CN110616150B - 一株高产多糖华泽兰内生真菌及其应用 - Google Patents

一株高产多糖华泽兰内生真菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株高产微生物多糖的华泽兰内生真菌及其应用。分类命名为贵州小帽壳孢ZJSRU‑M1(Pilidiella guizhouensis ZJSRU‑M1)，该菌株已于2018年12月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2018894，保藏地址：湖北省武汉市武昌区武汉大学。本发明中的华泽兰内生真菌贵州小帽壳孢ZJSRU‑M1，能液体发酵生产多糖，因此可采用本发明的贵州小帽壳孢ZJSRU‑M1生产多糖，为多糖的生产提供新的方法。本发明制备的贵州小帽壳孢多糖分子量大，色素少，多糖含量大于80％。且本发明的多糖制备方法简便、快速、高效、成本低，适用于多糖的大规模生产。并且本发明制备的多糖具有较好的抗氧化活性，对DPPH清除率、超氧阴离子清除率和·OH清除率的效果均比较好，可开发为天然的抗氧化剂。

Description

一株高产多糖华泽兰内生真菌及其应用
技术领域
本发明属微生物属微生物学领域，具体涉及一株高产微生物多糖的华泽兰内生真菌及其应用。
背景技术
多糖是存在于自然界的醛糖、酮糖的聚合物，为一切有机体生命不可 缺少的重要组成部分。多糖类化合物具有提高人体免疫功能、抗肿瘤、抗 辐射以及抗氧化等诸多生物活性，已受到广泛关注。自然界还有非常丰富 的多糖资源亟待研究和开发。
微生物多糖具有生产条件可控、种类繁多、产量高等特点，其发展前 景广阔，具有较强的市场竞争力。微生物来源的多糖已作为胶凝剂、成膜 剂、保鲜剂、乳化剂等广泛应用于食品、制药、石油、化工等多个领域。 近几年，随着对微生物多糖研究的深入，世界上微生物多糖的产量和年增 长量迅速，已规模生产的微生物胞外多糖有黄原胶(Xanthan gum)、结冷胶 (Gellangum)、小核菌葡聚糖(Scleeroglucan)、短梗霉多糖(Pullulan)、热凝多 糖(Curdlan)等。
从药用植物内生真菌中寻找活性成分已成为研究的热点。从植物内生 菌中获得丰富多样和具有生物学活性的代谢产物，突破药用植物生长周期 长、产量低、不可再生等限制。
华泽兰(Eupatorium chinense L.)为菊科泽兰属植物，为一年生或多年生 草本植物，在我国，主要分布于东南部至西南部各省。传统药理研究表明， 华泽兰具有清热解毒、凉血利咽、抗炎镇痛等功效。目前，对华泽兰内生 真菌的研究报道较少，没有华泽兰内生真菌以及小帽壳孢属Pilidiella sp产 多糖的研究报道。且目前真菌多糖的提取主要通过水提醇沉、离子交换层 析、凝胶过滤层析等方法，不仅步骤繁琐、操作过程复杂，而且多糖的得 率低，不利于大规模生产应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种华泽兰内生真菌菌株，该菌株属于贵州小 帽壳孢ZJSRU-M1(Pilidiella guizhouensis ZJSRU-M1)，是采用内生菌分离 纯化技术从华泽兰(Eupatorium chinense L.)健康植物活体中分离、纯化得 到。
本发明的目的还在于提供一种华泽兰内生真菌菌株所产生的胞外多 糖，该胞外多糖具有抗氧化作用。
本发明的目的还在于提供了华泽兰内生真菌ZJSRU-M1液体发酵生产 多糖的方法。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：一种华泽兰内 生真菌菌株，分类命名为贵州小帽壳孢ZJSRU-M1(Pilidiella guizhouensis ZJSRU-M1)，该菌株已于2018年12月13日保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为CCTCC NO：M 2018894，保藏地址：湖北省武汉市武昌区武汉 大学保藏中心(武汉大学第一附属小学对面)，邮编：430072。
本发明所述的华泽兰内生真菌ZJSRU-M1，它为贵州小帽壳孢Pilidiellaguizhouensis，隶属于子囊菌门Ascomycota、粪壳菌纲Sordariomycetes、间座 壳目Diaporthales、裂圆盾菌科Schizoparmaceae。
发明所述的华泽兰内生真菌ZJSRU-M1，它为贵州小帽壳孢Pilidiellaguizhouensis，在马铃薯固体培养基上28℃培养，ZJSRU-M1菌落生长较快， 培养3-4d，菌落直径为8.0-9cm，花瓣轮纹状，菌丝白色、稀疏。7d后菌落 逐渐变为棕色，产生黑色孢子器。显微镜下观察，菌丝发达，分生孢子光 滑，透明，梭形至长椭圆形。
本发明通过提取所述的华泽兰内生真菌ZJSRU-M1的总DNA，以通用 引物ITS1和ITS4为引物，成功扩增了它的ITS区序列，所扩增的序列大小约 为550bp。将它们交由上海生工生物工程有限公司测序。将ITS序列提交 Genebank，本发明菌株ZJSRU-M1序列与Pilidiella guizhouensis序列同源性 为99％。结合形态学观察与系统进化树分析，该菌鉴定为Pilidiella guizhouensis。
本发明内容还包括上述的华泽兰内生真菌ZJSRU-M1在液体发酵生产 多糖方面的应用。
其中，上述液体发酵培养基具体配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，水 1000mL。
本发明内容还包括一种采用华泽兰内生真菌ZJSRU-M1液体发酵生产 多糖的方法，将上述的华泽兰内生真菌ZJSRU-M1接种到固体培养基上活 化，然后接种到液体发酵培养基上培养7-14天。
其中，上述固体培养基为马铃薯固体培养基，上述液体培养基具体配 方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000mL。发酵条件为：温度20-30℃， 转速100-180r/min。
其中，上述最佳的发酵条件为：28℃，150r/min条件下震荡培养7天。
其中，通过sevag法对发酵液脱蛋白，然后在发酵液中加入95％乙醇 使含醇量达到20％以沉淀发酵产物，发酵产物经无水乙醇、丙酮和乙醚洗 涤后冷冻干燥，经红外光谱分析比对确定发酵产物为多糖。
有益效果：与现有技术相比，本发明的优点是：本发明中的华泽兰内 生真菌贵州小帽壳孢ZJSRU-M1，能液体发酵生产多糖，因此可采用本发 明的贵州小帽壳孢ZJSRU-M1生产多糖，为多糖的生产提供新的方法。本 发明制备的贵州小帽壳孢多糖分子量大，色素少，多糖含量大于80％。且 本发明的多糖制备方法简便、快速、高效、成本低，适用于多糖的大规模 生产。并且本发明制备的多糖具有较好的抗氧化活性，对DPPH清除率、 超氧阴离子清除率和·OH清除率的效果均比较好，可开发为天然的抗氧化 剂。
附图说明
图1为华泽兰内生真菌贵州小帽壳孢ZJSRU-M1发酵产物的红外光谱 图
图2为华泽兰内生真菌贵州小帽壳孢ZJSRU-M1的菌落形态图和显微 形态图(a-b：菌落形态(a：正面，b：反面)；c：菌丝；d：分生孢子)
图3为总DNA经通用引物ITS1/ITS4PCR扩增后凝胶电泳图(M： Marker；泳道L1：目的条带)；
图4为内生真菌ZJSRU-M1菌株基于ITS序列的系统发育树(采用邻 接法构建)
图5(A)、5(B)、5(C)为内生真菌ZJSRU-M1胞外多糖的抗氧化试验结 果。(A：DPPH清除率；B：超氧阴离子清除率；C：·OH清除率)
具体实施方式
实施例1：华泽兰内生真菌贵州小帽壳孢ZJSRU-M1的分离
本实施例中华泽兰内生真菌贵州小帽壳孢ZJSRU-M1，分离自健康的 华泽兰叶片。实验材料于2017年10月采自杭州西山国家森林公园。分离 按如下步骤进行：
取健康的野生华泽兰叶片，用蒸馏水冲洗干净。用75％酒精表面消毒 1min，无菌水清洗3次，转入到3％的次氯酸钠溶液中表面消毒2min，用 无菌水冲洗4次。在无菌条件下将桑叶撕成小片，接入PDA平板上，于 25℃培养箱中培养3-7d。将最后一次清洗样品所用无菌水涂布于PDA平 板上作为对照，同样条件下培养、观察，以确保表面消毒彻底。每日定时观察内生真菌长出情况，将切口处新长出的菌丝挑取尖端部分转接至培养 基上，纯化培养直至获得纯菌株。
马铃薯(PDA)固体培养基：称取200g去皮马铃薯小块，加入500mL水， 煮沸30min后，用4层纱布过滤。滤液中加入20g葡萄糖和20g琼脂，加 热溶解后补水至1000mL，pH自然(pH7左右)。121℃高压蒸汽灭菌20min。
实施例2：华泽兰内生真菌贵州小帽壳孢ZJSRU-M1发酵液的制备
将本发明贵州小帽壳孢ZJSRU-M1菌株接种至马铃薯固体培养基平板 上，28℃培养4d以活化菌株。取1块直径5mm菌块接种入含150mL液体 发酵培养基的三角瓶(500mL)中，28℃、150r/min条件下震荡发酵培养10d。 四层纱布过滤，滤液即为贵州小帽壳孢ZJSRU-M1发酵液。发酵液呈粘稠 胶状。
液体发酵培养基配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000mL。
实施例3：贵州小帽壳孢ZJSRU-M1发酵产物的鉴定
在上述实施例2制得的发酵液通过sevag法对发酵液脱蛋白后，加入 95％乙醇至20％，缓慢搅拌，静止30min后滤去发酵液获得絮状发酵产物。 发酵产物经无水乙醇、丙酮和乙醚洗涤后冷冻干燥。取2mg干燥后的发酵 产物与200mg烘干的KBr(溴化钾)置于玛瑙研钵中研磨均匀，模具中压成 透明薄片，在傅里叶红外光谱仪上测定产物的红外光谱图。
请参阅图1为本发明贵州小帽壳孢ZJSRU-M1发酵产物的红外光谱图， 所述贵州小帽壳孢ZJSRU-M1发酵产物与多糖的红外光谱图基本一致。确 定本发明贵州小帽壳孢ZJSRU-M1发酵产物为多糖。获取的多糖产量为 1.67g/L。
多糖含量测定：采用苯酚-硫酸法
经测定制备的贵州小帽壳孢ZJSRU-M1多糖含量为83.1％；
多糖分子量及均一性测定：采用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)
经测定制备的贵州小帽壳孢ZJSRU-M1多糖为均一多糖，分子量为 13.4kDa；
多糖单糖组成测定：采用多糖水解及乙酰化后经GC-MS分析
经测定制备的贵州小帽壳孢ZJSRU-M1多糖的单糖组成为葡萄糖和甘 露糖。
实施例4：小帽壳孢属ZJSRU-M1菌株的鉴定
分离并纯化得到的内生真菌ZJSRU-M1。
1、菌株平板形态观察
将本发明菌株接种在土豆固体培养基平板上，于28℃培养箱内培养， 观察菌落的形态。
请参阅图2中本发明内生真菌ZJSRU-M1的菌落形态图，所述内生真 菌ZJSRU-M1的菌落形态为：菌落边缘不规则，呈花瓣轮纹状，菌丝短， 初期白色，10d后菌落逐渐变为浅棕色，产生黑色孢子器。
2、菌株显微形态观察
用插片法观察本发明菌株ZJSRU-Ml的显微形态。
请参阅图2中本发明内生真菌ZJSRU-M1的显微形态图，所述内生真菌 ZJSRU-M1的显微形态(10×40高倍显微镜)为：菌丝无色透明，分枝。分生 孢子器球形或近球形，光滑，黑色。分生孢子光滑，透明，梭形至长椭圆 形。
3、菌株的分子生物学鉴定
(1)DNA的提取
收集液体培养基发酵7天的菌丝体。将菌丝体用液氮研磨后，用真菌 基因组DNA提取试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)提取总DNA。
(2)ITS区序列的PCR扩增
引物序列为：ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3′)和 ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。
PCR反应条件为：94℃预热5min，94℃变性1min，55℃退火40s，72℃ 延伸50s，共30个循环；72℃延伸10min。PCR扩增产物由生工生物工程(上 海)股份有限公司完成测序。
本发明所述内生真菌总DNA经通用引物ITS1/ITS4PCR扩增后凝胶电 泳图如图3所示。
(3)数据处理
序列数据在NCBI的Genbank中进行同源序列搜索比对，分析其同源 性。结果显示：本发明菌株ZJSRU-M1序列与Pilidiella guizhouensis.的同 源性达到99％以上。采用Meta 5.0软件构建菌株ZJSRU-M1的系统发育 进化树(图4)。
综合形态学分类鉴定结果和分子生物学分类鉴定结果，最终鉴定该菌 株为贵州小帽壳孢Pilidiella guizhouensis.
实施例5：贵州小帽壳孢ZJSRU-M1菌株多糖的抗氧化活性
(1)DPPH·清除率的测定，结果如图5(A)所示：
不同浓度的多糖样品各1mL，加入等量浓度为0.2mmol/L的DPPH溶 液，摇匀之后避光常温下放置0.5h。波长517nm下测定其吸光度A，计算清 除率，以Vc为阳性对照。
(2)·OH自由基清除率的测定，结果如图5(B)所示：
取多糖样品1mL，加入2mL1.8mmol/L的FeSO4溶液和1.5mL 1.8mmol/L的水杨酸溶液，再加入0.1mL含量为0.3％的双氧水，充分混合摇 匀。在37℃的下水浴保温30min，在510nm下测吸光度A，以蒸馏水代替多 糖样品作为对照，以Vc为阳性为对照计算自由基的清除率。
(3)超氧阴离子自由基清除率的测定，结果如图5(C)所示：
取2mL pH8.2的三羟甲基氨基甲烷(Tris)-盐酸缓冲液，在水浴锅中保 温(25℃)20min。加入1mL的多糖样品和0.5mL50mmol/L的邻苯三酚充 分混合，放入水浴锅中保温水浴(25℃)5min，最后加入1mL8mmol/L的 盐酸终止反应。在325nm处测量吸光度A。以Vc为阳性对照，计算清除率。 实施结果：多糖样品则是随着多糖浓度的增大，对DPPH自由基的清除效果 也就逐渐增强。当多糖浓度为1mg/mL时，清除率达到59.6％；多糖样品对 于羟基自由基同样具有一定的清除效果，当浓度为1mg/mL时，清除率为 84.4％；当多糖样品浓度为1mg/mL时，其对超氧阴离子的清除率为66.5％。 说明贵州小帽壳孢ZJSRU-M1菌株多糖具有自由基清除能力，可开发为天然 抗氧化剂。

Claims (6)

1.华泽兰内生真菌，其特征在于，华泽兰内生真菌ZJSRU-M1，其分类命名为贵州小帽壳孢 (Pilidiellaguizhouensis)，该菌株已于2018年12月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2018894。
2.权利要求1所述的华泽兰内生真菌在生产胞外多糖方面的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述华泽兰内生真菌通过液体发酵生产制备多糖。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述液体发酵培养基组成为：马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000mL。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将华泽兰内生真菌接种到马铃薯固体培养基上活化，然后接种到马铃薯液体培养基发酵培养5～10天即得。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述发酵条件为：温度20-30℃，转速100-180r/min。
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