每个浓度在96孔板中重复6次，胞外多糖EPS1-1对人正常肝细胞LO2和小鼠单核巨噬细胞RAW264.7的细胞的影响如图5A和图5B所示。

由图5A可知，250～1000μg/mL浓度范围内，EPS1-1对LO2细胞的存活和增殖均无显著影响，与对照组相似。这表明，在一定浓度范围内EPS1-1对正常肝细胞没有毒性。由图5B可知，胞外多糖EPS1-1可以在50～800μg/mL之间以剂量依赖性方式刺激巨噬细胞RAW264.7的增殖，细胞增殖率在50g/mL时最低，与对照组相比提高了12.0％，在600μg/mL时最高，与对照组相比提高了32.1％。

2、利用中性红染色法研究胞外多糖EPS1-1对RAW264.7细胞的吞噬活性的影响

将RAW264.7细胞以5×10⁴个/mL密度，接种100μL在96孔板中孵育24h，向RAW264.7细胞培养孔中分别加入胞外多糖EPS1-1使其浓度为50、100、200、400μg/mL，LPS(1μg/mL)作为阳性对照，再孵育24h。去除培养上清液后，用PBS洗涤细胞3次，每孔加入100μL的0.1％中性红溶液(终浓度0.075％，10mM pH7.4 PBS)。培养4h后弃去上清液，用PBS洗涤细胞3次，去除未被吞噬的中性红。然后每孔加入100μL细胞裂解缓冲液(乙醇：冰醋酸＝1:1，v/v)，室温孵育2h，提取被巨噬细胞吞噬的染料。然后在酶标仪上测量540nm处的吸光度。每个浓度在96孔板中重复6次，中性红染色法对RAW264.7细胞的吞噬活性测定结果如图5C所示。

由图5C可知，与对照组比，当胞外多糖EPS1-1浓度为50、100和200μg/mL时处理组的巨噬细胞吞噬能力分别提高了16.0％、20.0％和27.5％，具有显著性差异，这表明胞外多糖EPS1-1具有提高巨噬细胞RAW264.7吞噬能力的作用。

3、酸性磷酸酶活性的检测

将处于对数生长期的RAW264.7细胞从细胞培养瓶中消化下来，制备细胞悬液，调整细胞浓度为5×10⁴个/mL，按每孔100μL将其接种到96孔板中，孵育24h后，向RAW264.7细胞培养孔中分别加入胞外多糖EPS1-1使其浓度为50、100、200、400μg/mL，同时以LPS(1g/mL)作为阳性对照，以RPMI 1640完全培养基作为阴性对照，每孔加入200μL，每组浓度设置6个复孔。培养24h后去除培养液，每孔中加入200μL Western及IP细胞裂解液(无抑制剂)并进行适当的匀浆，随后离心取上清，用于酸性磷酸酶活性的检测，结果如图5D所示。

酸性磷酸酶活性的检测方法：使用96孔板设置空白对照孔，标准孔和样品孔，总体系为80μL，空白孔为检测缓冲液和显色底物各40μL；标准品用量分别为4、8、16、24、32、40μL，用检测缓冲液补齐至80μL；样品孔为样品和显色底物各40μL，样品设置三复孔。用枪头轻轻吹打混匀。37℃下孵育15min后每孔加入160μL反应终止液，在405nm测定吸光度。

酸性磷酸酶活性单位定义：在pH4.8，37℃条件下，以每分钟水解para-nitrophenlphosphate显色底物产生1μmol p-nitrophenol所需的酸性磷酸酶的量定义为一个酶活力单位。据此，计算样品中酸性磷酸酶的活力。

由图5D可知，胞外多糖EPS1-1处理RAW264.7细胞24h后，在50～200μg/mL浓度范围内，能显著提高RAW264.7的酸性磷酸酶活力。当胞外多糖EPS1-1浓度为50μg/mL时，与对照组相比，RAW264.7的酸性磷酸酶活力提高了74.3％。当胞外多糖EPS1-1浓度达到100μg/mL时，其作用效果最佳，RAW264.7酸性磷酸酶活力比对照组的提高了179.7％，比LPS阳性对照组的提高了28.5％。当胞外多糖EPS1-1浓度大于100μg/mL时，胞外多糖EPS1-1的作用效果降低，在200μg/mL时，酸性磷酸酶的活力与对照组相比仍能提高31.8％。这表明，50～200μg/mL的胞外多糖EPS1-1能够提高巨噬细胞酸性磷酸酶的活力。

4、采用ELISA试剂盒测定胞外多糖EPS1-1对巨噬细胞细胞因子释放的影响

将处于指数生长期的RAW264.7细胞(1×10⁵个细胞/孔)接种到6孔板中并培养24h，向RAW264.7细胞培养孔中分别加入胞外多糖EPS1-1使其浓度为50、100、200、400μg/mL，同时以LPS(1μg/mL)作为阳性对照，然后孵育48h。通过在4℃下以3000rpm离心15min收集培养基上清液，并在-20℃下储存。

总NO细胞因子浓度通过Griess方法测定。同时使用NaNO₃标准溶液进行校准。根据ELISA试剂盒中(朗顿，上海朗顿生物技术有限公司)的说明评估上清液中IL-6、IL-10和TNF-α细胞因子的浓度，结果如图6所示。

由图6A可知，在50～400μg/mL浓度范围内，胞外多糖EPS1-1能显著促进RAW264.7细胞NO的分泌，且呈现剂量依赖效应(图6A)。当胞外多糖EPS1-1浓度为50μg/mL时，可显著促进RAW264.7分泌NO，分泌量比对照提高了54.5％；随着胞外多糖EPS1-1浓度的增大，NO分泌量逐渐增加；当胞外多糖EPS1-1浓度达到400μg/mL时，RAW264.7分泌NO的量最高，比对照组提高了101.2％。这表明，50～400μg/mL的胞外多糖EPS1-1具有促进巨噬细胞RAW264.7分泌NO的作用。

胞外多糖EPS1-1处理RAW264.7细胞48h后，在50～400μg/mL浓度范围内可显著促进巨噬细胞分泌TNF-α(图6B)。50μg/mL的胞外多糖EPS1-1就可显著促进RAW264.7分泌TNF-α，与对照组相比，提高了150.0％；随后，随胞外多糖EPS1-1浓度增大TNF-α分泌量也增加，当胞外多糖EPS1-1浓度为200μg/mL时，TNF-α分泌量达到最大，比对照组的提高了181.0％。当胞外多糖EPS1-1浓度为50、100和200μg/mL时，RAW264.7的IL-6分泌量分别比对照组提高了44.6％、79.8％和30.1％，具有显著性差异(图6C)。在50～200μg/mL浓度范围内，胞外多糖EPS1-1能显著促进巨噬细胞RAW264.7分泌细胞因子IL-10；当EPS1-1浓度为50和200μg/mL时，RAW264.7的IL-10分泌量与对照组相比分别提高了166.1％和162.1％，仅略低于阳性对照组(170.7％)的作用效果(图6D)。

综上所述，本发明制备的胞外多糖EPS1-1对体外培养的正常细胞无毒性，能够显著刺激巨噬细胞增殖，促进巨噬细胞吞噬能力提升和细胞因子释放，可作为为新型免疫调节剂开发和应用。

以上所述仅为本发明所用较佳方案的实施例，但本发明的实施方式不受上述实施例限制，凡在本发明原则和精神内所做的任何修改、同等替换和改进，均在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学

<120> 一株高效生产胞外多糖的假交替单胞菌、胞外多糖及其制备方法与应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1407

<212> DNA

<213> 假交替单胞菌Pseudoalteromonas sp.

<400> 1

tgcaagtcga gcggtaacag aaagtagctt gctactttgc tgacgagcgg cggacgggtg 60

agtaatgctt gggaacatgc cttgaggtgg gggacaacag ttggaaacga ctgctaatac 120

cgcataatgt ctacggacca aagggggctt cggctctcgc ctttagattg gcccaagtgg 180

gattagctag ttggtgaggt aatggctcac caaggcgacg atccctagct ggtttgagag 240

gatgatcagc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtggg 300

gaatattgca caatgggcgc aagcctgatg cagccatgcc gcgtgtgtga agaaggcctt 360

cgggttgtaa agcactttca gtcaggagga aaggttagta gttaatacct gctagctgtg 420

acgttactga cagaagaagc accggctaac tccgtgccag cagccgcggt aatacggagg 480

gtgcgagcgt taatcggaat tactgggcgt aaagcgtacg caggcggttt gttaagcgag 540

atgtgaaagc cccgggctca acctgggaac tgcatttcga actggcaaac tagagtgtga 600

tagagggtgg tagaatttca ggtgtagcgg tgaaatgcgt agagatctga aggaataccg 660

atggcgaagg cagccacctg ggtcaacact gacgctcatg tacgaaagcg tggggagcaa 720

acgggattag ataccccggt agtccacgcc gtaaacgatg tctactagaa gctcggagcc 780

tcggttctgt ttttcaaagc taacgcatta agtagaccgc ctggggagta cggccgcaag 840

gttaaaactc aaatgaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc 900

gatgcaacgc gaagaacctt acctacactt gacatacaga gaacttacca gagatggttt 960

ggtgccttcg ggaactctga tacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg tgttgtgaga1020

tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccctatcctt agttgctagc aggtaatgct1080

gagaactcta aggagactgc cggtgataaa ccggaggaag gtggggacga cgtcaagtca1140

tcatggccct tacgtgtagg gctacacacg tgctacaatg gcgcatacag agtgctgcga1200

actcgcgaga gtaagcgaat cacttaaagt gcgtcgtagt ccggattgga gtctgcaact1260

cgactccatg aagtcggaat cgctagtaat cgcgtatcag aatgacgcgg tgaatacgtt1320

cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac catgggagtg ggttgctcca gaagtagata1380

gtctaaccct cgggaggacg ttaccac 1407

Claims

1.一株高效生产胞外多糖的假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp.）LP6-12-2，于2021年12月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.24106。

2.利用权利要求1所述的假交替单胞菌LP6-12-2制备胞外多糖的方法，其特征在于，包括步骤如下：

（1）种子液的制备：将假交替单胞菌LP6-12-2按0.5~1.5%的接种量接种至2216E基础培养基中，在4~15℃，140~160 rpm/min下培养46~50h，得到种子液；

所述2216E基础培养基的组成如下：蛋白胨0.1~1%（w/v），酵母粉0.05~0.2%（w/v），人工海水盐0.2~4%（w/v）；

（2）发酵液的制备：将步骤（1）所得的种子液按照0.5~1.5%的体积比接种于2216E改良培养基中，在4~15℃，140~160 rpm/min下培养55~65h，收集发酵液，在7500~8500rpm/min下离心12~18min，去除菌体，取上清液；

所述2216E改良培养基的组成如下：蛋白胨0.1~1%（w/v），酵母粉0.05~0.2%（w/v），人工海水盐0.2~4%（w/v），葡萄糖0.5~2%（w/v）；

（3）乙醇沉淀：将步骤（2）所得的上清液在55~65℃下减压浓缩至发酵液体积的20~25%，冷却至20~25℃，向浓缩液中加入其三倍体积的95~100%乙醇，4℃过夜，然后在7500~8500rpm/min下离心12~18min，收集沉淀；

（4）脱除蛋白：向步骤（3）所得的沉淀中加入去离子水，在20~25℃下搅拌溶解沉淀，在11000~13000rpm/min下离心8~12min，去除沉淀，收集上清液；向上清液中加入Sevage试剂，剧烈震荡并磁力搅拌，静置后回收有机试剂，除去蛋白质，重复操作6~10次，在55~65℃下减压浓缩，除去有机试剂，得到胞外多糖溶液；

所述Sevage试剂为氯仿：正丁醇=5:1的混合溶液，加入量为上清液体积的18~22%；

（5）透析冻干：将步骤（4）所得的胞外多糖溶液装入透析袋中进行透析，每隔8h换去离子水，透析48h，然后经过真空冷冻干燥，得到胞外粗多糖；

（6）粗品分离：将步骤（5）所得的胞外粗多糖溶解于Tris-HCl缓冲液中，配制成浓度为8~10mg/mL的多糖溶液，进行DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析，使用0~0.5M梯度浓度的NaCl溶液由小到大依次进行梯度洗脱，收集0.1M NaCl 浓度下的洗脱液，经过真空冷冻干燥，得到胞外多糖EPS-1；

（7）纯化：将步骤（6）所得的胞外多糖EPS-1溶解于去离子水中，配制成浓度为8~12mg/mL的多糖溶液，先后进行Sephadex G-75和Sephadex G-100凝胶柱层析，收集洗脱液的主成分，经过真空冷冻干燥，得到胞外多糖EPS1-1。

3.权利要求2所述方法制备的胞外多糖EPS1-1，其特征在于，所述胞外多糖EPS1-1为半乳糖胺、葡糖胺、半乳糖、葡萄糖和甘露糖组成的杂多糖，摩尔比为，半乳糖胺：葡糖胺：半乳糖：葡萄糖：甘露糖=1.2:4.2:4.3:7.2:83.1，分子量为23.47kDa，多糖含量大于95%；所述胞外多糖EPS1-1为α吡喃多糖，其一级结构是由五个D-Manp以α-(1→2)的方式连接而成构成主链，一个α-D-Manp-(1→6)-α-D-Manp-(1→和两个α-D-Manp-(1→作为支链以α-(1→6)的方式分别与主链的3~5号甘露糖基的6位O相连。